一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法

摘要

一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，属于生物工程技术领域。其包括以下工艺步骤：收集茶尺蠖触角总RNA；通过RT-PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长；构建茶尺蠖气味结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为13～45μmol/L的茶树叶片的挥发物确定为茶尺蠖的植物源引诱剂。本发明为茶尺蠖植物源气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法。

背景技术

茶尺蠖Ectropis obliqua Prout，属鳞翅目，尺蛾科，是一种广泛分布于长江流域各产茶省的重大茶树害虫，由于其喜食茶树叶片，且发生代数多，繁殖快，严重发生时叶片全部被吃光，造成茶业减产甚至绝收。长期以来，控制茶尺蠖主要依赖化学农药防治，极易引起商品茶叶中的农药残留问题，严重威胁我国茶叶贸易产业的正常发展，鉴于此，有必要在化学农药之外开发新型的无公害的茶尺蠖生物防治技术。其中，利用其嗅觉行为而设计其引诱剂成为目前茶尺蠖综合治理的一种重要手段，而以通过化学仪器分析手段来鉴定茶尺蠖对茶树叶片挥发物为主要的代表的技术，由于茶树叶片挥发物成分非常复杂，所以该方法很难有效地设计和开发出适合茶尺蠖的嗅觉引诱剂配方。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法的技术方案。

所述的一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）收集茶尺蠖触角总RNA；

2）通过RT-PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长；

3）构建茶尺蠖气味结合蛋白的原核表达载体；

4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为13～45μmol/L的茶树叶片的挥发物确定为茶尺蠖的植物源引诱剂。

所述的一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，其特征在于所述的步骤4）中IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为1mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为4h。

所述的一种基于茶尺蠖气味结合蛋白的植物源引诱剂的筛选方法，其特征在于所述的步骤5）中竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱的步骤如下：

1）荧光配基1-NPN与茶尺蠖重组气味结合蛋白的结合

在282nm激发波长下，向1.5μmol/L的茶尺蠖重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；

2）配基结合

选取茶树叶片气味挥发物和1-NPN进行竞争结合茶尺蠖重组气味结合蛋白，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为13～45μmol/L的茶树叶片的挥发物确定为茶尺蠖的植物源引诱剂。

本发明从茶尺蠖嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其气味结合蛋白全长基因，并通过原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学结合技术探讨了其与不同茶树来源的植物源挥发物的亲和力。本发明为茶尺蠖植物源气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

附图说明

图1为茶尺蠖EoblGOBP2基因的克隆；

图2为重组茶尺蠖气味结合蛋白EoblGOBP2诱导表达时间的优化；

图3为重组茶尺蠖气味结合蛋白EoblGOBP2的分离纯化；

图4为候选气味信息与荧光配基1-NPN 和重组EoblGOBP2蛋白的竞争结合；

图5为候选气味引诱剂对茶尺蠖的触角反应电位。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1

1）收集茶尺蠖触角总RNA的具体步骤；

材料：茶尺蠖为杭州茶园捕捉幼虫，在实验室人工饲养至成虫后供实验用。幼虫饲养条件为：温度26±1℃，L:D=12:12，RH为70%～80%。利用TRIzol法提取茶尺蠖成虫触角的总RNA，并利用Super-Script?Ⅱ Reverse Transcriptase System (Takara)反转录获得cDNA第一链。

2）通过RT-PCR获得茶尺蠖气味结合蛋白的全长的具体步骤；

①茶尺蠖EoblGOBP2的引物设计。根据Genbank中茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP2 (EoblGOBP2)的基因序列(Genbank登录号为：ACN29681.1（12），利用Primer Premier 5.0软件设计引物。为了后期表达时方便将目的基因克隆到表达载体上，在正反向引物上设计EcoR I和Hind Ⅲ的酶切位点（以下划线表示）。

上游引物：5’-GTGAATTCATGAAGTCTGTTCTGGTGGCGACGGT-3’；

下游引物：5’-GGCAAGCTTGCTAATACTTCTCCATGACAGCTTC-3’。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

②茶尺蠖GOBP2 cDNA的扩增、克隆和测序。以反转录酶合成cDNA第一链为模板，用引物对其进行PCR扩增。经过对PCR条件进行优化，最终确定6个基因的PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，62.1℃ 30 s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10 min。

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于PMD 18-T vector载体内，鉴定后送至上海桑尼生物技术有限公司进行测序，从而获得目的基因序列，如图1所示。

3）构建茶尺蠖气味结合蛋白的原核表达载体的具体步骤；

用试剂盒提取克隆质粒，经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化目的片段。然后将目的片段与经过相同酶切处理的线形pET-32a载体进行连接， 按照常用方法转化宿主菌Trans 5α后，挑取单菌落、提质粒并进行酶切鉴定。

4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化的具体步骤；

①重组茶尺蠖GOBP2蛋白的原核表达

将构建好的pET32a/GOBP2质粒转化进BL21(DE3)感受态细胞，经平板涂布，挑取获得的单克隆菌落接种于1 mL LB培养基(含Amp 100 μg/mL) 中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜。活化后按1% (V/V)接种量转接20 mL LB培养基(含Amp 100 μg /mL)，37℃ 220 rpm振荡培养至OD600至0.6左右，取1 mL菌液作阴性对照，再向原菌液加入IPTG 至终浓度为1 mmol /L，30℃ 200 rpm 继续诱导，每隔1h取1 mL菌液，共5h，最后用SDS-PAGE 电泳检测不同表达时间的诱导表达效果，并确定最佳诱导时间为4 h，如图2所示。

