具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物及合成方法

摘要

具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物及合成方法，涉及一种DNA碱基类似物及其合成方法。所述具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物为双吖丙啶亚磷酰胺单体。在化合物1的基础上连接带有两个羟基的中间产物，引入原料1-氨基-己二醇，利用二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的缩合作用下形成酰胺键，得到中间产物2，再引入原料4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶的催化作用下，得到中间产物3并引入原料2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA碱基类似物及其合成方法，尤其是涉及一种具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物及合成方法。 

背景技术

双吖丙啶是一种含两个氮原子的三元杂环的结构，在365nm紫外光的照射下能够迅速地产生卡宾，副产物为氮气。卡宾为反应活性非常高的分子，能够与靠近的基团发生插入反应，即使是C-H键。双吖丙啶基团只有在光照下才有高反应活性，在常规的操作下分子非常稳定，因此是一种非常有优势的光交联基团。早在19世纪60年代，就已经提出的光亲和标记（PAL）的概念使得光交联基团在生物分析中的应用一直在科学家的研究热点内。 

在研究生物分子之间的相互作用，特别是捕捉瞬态分子之间的相互作用，由于其相互作用一直处于动态变化，且并不一定知道靶物质为何物，因此很难通过分离的方法逐一进行分析。光交联反应由于其巨大的优势：1）光交联反应发生在生物分子相互作用之后，确保了分子间非共价相互识别的前提；2）自由基反应机理使得无需对作用对象进行化学修饰，特别是在作用对象未知的前提下；3）特定波长才能激发反应，无光照条件下具有很好的反应惰性；4）形成的共价复合物非常适合做分离以及鉴定研究。因此，光交联基团在研究生物分子之间的相互作用具有很广泛的意义。 

肿瘤标志物的甄别。癌症等重大疾病是威胁人类生命健康的头号杀手，目前我国每年癌症的发病人数在200万以上，死亡人数达160万人/年。癌症的现患水平和死亡率均居世界较高水平。就目前的医疗水平上看，对癌症患者实施早期治疗的5年生存率可超过80%，而对晚期癌症患者，治疗后的5年生存率低于10%。因此，癌症的早期诊断具有十分重要的意义。癌症的临床诊断目前仍主要基于影像学检查组织和细胞的形态，难以实现癌症的早期诊断。特异性检测恶性肿瘤相关基因和生物标志物是实现癌症早期诊断的一个最有效的方法。 

肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是宿主对癌类反应而异常产生或升高、反映肿瘤存在和生长的一类物质。它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，了解肿瘤的组织发生、细胞分化和细胞功能，有助于进行肿瘤的诊断、分类、判 断预后及指导治疗，因此肿瘤标志物的研究及甄选具有极其重要的意义。目前，推荐并已经在临床上发挥作用的肿瘤标志物，比如有乳腺癌筛查、诊断和监测预后中使用的肿瘤标志物包括：雌激素和孕激素受体，HER-2/neu（c-erbB-2）、CA15-3、BR27.29等，其他被寻找到或已经进行临床使用的肿瘤标志物少之又少。 

上世纪90年代发展的通过指数富集配体系统进化法SELEX技术获得的核酸适配体对于特定的靶标具有高亲和性和高选择性，因此其非常适合用来作为寻找、捕获生物标志物的工具。但是由于核酸适配体与靶标的结合是氢键的形式使其在后续的研究过程，在所处状态的变化等情况下很容易发生脱落等现象，因此，如果能发展一种以共价键的形式，且能特异性的靠近靶标，这将是一个很大的突破。光交联基团的引入使得寻找生物标志物的研究往前上了一大台阶。比如陈鹏等利用光交联探针双吖丙啶在蛋白上的标记成功地捕捉了大肠杆菌体内的一个关键酸性分子伴侣HdeA的作用底物(Meng Zhang,Peng R Chen,Nature chemical biology,2011,VOL7,671-677)。但是其在用基因表达的方式在蛋白上标记双吖丙啶，工作量大，且非常困难，需经大量的基因筛选，不适合广泛的应用。另一种常见的标记方法是利用琥珀酰亚胺酯方法将其修饰在带有NH2的位点上面，但是这样的修饰不足是需要有特定的氨基基团。 

靶点的研究。蛋白质与核酸是构成生物的两大类重要生物分子，核酸与蛋白在生物体相互关联，互相作用，因此研究核酸与蛋白质的作用靶点具有非常重要的意义。核酸适配体虽然是能够特异性结合到靶标蛋白上，但是却不知道核酸适配体与蛋白质相互作用时的二级结构是怎么样，也不了解核酸适配体与蛋白作用能力最强的位点是什么。因此，发展一种能够在核酸上进行直接的标记，同时又能够有效指示破坏哪个位点的结构会最大程度上影响核酸对蛋白的识别的化合物相当重要，具有较高的应用前景。 

