一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒，用于检测HPV基因型别的方法，其中，包括以下步骤：A、提取DNA；B、DNA模板PCR反应，扩增得到所述感染HPV病毒的DNA样品的PCR产物；C、通过限制性内切酶进行限制性片段长度多态性分析。此方法检测成本低，且能快速直观地根据HPV型别特定的图谱确定感染的HPV病毒的型别。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒。 

背景技术

子宫颈癌是世界女性中最常见的癌症之一。每年大约有500，000个子宫颈癌的病例，其中有将近275，000个病人死于该癌症。1976年，德国学者zur Hausen 发现了人类乳头状瘤病毒（HPV）在子宫颈癌的发病过程中起到非常重要的作用。研究表明在初次感染该病毒的7到12个月内，约70％的HPV感染会被自行清除，90%在2年内被清除。其余的10%的HPV感染将会发展为持续性感染。一种高危型HPV基因型（HR-HPV）的持续性感染在子宫颈癌的发病过程中是关键的危险因素。而该癌症的发病过程往往持续10年之久。因此，早期的HPV基因型检测，尤其病毒持续性感染的检测对有效治疗子宫颈癌是至关重要的。 

目前用于检测HPV基因型别的分子生物学技术有很多。如Southern印迹直接核酸杂交测定法可以直接检测各HPV亚型，但它们耗时长，并需要大量的高度纯化的DNA，灵敏度不高。因此，它们不适合应用于大量临床样本的检测。如杂交捕获二代（HC II）的信号放大杂交试验方法已被美国食品和药物管理局（FDA）批准应用于临床试验。该方法可以检测HR-HPV 13种型别（HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，和68）。再例如靶目标放大试验，罗氏AMPLICOR HPV检测法也可以检测HR-HPV 13种型别。但是，HC II和罗氏AMPLICOR HPV检测法无法检测出特定的HPV基因型别，也就无法确定特定HPV基因型的持续性感染。基于PCR方法的直接测序法费用高昂而且低通量，不能普及。基于PCR扩增目的DNA的罗氏线性阵列HPV基因型别检测法，能区分37种HPV基因型。但是，该检测法需要使用多个特定引物进行PCR反应，在单个样本的检测种是昂贵和费时的。如HPV寡核苷酸微阵列系统和液珠GeneFinder HPV的DNA微阵列芯片分别能够检测出22种和32种HPV基因型。由于它们的准确性，其应用在发达国家很受欢迎。然而，基于芯片的检测需要非常昂贵的设备，对许多发展中国家来说可能不适合。PCR-RFLP检测法已被证明是便宜的，快速的并且准确度也高。但是，目前的PCR-RFLP基因分型方法通常同时使用多种（大约5种到6种）限制性内切酶来确定某个样本特定的HPV基因型，这使得该方法变的复杂了，无法发挥它的优势。 

因此，现有技术还有待于改进和发展。 

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒，旨在解决现有检测技术操作过程复杂的问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种用于检测HPV基因型别的方法，其中，包括以下步骤：

A、提取DNA: 提取检测样本的基因组DNA，制得DNA样品；

B、DNA模板PCR反应：以DNA样品作为模板，采用能筛选出感染HPV病毒的DNA样品的引物进行PCR反应，扩增得到所述感染HPV病毒的DNA样品的PCR产物；

C、根据限制性片段长度多态性确定HPV基因型别：将扩增得到的PCR产物在含有限制性内切酶HpyCH4V的消化液体系下进行消化，将消化产物装载到聚丙烯酰胺凝胶上电泳；根据与限制性内切酶HpyCH4V相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，在进行步骤C后，所述用于检测HPV基因型别的方法还包括以下步骤： 

对使用限制性内切酶HpyCH4V得到相似的限制性片段长度多态性图谱的HPV基因型，将其PCR产物在含有限制性内切酶CviAII的消化液体系下进行消化；根据与限制性内切酶CviAII相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，步骤B中所用的引物包括引物MY09和引物MY11；所述引物MY09-R的序列为CGTCCMARRGGAWACTGATC，所述引物MY11-F的序列为GCMCAGGGWCATAAYAATGG，M为A或C，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。 

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，所述PCR反应的热循环条件为在95℃下10分钟初始变性，随后进行35个循环，在95℃下进行15秒，50℃下30秒，和72℃下进行30秒，并在72℃下进行5分钟的最后延伸。 

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，所述PCR反应中，PCR反应体系为25μl，其中含有1×Ex Taq缓冲液，2 mM的氯化镁，2.5 mM的dNTP，0.5 U Ex Taq HS聚合酶，5 pmol的引物和2μl的DNA样品。 

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，在进行步骤B之前，还包括以下步骤： 

以DNA样品作为模板，用于引物PC04和引物GH20进行PCR反应，检测DNA提取的有效性；

所述引物GH20-F的序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，所述引物PC04-R的序列为CAACTTCATCCACGTTCACC。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，所述消化过程中，具体为： 

