根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法

摘要

本发明涉及一种根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法。一种根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法，其主要特点在于包括有如下步骤：幼苗培育：将党参种子进行发芽，待种子发芽后，移栽至装有蛭石的穴盘中，浇灌1/2Hoagland营养液，在温室中进行培养；温室的昼夜温度为26-30℃，光照12-14h/d，光强度为800-1000μmol/m2·s，相对湿度60～80%。植物根际有益微生物通过促进植物对营养物质的吸收和减轻植物病害，从而改善植物生长的条件，促进党参根系发育和生长，继而改变其体内的一些代谢物质的含量。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，同时可调控植物代谢产物的积累。

说明书

技术领域

本发明属于微生物学和植物生理学领域，涉及利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌GB03调控党参根系发育生长，调控活性成分及代谢产物积累，从而使党参产量提高以及品质得到改善的方法。 

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，它能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育，增加植物对盐胁迫等逆境的抵御能力，从而提高植物的抗病性。 

近年来，党参在治疗冠心病、高血脂症、低血压病等面取得了新的进展，使其用量速增(马雪梅和吴朝峰2009)，但因党参种子小，寿命短，直播育苗时发芽率低，栽培时播种量大，成本高，达不到生产要求。据调查，国内每年党参的需求量远远超过生产，从党参作为商品在市场上交易以来，党参的生产和销售就经常出现大起大落的现象，价格波动也很大。目前，全国党参野生资源蕴藏量约为1.58万吨，但是资源分散、产量呈现逐年下降的趋势，所能提供的商品数量极其有限，党参市场供求矛盾极为突出(刘德军等2001)。从中药党参资源调查结果表明，目前市场上的党参主产于山西、甘肃、陕西、四川和湖北等省，主要为栽培品，少量为野生，甘肃除了原产地外，近几十年大面积发展党参种植，同时扩大了素花党参的生产规模，成 为中药党参最大的产区(张向东等2013)。 

目前，随着中药现代化的实施以及中国在世界经济中的地位越来越高，中药材的生产和出口均稳步的增长，据估计2007年我国党参的出口已经超过了0.3万吨，作为中药制药原料，党参的用量也显著增长。近年来，党参的市场价格多次抬升，而且由于全国党参总产量明显下降，使其价格大幅度上调。党参药材供不应求已经成为中药生产中的一大难题，因此，改善党参生产土壤质量，调控活性成分及代谢产物积累，提高党参质量已经成为中药材种植业的首选，也是党参生产中亟待解决的问题。 

发明内容

本发明目的是提供一种调控党参产量和代谢产物积累的方法。利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌菌株GB03调控党参代谢产物的积累，该方法操作简单，成本低，高效，无毒并对环境友好无害。 

本发明目的是通过以下技术方案实现：一种调控党参产量和代谢产物积累的方法，其主要特点在于包括有如下步骤： 

（1）幼苗培育：将党参种子，进行发芽，待种子发芽后，移栽至装有蛭石的穴盘中，浇灌1/2Hoagland营养液，在温室中进行培养；温室的昼夜温度为26-30℃，光照12-14h/d，光强度为800-1000μmol/m2·s，相对湿度60-80%。 

所述的根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法，还包括有如下步骤： 

（2）幼苗移栽：待幼苗生长28-32天，移栽至直径18-22cm深度为28-30cm的塑料花盆中，花盆的基质为草炭土与农家土1:1混匀，在158-162度高温烘箱烘3d，之后装盆、称重、控制浇水量为田 间最大持水量的60%； 

（3）菌液制备：配制LB液体培养基：按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，调pH到6.8-7.2，在温度为121-126℃灭菌待冷却后，每100mL的LB液体培养基加入50-100μL的GB03菌液，在转速为180r/min下，温度为25-28℃的恒温培养摇床上培养过夜后，使用核酸蛋白检测仪（NanoDrop1000,德国）测定菌液浓度为OD600=0.8-1.0时取出备用。 