发明内容

本发明的目的是提供一个具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物及其合成方法。 

所述具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物的英文命名为diazirine phosphoramidite，中文命名为双吖丙啶亚磷酰胺单体，分子式为C_(38+n1+n2)H_{(50+2(n1+n2))}N₅O₆P，其结构式如下所示： 

其中，n₁和n₂为1,2,3…8。 

所述具有光交联基团双吖丙啶的DNA碱基类似物的合成路线如下： 

其中1为光交联基团的来源物质，2和3为反应过程中间产物，化合物4为最终的DNA碱基类似物，分别具有在DNA合成过程中所要的特征基团4-4’-二甲氧基三苯基甲烷基团和亚磷酰胺基团,n₁和n₂为1,2,3…8。 

为实现连接有DMT和亚磷酰胺基团，需要在化合物1的基础上连接带有两个羟基的中间产物，引入原料“1-氨基-己二醇”，利用二环己基碳二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt）的缩合作用下形成酰胺键，得到中间产物2。 

为实现得到与DNA合成过程中碱基单体具有的特征基团，在中间产物2的基础上，引入原料“4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷”，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶（DMAP）的催化作用下，得到中间产物3。 

为实现最终产物4，在中间产物3的基础上引入原料“2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺”，以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物4。 

本发明在双吖丙啶的基础上进行基团的改进，利用二环己基碳二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt）催化酰胺反应连接上的1-氨基己二醇，形成中间产物2；在中间产物2的基础上，引入4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶（DMAP）的催化作用下，得到中间产物3。在中间产物3的基础上引入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物4。 

本发明所合成的DNA碱基类似物能够在365nm紫外光光照的条件下特异性的与靶标发生共 价交联，同时又能够用最方便的方式嵌入到DNA链中，解决了DNA标记的难题。本发明设计的双吖丙啶DNA碱基类似物能够利用不同位点修饰的方法，寻找到与蛋白质相互作用位点最近的序列，方便用来核酸适配体的截短修饰以及核酸药物的适用，肿瘤标志物的甄别等，同时本发明在研究核酸的二级结构上也会有很大的应用，核酸有丰富的二级结构，DNA双链之间是以氢键堆积的，只有在一定的盐离子浓度中才能形成，且很容易受到所处环境的应用。如果能够利用本发明中所涉及的碱基类似物，在光照下形成共价键，比如将变构探针的两端锁起来，将会使变构探针发挥它潜在的应用；又比如将DNA双链锁起来，可以推广到DNA纳米材料的应用上。本发明还可以用来研究生物体与DNA相互作用的未知蛋白质，比如与DNA修复有关的效应蛋白等。 

本发明具有以下优点： 

1、合成原料廉价，步骤简单可行； 

2、可以根据需要嵌入到DNA序列的任何一个位置； 

3、只有在365nm光照下才能发生反应，常规操作下十分稳定； 

4、该方法还可以用来其他功能基团的改进，只要利用这样的方法和模板就能够将带有羧基的原料改造成为能够在DNA合成仪上使用的碱基类似物。 

附图说明

图1为最终产物4的¹H NMR谱图。 

图2为最终产物4的³¹P NMR谱图。在图2中，147ppm为phosphoramidite的特征峰。 

图3为核酸序列SA-6-drz的分子量分析谱图。在图3中，用Madli-TOF技术对SA-6-drz序列的分子量进行分析，得到的数值与计算值相符合，从另一个角度上说明具有双吖丙啶的DNA碱基类似物成功合成到DNA上。 

图4为SA-6-drz与链霉亲和素的结合与光交联能力测试曲线图。利用流式细胞仪对标记有荧光基团FAM的DNA序列与SA-beads结合程度进行分析。从左到右的曲线分别是随机序列和SA-beads的结合曲线，正常链霉亲和素核酸适配体与SA-beads孵育后用尿素洗涤后的结合曲线，SA-6-drz与SA-beads结合曲线，SA-6-drz与SA-beads孵育后光照10min并用尿素洗涤的结合曲线。尿素是用来破坏核酸适配体与蛋白之间的氢键，SA-6-drz能够与蛋白形成共价键，所以从流式细胞仪上看到尿素处理后荧光强大还比较大，但是正常的核酸适配体无法形成共价键，所以很容易被破坏掉结合。在图4中，曲线a为随机序列与微珠的结合曲线，曲线b为无修饰SA序列与微珠孵育之后用尿素洗涤之后的结合曲线，曲线c为SA-6-drz序列与微珠的结 合曲线，曲线d为SA-6-drz序列与微珠孵育之后，紫外光照10min后，用尿素洗涤的曲线，曲线e为SA序列与微珠的结合曲线。 