将6μl 的PCR产物在20 μl的消化液体系中，37℃下进行消化；其中，20μl消化体系液含有1 U HpyCH4V和2 μl 的10×NEBuffer4。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，所述用于检测HPV基因型别的方法用于检测13种高危型HPV和20种低危型HPV；其中，13种高危型HR-HPV包括HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68；20种低危型HR-HPV包括HPV 54，85，6，69，71，72，81，53，53a，62，70，66，82，11，44，55，61，83，84，30。 

一种用于检测HPV基因型别的试剂盒，其中，所述试剂盒中包括： 

用于筛选出感染HPV病毒的DNA样本的引物；

用于限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶HpyCH4V和CviAII。

所述的用于检测HPV基因型别的试剂盒，其中，所述用于筛选出感染HPV病毒的DNA样本的引物为引物MY09和引物MY11；所述引物MY09的序列为CGTCCMARRGGAWACTGATC，所述引物MY11-F的序列为GCMCAGGGWCATAAYAATGG，M为A或C，W为A或T，Y为C或T，R为A或G； 

所述试剂盒中还包括：

与所述限制性内切酶相对应的缓冲液；

与所述限制性内切酶相对应的酶切图谱；

用于鉴定的DNA样本中是否含有DNA的引物PC04和引物GH20；所述引物GH20-F的序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，所述引物PC04-R的序列为CAACTTCATCCACGTTCACC。

有益效果：本发明所提供的一种用于检测HPV基因型别的方法，通过采用MY09/MY11引物对检测样本的HPV的L1基因进行PCR扩增，能准确地筛选出感染HPV病毒的阳性样本；然后通过两种限制性内切酶进行限制性片段长度多态性分析。此方法检测成本低，且能快速直观地根据HPV型别特定的图谱确定感染的HPV病毒的型别。 

附图说明

图1为本发明中HPV各种型别的HpyCH4V限制性内切酶片段长度多态性图谱。 

图2为本发明中HPV各种型别的HpyCH4V限制性内切酶片段长度多态性图谱。 

具体实施方式

本发明提供一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

为了使检测方法价格低以及简单易操作，本发明所提供的一种用于检测HPV基因型别的方法，在检测过程中仅需使用一种或两种限制性内切酶进行片段长度多态性图谱分析就能达到确定HPV型别的目的。采用本发明方法可以检测出13种全部的HPV高危型和19种常见的HPV低危型，其中，13种HR-HPV高危型别包括HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68；20种HR-HPV低危型别包括HPV 54，85，6，69，71，72，81，53，53a，62，70，66，82，11，44，55，61，83，84，30。 

具体地，所述用于检测HPV基因型别的方法，包括以下步骤： 

A、提取DNA: 提取检测样本的基因组DNA，制得DNA样品。

其具体步骤可以为：临床宫颈细胞样本保存在CytoRich Blue液体保存液中，细胞悬液离心后去除上清液。细胞沉淀溶解在400 μl的存储缓冲液中。存储缓冲液包括100 μl的1×PBS和300μl的1×TE缓冲液。加蛋白酶K（最终浓度为0.2μg/ml）到缓冲液中，在50℃消化过夜。得到的DNA样品，用于进行后续的PCR扩增。 

B、DNA模板PCR反应：以DNA样品作为模板，采用能筛选出感染HPV病毒的DNA样品的引物进行PCR反应，扩增得到所述感染HPV病毒的DNA样品的PCR产物。 

在此步骤中，所用引物包括MY09/MY11一对引物，分别具有如下序列： 

正向引物MY11-F: 5'…GCMCAGGGWCATAAYAATGG…3'；

反向引物MY09-R: 5'…CGTCCMARRGGAWACTGATC…3'；

其中，M=A+C；W=A+T；Y=C+T；R=A+G。

引物MY09/MY11能对HPV的晚期基因L1区的一段保守序列进行PCR扩增，筛选出感染HPV病毒的阳性样本。 

在进行PCR反应过程时，25 μl的PCR反应混合物中含有1×Ex Taq缓冲液，2 mM的氯化镁，2.5 mM的dNTP，0.5 U Ex TaqTM HS聚合酶，5 pmol的引物和2 μl的DNA样品。PCR热循环条件：在95℃下10分钟初始变性；随后进行35个循环，在95℃下进行15秒，50℃下30秒，和72℃下进行30秒；并在72℃下进行5分钟的最后延伸。将所得的PCR产物（3 μl）进行琼脂糖凝胶电泳（2％）。用0.2 μg/ml溴化乙锭对凝胶进行染色，扩增出的DNA条带经UV透照仪可视化。 

在进行步骤B之前，为了确定样品中确实含有DNA，还可以包括以下步骤： 

以DNA样品作为模板，用于引物PC04和引物GH20进行PCR反应，检测DNA提取的有效性。此引物PC04/GH20作为内对照，扩增人类β-球蛋白(β-globin)基因，以检测DNA提取的有效性。