②重组茶尺蠖GOBP2蛋白的分离纯化

将400mL诱导好的EoblGOBP2大肠杆菌菌液，8000rpm离心10min，弃上清，将菌体收集到50mL离心管中，加入10 mL裂解缓冲液和100 μL溶菌酶，充分悬浮后4℃裂解过夜，次日5s/5s间断超声10min后，4℃ 12000 rpm离心10min，弃上清，沉淀加入细菌裂解液，室温裂解1h后4℃ 12000 rpm离心10min，取上清至平衡好的镍NTA琼脂糖凝胶柱，并依次用不同咪唑浓度的溶液进行梯度洗脱，共计七次，收集7管洗脱液后，每管各取10ul进行SDS-PAGE分析，检测目的蛋白的纯度及所在收集管的位置，如图3所示。

将确定含有纯EoblGOBP2重组蛋白的洗脱液全部转移于透析袋中，在500mL含浓度低减尿素的PBS缓冲液(pH7.4)中，尿素初始浓度为7mol/L，于4℃透析72h，期间每8小时更换一次新鲜的PBS缓冲液。然后将透析好的融合蛋白用Bradford法测定浓度后，转移至1.5 mL Eppendorf管内，保存于-80℃冰箱备用。

5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组气味结合蛋白与茶树叶片气味挥发物的结合反应谱，筛选得到适合茶尺蠖的植物源引诱剂的具体步骤。

用甲醇将1-NPN荧光配基配成1 mmol/L并置于4℃避光保存，移取1.5μmol/L的EoblGOBP2于石英比色皿中，逐次加入1mmol/L的1-NPN溶液进行荧光扫描，每次加入后反应2min，在282波长下激发，记录荧光发射光谱，及最大发射波长328 nm处的荧光强度根据Scatchard方程(1)线性化光谱数据：

 (1)

其中[Dt]和[D]分别表示总的和体系中游离的1-NPN浓度，[Pt]为EoblGOBP2重组蛋白的浓度，K为1-NPN与EoblGOBP2的结合常数，n为结合位点数。可得到1-NPN与EoblGOBP2的解离常数。

然后利用竞争结合实验来研究候选配基与茶尺蠖EoblGOBP2重组蛋白的解离常数。在竞争结合试验中，使用1-NPN作为荧光报告子，将不同配基与1μmol/l重组气味结合蛋白进行混合。将化学配基溶于甲醇溶液中，配制成浓度为10mmol/L试样。将化学配基逐次加入到1-NPN与EoblGOBP2蛋白混合液中，每次加入后反应时间2min，记录荧光的发射光谱。根据方程(2)计算候选配基解离常数KD：

   (2)

其中[IC₅₀]为竞争配基能替换50%的1-NPN时的浓度，[1-NPN]为未结合1-NPN的浓度，K_1-NPN为GOBP2与1-NPN的解离常数。

选取不同茶树叶片气味挥发物进行竞争性荧光结合试验，发现占茶树挥发物含量较高的水杨酸甲酯、反-2-己烯醛、反-2-癸烯醛、苯甲醛、β-紫罗兰酮和邻苯二甲酸二丁酯均能和茶尺蠖EoblGOBP2产生结合反应，具体结果如下表和图4所示：

表1  候选配基与1-NPN和重组EoblGOBP2蛋白的竞争结合

实施例2

证明通过本发明得到的植物源引诱剂的有效性试验。

1）供试昆虫。茶尺蠖的老熟幼虫采自为本实验室内人工饲养的种群。饲养条件为：温度（26±1）℃，相对湿度（75±5）%，光周期L: D = 12: 12（光12 h，暗12 h）。待其化蛹、羽化后收集性成熟时期的成虫进行实验，实验前饥饿3 h。

2）实验仪器和试剂。实验仪器采用触角电位仪（荷兰Syntech公司）；各种茶树叶片挥发物标准品均购自百灵威，分别将每种化合物溶于液体石蜡，并配成0.1（v/v）溶液进行EAG测定。预先在滤纸条上（2 cm×0.5 cm）滴加10 uL待测样品溶液，使溶剂挥发一会后，再将滤纸塞进巴斯德管内，用锡箔纸把管口两端封住，防止样品挥发。另取10 uL液体石蜡+滤纸作为空白对照。

3）实验方法。首先用手术刀将茶尺蠖触角从基部切下，然后小心地将茶尺蠖触角的两端用导电胶分别黏在EAG的金属电极上。测试时将巴斯德管一端插入送气管外侧直径为2 mm 的小孔内，送气管管口与触角纵向垂直，并与触角相距1 cm左右。踩脚踏板以刺激时间0.2 s，刺激气流为100 mL/min，两次刺激之间使触角恢复2 min。在测定样品前先进行1次对照CK（液体石蜡）和标准参照刺激，然后测试样品，每个待测样品重复6次。EAG反应值参照下列公式计算： 

公式中Sr为茶尺蠖对此种化合物EAG反应的相对值，Sc为此种化合物的EAG反应值，CKm为测定此种化合物前后的对照液体石蜡两次EAG反应的平均值，Rm为测定此种化合物前的标准参照EAG反应的平均值。

4）数据处理与分析

    利用SPSS 16.0软件对所获得的实验数据进行处理和分析。结果显示茶尺蠖触角对于茶树挥发物的反应大小依次为：反-2-己烯醛 > 苯甲醛 > 苯乙酮 > 水杨酸甲酯，而上述挥发物与茶尺蠖EoblGOBP2蛋白的解离常数为13～45μmol/L，故确定解离常数在此范围内的的茶树叶片的挥发物为茶尺蠖的植物源引诱剂成分，如图5所示。