所述的根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法，还包括有如下步骤： 

（4）幼苗处理：移栽两周后加菌液，以后每隔一个月加菌一次，用移液枪吸取0.5-1mL的枯草芽孢杆菌GB03，均匀的施加在每株幼苗茎基部周围的土壤上。 

（5）指标测定：一个生长季结束后测定植株生物量、中氨基酸含量和党参炔苷。 

本发明的有益效果： 

植物根际有益微生物通过促进植物对营养物质的吸收和减轻植物病害，从而改善植物生长的条件，继而改变植物体内的一些代谢物质的含量。同时，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，同时可调控植物代谢产物的积累。党参含有丰富的萜类、苷类、氨基酸和多糖等成分。党参炔苷含量丰富，具有抗癌、抗菌、抗炎、镇静、降压、抗胃酸分泌等功效。除此以外，党参含有人体所必需的7种氨基酸，使其具有更多的用途。本发明通过调控党参生长，提高产量，增强代谢产物的积累，使其体内有益成分大量积累，更具有使用价值。本发明处理 方法简单，可广泛应用，具有重要的社会、经济和生态经济价值。 

附图说明

图1：枯草芽孢杆菌GB03对党参根部干重（产量）的影响；图中四个柱子分别表示枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液、大肠杆菌DH5α菌液、LB液体培养基和水处理党参幼苗后的党参根干重（产量）。 

图2：枯草芽孢杆菌GB03对党参根部总氨基酸的影响；图中四个柱子分别表示枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液、大肠杆菌DH5α菌液、LB液体培养基和水处理党参幼苗后的党参根部总氨基酸含量。 

图3：枯草芽孢杆菌GB03对党参根部7种必需氨基酸总含量的影响；图中四个柱子分别表示枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液、大肠杆菌DH5α菌液、LB液体培养基和水处理党参幼苗后的党参根部7种必需氨基酸总含量。 

图4：党参炔苷测定图谱；图中四个柱子分别表示枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液、大肠杆菌DH5α菌液、LB液体培养基和水处理党参幼苗后的党参根部炔苷含量高效液相色谱测定图谱。 

图5：枯草芽孢杆菌GB03对党参根部炔苷的影响；图中四个柱子分别表示枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液、大肠杆菌DH5α菌液、LB液体培养基和水处理党参幼苗后的党参根部炔苷含量。 

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。 

实施例1：幼苗培育 

将党参种子，进行发芽，待种子发芽后，移栽至装有蛭石的穴盘中，浇灌1/2Hoagland营养液，在温室中进行培养；温室的昼夜温度为26-30℃，光照12-14h/d，光强度为800-1000μmol/m2·s，相对湿度60-80%。 

实施例2：幼苗移栽 

待幼苗生长28-32天，移栽至直径18-22cm深度为28-30cm的塑料花盆中，花盆的基质为草炭土与农家土1:1混匀，在158-162度高温烘箱烘3d，之后装盆、称重、控制浇水量为田间最大持水量的60%； 

实施例3：菌液制备 

配制LB液体培养基：按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，调pH到6.8-7.2，在温度为121-126℃灭菌待冷却后，每100mL的LB液体培养基加入50-100μL的GB03菌液，在转速为180r/min下，温度为25-28℃的恒温培养摇床上培养过夜后，使用核酸检测仪测定菌液浓度为OD₆₀₀=0.8-1.0时取出备用； 

实施例4：幼苗处理 

移栽两周后加菌液，以后每隔一个月加菌一次，用移液枪吸取0.5-1mL的枯草芽孢杆菌GB03，均匀的施加在每株幼苗茎基部周围的土壤上。 

实施例5：指标测定 

一个生长季结束后测定植株生物量、根和植株地上部氨基酸含量和党参炔苷。 

实验例1：一种根际有益细菌调控党参产量和代谢产物积累的方法 

1材料与方法 

1.1材料培养 

待种子发芽后，移栽至装有蛭石的穴盘中，浇灌1/2Hoagland营养液并在温室中进行植物材料培养；温室的昼夜温度为(28±2)℃/(23±2)℃，光照14h/d，光强度约1200μmol/m²·s，相对湿度60%-80%。 

1.2处理方法 

幼苗生长3周龄后，进行处理，分为枯草芽孢杆菌菌株GB03、大肠杆菌菌株DH5α、LB液体培养基和水4个处理，处理方法与前面实验一致，待幼苗生长一个月时，移栽至直径20cm深度为30cm的塑料花盆中，移栽时注意事项为：将穴盘中的幼苗连带蛭石一起挖出，全部放入花盆中，花盆的基质为草炭土与农家土1:1混匀，在160度高温烘箱烘3d，之后装盆、称重、控制浇水量一致。移栽两周后加菌液，以后每隔一个月加菌一次，至党参苗生长一年后取样，测定相关指标，每处理6个重复。 