图5为不同光照时间下SA-6-drz共价能力表征曲线图。在图5中，从左往右，光照时间逐渐加长，共价到蛋白上的DNA就越多，在10min以后达到饱和。可见该光交联探针的反应是由光控制的，能够很好的调控所需要的光照程度，进而达到所需要的共价程度。曲线a为SA-6-drz与微珠结合之后光照0min，并用尿素洗涤后的曲线；曲线b为SA-6-drz与微珠结合之后光照2min，并用尿素洗涤后的曲线；曲线c为SA-6-drz与微珠结合之后光照5min，并用尿素洗涤后的曲线；曲线c为SA-6-drz与微珠结合之后光照10min，并用尿素洗涤后的曲线；曲线e为SA-6-drz与微珠的结合曲线。 

具体实施方式

实施例1 

中间产物2的合成，其合成路线如下： 

在一圆底烧瓶中加入原料1(105.3mg,0.82mmol)，1-氨基己二醇(132mg,0.902mmol),DCC(203mg,0.984mmol),HOBt(133mg,0.984mmo),10mL溶剂，在氮气保护下，室温下反应24h，结束后，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ3.73(m,2H),3.61(m,2H),3.19(m,2H),1.98(t,2H),1.72(t,2H),1.66(m,1H),1.45(m,2H),1.30-1.20(m,4H),0.99(s,3H).ESI-MS Calculated for C₁₂H₂₃N₃O₃Na:280.33([M+Na]⁺),Found:280.2。 

实施例2 

中间产物3的合成，其合成路线如下： 

在一圆底烧瓶中加入2(424.4mg,1.65mmol)，4-二甲氨基吡啶(20mg,0.165mmol),10mL吡啶，在氮气保护下。同时在氮气保护下将4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(560mg, 1.65mmol)溶解于4mL二氯甲烷中，并将溶液在冰浴下滴加入上述溶液中，然后室温下反应24h，结束后，向反应体系中加入水，然后用乙酸乙酯萃取三遍，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.41-6.82(m,13H),3.79(s,6H),3.67-3.61(m,2H),3.27-3.08(m,4H),2.40(s,1H),1.93(m,2H),1.75(m,2H),1.59(s,4H),1.44(m,2H),1.02(s,3H).ESI-MS Calculated for C₃₃H₄₁N₃O₅Na:582.7([M+Na]⁺),Found:582.3。 

实施例3 

合成产物4，其合成路线如下： 

在一圆底烧瓶中加入3(181.2mg,0.324mmol)，在氮气保护下加入5mL二氯甲烷。在冰浴下滴加入N,N-二异丙基乙基胺和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，冰浴中反应2h，用二氧化硅柱子分离纯化，核磁和质谱表征，如图1，2。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.41-6.82(m,13H),3.79(s,6H),3.76-3.5(m,6H),3.27-3.08(m,4H),2.6-2.5(m,4H),1.93(m,2H),1.85(m,1H),1.72(m,2H),1.4(s,4H),1.2(m,2H),1.15(d,6H),1.12(d,6H),1.02(s,3H). ³¹P NMR(202MHz,CDCl₃)δ147ppm.ESI-MS Calculated for C₄₂H₅₈N₅O₆PNa:782.9([M+Na]⁺),Found:782.5。 

实施例4 

将最终产物4应用于DNA合成仪中合成。 

设计合成一条带有荧光基团和产物4的链霉亲和素的核酸适配体序列SA-6-drz，如下：5'-fam-ATT GA x C CGC TGT GTG ACG CAA CAC TCA AT-'3，其中x为产物4。产物4的插入使用的是常规的DNA合成程序，偶联时间为900s，并用HPLC进行分离纯化和MADLI-TOF表征，如图3。 

实施例5 

将合成的SA-6-drz用于结合能力的测试。 

将200nM SA-6-drz溶解于200μL BB缓冲溶液中（8g氯化钠，0.2g氯化钾，3.63g十二水合磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.112g六水合氯化镁溶解于1000mL超纯水中，并调pH至7.4），95℃变性5min，冰浴中迅速冷却。然后加入4μL SA-beads，37℃中孵育10min。 并用200μL BB缓冲溶液洗涤2次，最终将其分散在200μL BB缓冲溶液中，用流式细胞仪表征结合能力，如图4。 

实施例6 

将合成的SA-6-drz用于光交联能力的测试。 

将200nM SA-6-drz溶解于200μL BB缓冲溶液中，95℃变性5min，冰浴中迅速冷却。然后加入4μL SA-beads，37℃中孵育10min，将其至于紫外交联箱中光照10min，之后用200μL10M尿素洗涤1次，再用200μL BB缓冲溶液洗涤2次，最终将其分散在200μL BB缓冲溶液中，用流式细胞仪表征光交联能力，如图4。 

实施例7 

发生光交联作用所需时间的考察。 

将200nM SA-6-drz溶解于200μL BB缓冲溶液中，95℃变性5min，冰浴中迅速冷却。然后加入4μL SA-beads，37℃中孵育10min，将其至于紫外交联箱中分别光照0、2、5、10min，之后用200μL 10M尿素洗涤1次，再用200μL BB缓冲溶液洗涤2次，最终将其分散在200μL BB缓冲溶液中，用流式细胞仪表征不同时间下光交联能力，如图5。