引物PC04和引物GH20分别具有如下序列： 

正向引物GH20-F: 5'…GAAGAGCCAAGGACAGGTAC…3'；

反向引物PC04-R: 5'…CAACTTCATCCACGTTCACC…3'；

C、根据限制性片段长度多态性确定HPV基因型别：

将MY09/ MY 11引物扩增的PCR产物在含有限制性内切酶HpyCH4V（TG↓CA，NEB）的消化液体系下进行消化，将消化产物被装载到聚丙烯酰胺凝胶（10％）上电泳；根据与限制性内切酶HpyCH4V相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述消化过程中，具体为：使用MY09/11引物扩增的PCR产物（6 μl）在20 μl的消化液体系下进行消化。其中，20 μl消化体系液含有1 U HpyCH4V（TG↓CA，NEB）和2 μl 的10×NEBuffer4。PCR产物在37℃下3小时消化。 

确定HPV的基因型过程中，由于在限制性内切酶HpyCH4V的作用下，不同HPV型别特定的限制性片段长度多态性图谱不同，从而可以达到确定基因型的目的，其中，所述限制性片段长度多态性图谱如图1和图2所示。 

根据如图1和图2所示的图谱，可以确定HPV的22型别，其中包括HPV 16，31，39，54，59，85，6，52，56，58，69，71，72，81，53，53a，62，70，66，82。有10种HPV型别具有相似的图谱，无法分辨，其中包括HPV33，58，11，18，68，44，55，61，83，84。而理论上，HPV30 (GenBank ID: X74474) 被HpyCH4V限制性内切酶消化后的片段大小是：244，114，92 bp，与图1中的HPV11的图谱相似。 

由于在试验用的检测样品中，没有找到HPV35和51这两种亚型，所以图1和图2中没有包含HPV35和51的HpyCH4V限制性内切酶片段长度多态性图谱。例如图1中表示的HPV16被HpyCH4V限制性内切酶消化后的片段大小是：298，191，28，17 bp。而在理论上，HPV35 (GenBank ID: M74117) 被HpyCH4V限制性内切酶消化后的片段大小是： 352，72，28 bp，此独特的酶切图谱能和其他亚型区分开来（本领域技术人员根据此片段大小，是可以从得到酶切图谱判断此HPV的基因型）。HPV51被HpyCH4V限制性内切酶消化后的片段大小是：171, 133, 117, 21, 10 bp。它的酶切图谱与HPV61/83/84的相似。 

由于使用HpyCH4V进行酶切后，会得到部分相同的限制性片段长度多态性图谱的HPV基因型，因此，为了区分具有相同图谱的HPV基因型，所述用于检测HPV基因型别的方法还包括以下步骤： 

对使用HpyCH4V得到相似的限制性片段长度多态性图谱的HPV基因型，将其用MY09/ MY 11引物扩增的PCR产物在含有限制性内切酶CviAII（C↓ATG，NEB）的消化液体系下进行消化；根据与限制性内切酶CviAII相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述消化过程，与采用HpyCH4V限制性内切酶的消化过程的条件相同。 

确定HPV的基因型过程中，由于在限制性内切酶的CviAII作用下，剩余的HPV型别特定的限制性片段长度多态性图谱不同，从而可以达到确定基因型的目的，其中，所述限制性片段长度多态性如表1所示。而HPV51被CviAII限制性内切酶消化后的片段大小是：301, 151 bp，此酶切图谱能与其他亚型区分开来。 

表1 

针对此检测方法，本发明中还提供一种用于检测HPV基因型别的试剂盒，所述试剂盒中包括：

用于筛选出感染HPV病毒的DNA样本的2条引物，引物MY09/MY11；

用于限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶HpyCH4V和CviAII。

所述试剂盒中还可以包括： 

与所述限制性内切酶相对应的缓冲液；

与所述限制性内切酶相对应的酶切图谱。

所述试剂盒中还可以包括： 

用于鉴定DNA样本中是否含有DNA的2条引物，引物PC04/GH20。

综上所述，本发明方法通过使用一种或两种限制性内切酶，进行片段长度多态性图谱分析，即可以检测出13种全部的HPV高危型和20种常见的HPV低危型，因此本发明检测方法成本低且操作简单。而且，本发明对PCR条件也进行了改良，使得目的条带更加清晰，并且减少了非特异性DNA条带，更加方便了检测并提高了检测的准确性。 

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

<110>  陈玲瀚；宋宁

 

<120>  一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒

 

<160>  4    

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  正向引物MY11

 

<400>  1

gcmcagggwc ataayaatgg                                                    20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  反向引物MY09

 

<400>  2

cgtccmarrg gawactgatc                                                    20

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  正向引物GH20

 

<400>  3

gaagagccaa ggacaggtac                                                    20

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  反向引物PC04

 

<400>  4

caacttcatc cacgttcacc                                                    20