1.3指标测定 

主根直径测定：使用游标卡尺测定主根直径，单位为cm。 

根体积测定：将党参根挖出洗净后，用滤纸擦去表面水分，在500mL容量瓶中装200mL蒸馏水，将党参根系全部浸没在水中，读出液面上升数，并记录。 

地上部和根部干鲜重测定：取样后使用万分之一天平称取各处理鲜重，记录数据，将称完鲜重的样品装在信封袋中，写好标签，放在恒温烘箱，设置温度105℃，烘48小时后称取干重，记录数据。 

氨基酸测定：称取磨细的党参植物干样0.5g，加5mL去离子水和5mL8%的磺基水杨酸，充分振荡15min，10000rpm下离心20min，取上清液使用日立83-50型氨基酸自动分析仪，参照GB/T182462000的方法的对样品进行氨基酸测定和分析，结果为3次重复混合样品的测定值。 

党参炔苷测定：采用HPLC的方法测定党参炔苷含量，主要仪器是安捷伦 Agilent1100型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent TC-C₁₈柱，以乙腈-水(30:70)作为流动相，流速为1mL/min，检测波长为267nm，色谱柱的温度是30℃。采用的方法是中国药典2005年收录的热浸法，用45%的乙醇做为溶剂，测定党参的浸出物(%)。取党参炔苷对照品适量然后精密称定，加甲醇制成每毫升含96μg的溶液，留着备用。分别将各个处理的党参药材粉碎(过号筛)，精密称定样品约2g，置于150mL的带塞子的锥形瓶中，准确的加入甲醇50mL，称定质量后，使用超声提取30min，之后补足减失的质量，摇匀并滤过，精密的吸取滤液25mL，置于水浴上蒸干溶剂，将剩余的残渣用甲醇溶解并分批转移到10mL的容量瓶中，定容并摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过留着备用。 

2结果与分析 

2.1GB03对党参生物量的影响 

从图1可以看出，枯草芽孢杆菌GB03显著(P<0.05)提高了党参根的干重，较DH5α、LB和水分别提高了49.8%、55.4%和37.7%。 

2.2GB03对党参氨基酸的影响 

由表1可以看出，GB03较DH5α、LB和水，对党参根部18种氨基酸中的天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、胱氨酸和色氨酸均有不同程度的提高，其中对蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸和脯氨酸的提高程度较大，分别提高了53.6%、31.4%、21.5%和19.0%。 

从图2可以看出，枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水分别提高党参根部总氨基酸10.6%、6.2%和5.6%。从图3可以看出，枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水，分别提高党参根部7种必需氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸）总含量11.8%、6.7%和7.7%。 

表1GB03对党参根部18种氨基酸含量的影响 

表2不同处理对党参地上部18种氨基酸的影响 

由表2可以看出，GB03较DH5α、LB和水对党参地上部18种氨基酸中的苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸均有不同程度的提高，其中对色氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸的提高作用较为明显，分别提高30.6%、17.3%、16.3%和16.1%。 

2.3GB03对党参根中氨炔苷含量的影响 

由图4党参炔苷测定图谱可知，GB03的峰面积远远高于对照DH5α、LB和水，从图上直观的反映出GB03的党参苗体内的炔苷含量较其他处理高。经过计算党参根中炔苷的含量（图5），枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水显著(P<0.05)地提高了党参的炔苷含量，提高幅度分别为75.2%、71.5%和51.9%。 

3讨论 

本研究对生长一年党参的生长指标进行测定，发现GB03较DH5α、LB和水，分别提高了党参株高18.1%、30.1%和26.4%，分别增加主根直径45.9%、42.7%和36.6%，分别提高根体积6.5%、37.3%和25.2%，显著提高党参根部干重49.8%、55.4%和37.7%。党参主要以根入药，许多功能和药效也是由根部发挥的，因此，党参根体积及主根直径的提高，对于党参增产有着重要的意义。此外，本研究还发现，GB03处理较DH5α、LB和水，分别显著(P<0.05)提高党参地上部鲜重14.9%、57.1%和45.3%，显著(P<0.05)提高党参根部鲜重45.2%、91.2%和51.4%，分别显著(P<0.05) 提高党参地上部干重36.5%、47.2%和47.6%。 

氨基酸是人体生命活动不可或缺的物质，高分子的蛋白质在食物中不能直接被人体吸收，而是被分解为氨基酸小分子后才能被利用。研究表明，九寨沟各生长年限党参所含氨基酸种类较齐全，含有7种人体必需氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸），总氨基酸含量较高,并随生长年限逐年增加，研究表明，党参所含总氨基酸及必需氨基酸含量均高于常见蔬菜和水果(邹元锋等2010)，由此可见，党参具有较高的食用价值，本实验测定了党参地上部及根部的18种氨基酸，GB03处理的党参的多种氨基酸较LB均有不同程度的提高，党参根部总氨基及7种人体所必需的氨基酸较LB分别提高10.6%、6.2%、5.6%和11.8%、6.7%和7.7%，地上部的总氨基酸及7种必需的氨基酸分别提高10.8%、0.5%、4.3%和13.8%、2.5%和5.0%，此外，本研究发现，GB03处理的氨基酸含量均不同程度的高于对照，但未达到显著。这主要可能是因为党参一般为多年生药用植物，其根系作为主要的入药成分，在陇西地区一般种植两年才收获，而我们的实验受各种条件的限制，培养的党参为一年，培养时间较短，合成的多种代谢物还没有运输到根系，实验结果也可以证明这一点。我们发现无论是18种氨基酸，还是总氨基酸、7种人体必需的氨基酸，在党参地上部均为根系的2-3倍。 

研究发现，枯草芽孢杆菌Tu-100对油菜根系分泌物所含的氨基酸有明显的趋化作用(胡小加等2010)。另有研究表明，枯草芽孢杆菌GB03可以产生丰富的挥发性化学物质来促进紫花甜罗勒生长，并且这些挥发性信号可以诱导不同生长时期的紫花甜罗勒体内香精油的积累和释放：GB03分别提高松油醇和丁香油酚含量大约2倍和10倍(Banchio et a12009)。另外，GB03菌株可以显著提高渗透胁迫下模式植物拟南芥体内胆碱的含量(Zhang et al2010c)。宋丹等(2008)的实验结果表明，党参炔苷具有抗癌、抗菌、抗炎、 镇静、降压以及调节前列腺素代谢等功效，此外，其还可以很大程度的对抗胃酸分泌，从而保护胃黏膜。本实验发现，GB03对党参代谢产物的积累有着极大的促进作用，显著提高了根部炔苷的含量，较DH5α、LB和水分别显著提高分别为75.2%、71.5%和51.9%。由此可以看出，GB03菌株可以在很大程度上改善植物体内代谢产物的积累。有研究发现，党参的茎叶中发现了丰富挥发油、微量元素、生物碱和淀粉(王康才等2002)，因此，研究有益土壤细菌与党参互作，对于提高党参体内代谢产物的积累将发挥着重要的作用。 

4小结 

(1)枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水显著(P<0.05)提高了党参的生物量，分别显著(P<0.05)提高根部鲜重45.2%、91.2%和51.4%，提高党参根部干重49.8%、55.4%和37.7%。 

(2)枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水对党参根部的18中氨基酸中的天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、胱氨酸和色氨酸均有不同程度的提高，其中对蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸和脯氨酸的提高程度较大，分别提高了53.6%、31.4%、21.5%和19.0%。较DH5α、LB和水，分别提高党参根部总氨基酸10.6%、6.2%和5.6%，提高根部7种必需氨基酸11.8%、6.7%和7.7%。对地上部18种氨基酸中的苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸均有不同程度的提高，其中对色氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸的提高作用较为明显，分别提高了30.6%、17.3%、16.3%和16.1%，较DH5α、LB和水，提高党参地上部总氨基酸10.8%、0.5%和4.3%，提高地上部7种必需氨基酸13.8%、2.5%和5.0%。 

(3)枯草芽孢杆菌GB03较DH5α、LB和水，显著(P<0.05)地提高 了党参根中炔苷含量，提高幅度分别为75.2%、71.5%和51.9%。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。