一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

摘要

本发明公开一种牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒，在双重PCR反应体系中引入指示假阴性的内标，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，反应条件为：dNTP浓度为2.0mmol/L，Mg

说明书

 

技术领域

本发明涉及动物检验检疫技术领域，具体的，本发明涉及一种用于牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒的技术领域。

背景技术

牛新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum，N．caninum）寄生在宿主体内所引起的一种原虫病，该病的中间宿主为牛、绵羊、山羊、犬、马、鹿小鼠等温血动物，终极宿主为犬，主要造成孕畜流产、死胎及新生仔畜运动神经系统疾病，可垂直传播，一年四季均发病，该病对牛的危害尤为严重，是世界上许多地区造成奶牛流产、弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一。牛弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T. gondii）引起的一种人兽共患寄生虫病，猫为终宿主，人及动物为中间宿主，引起的流产可发生在奶牛妊娠的各阶段。这两种病呈世界性分布，给畜牧业造成巨大的经济损失。高效快速的检测方法，对于该病的早发现，早防治具有重要作用。 

目前，牛新孢子虫病和弓形虫病常用的检测方法有病理组织检测、病原学检测和血清抗体检测。但由于犬新孢子虫与刚地弓形虫的形态结构相似，二者都可以引起奶牛的流产、死胎以及神经系统障碍，且二者存在交叉抗原，有些血清学检测方法会出现交叉反应；临床上这两种病原常存在混合感染，且症状相近，往往难以区分检测。

PCR检测技术具有快速、灵敏、特异等优点，目前，已有很多采用PCR方法检测这两种病的报道。研究表明，临床标本如血清、全血、组织和分泌物等样品中含有大量的未知成分，会造成对PCR扩增的抑制，核酸抽提过程中试剂的残留也会抑制PCR扩增，从而导致假阴性结果或定量值偏低。另一方面，核酸提取过程中的丢失，也会造成假阴性结果。所以，对检测过程进行质量监控至关重要。

经检索，国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便，且通过内标的添加，指示并校准假阴性结果，能够同时检测牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测新孢子虫病和弓形虫病，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均具有重要意义。

发明内容

针对目前国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果，提高检测结果的准确率，能够同时对牛新孢子虫病和弓形虫病进行检测的内标多重PCR方法，本发明提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了新孢子虫、弓形虫和扩增内标的PCR模板，并对反应条件进行了优化，建立了含有内标物的多重PCR检测体系，检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，实现了对牛新孢子虫病与弓形虫病单独检测或同步检测，且可对检测结果进行质量监控，从而实现对牛新孢子虫病和弓形虫病的灵敏、高效、快速、准确检测。 

本发明的主要技术方案：通过提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，建立了一种牛新孢子虫病和弓形虫病的检测方法，采用在双重PCR反应体系中引入指示假阴性的内标（internal amplification control，IAC），通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，成功的建立了含有内标的多重PCR反应体系，可以对核酸提取和PCR扩增过程进行监测，显示抑制成分的存在，指示假阴性结果的发生，确保检测质量。

本发明具体提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mL PCR扩增试剂混合液，包括Tris-HCl pH8.4， 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL Taq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：

（1）新孢子虫检测引物：

上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG

下游引物（Nc-R）：CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG

可以扩增GeneBank登录号为X84238.1，469-690位犬新孢子虫的Nc-5基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.1；

（2）弓形虫检测引物：

上游引物（GRA-F）：ATGATACAACCTCCGAAGCG

下游引物（GRA-R）：CGTCTTGTGCCCTGTTCTTC

可以扩增GeneBank登录号为HM776942.1，265-388位刚地弓形虫的GRA6基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.2；

（3）监控内标检测引物：

上游引物（PRL-F）：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC

下游引物（PRL-R）：CAATCTCTATGGCCCTCGA  

可以扩增GeneBank登录号为AF426315.1，8142-8449位牛催乳素PRL基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.3。

同时，本发明具体提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，所述的内标多重PCR检测试剂盒通过如下具体方法获得：

（1） 引物的设计与合成：依照GenBank登录号为X84238.1的犬新孢子虫 Nc-5基因、GenBank登录号为HM776942.1的刚地弓形虫GRA6基因和GenBank登录号为AF426315.1的牛催乳素PRL基因，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为222 bp、124 bp和308 bp。 

（2） 模板DNA的制备与阳性重组质粒的构建：按照抗凝全血血液基因组DNA提取系统进行操作提取核酸，肝脏、肾脏、流产胎儿等组织经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20℃保存备用。

以阳性重组质粒的构建以犬新孢子虫核酸为模板，用引物Nc-F和Nc-R扩增出长度为222 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-Nc5；阳性重组质粒的构建以刚地弓形虫核酸为模板，用引物GRA-F和GRA-R扩增出长度为124 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-GRA6；阳性重组质粒的构建以牛催乳素PRL核酸为模板，用引物PRL-F和PRL-R扩增出长度为308 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-PRL。   

（3）内标多重PCR扩增体系的建立：

采用 20μL反应体系：10×buffer 2.0 uL，dNTP浓度分别为2.5、2.0、1.5和1.0 mmol/L，引物浓度分别为0.75、0.50、0.25和0.125 μmol/L，Mg²⁺浓度分别为2、1.5、1.0 和 0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶分别为1.75、1.5、1.25、1.0、0.75和0.5U，退火温度分别为55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃和 60 ℃，循环数分别为30、35和40；经优化一项时其他项参数不变，分别进行Nc-5、GRA6和PRL基因单重PCR反应条件的优化，在单重PCR反应条件的基础上，进行多重PCR优化，确定应条件为：10×buffer 2.0 uL，dNTP 浓度为2.0 mmol/L，Mg²⁺ 浓度为1.0 mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL三个基因所对应的上下游引物浓度分别为0.125 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA 2μL，补去离子水至20μL；扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 45s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后经 72 ℃ 延伸10 min；试验检测结束后，用浓度为25g/L的琼脂糖凝胶电泳，80 V -100V 60min，观察结果，在同一反应管中分别扩增出大小为222 bp、124 bp和308bp的电泳条带，与目的序列片段相符。

（4）试剂盒的组成：以可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，试剂盒组成如下：0.5 mL PCR扩增试剂混合液，包含Tris-HCl(pH8.4) 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L；5U/uL Taq DNA聚合酶75U；去离子水1.0mL。

试剂盒反应条件为：PCR扩增试剂混合液10μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA 2 μL，补去离子水至20uL；扩增条件同上述步骤（3）。

进一步，本发明提供牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒具体检测方法为：

（1）核酸的提取：按照抗凝全血血液基因组DNA提取系统进行操作提取核酸，组织样品经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20 ℃保存备用。

（2）内标多重PCR扩增：多重PCR反应条件为：PCR扩增试剂10μL，DNA 2μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，补去离子水至20uL；扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s 58 ℃ 45s，72 ℃ 30 s，30个循环； 72 ℃ 延伸10 min；试验检测结束后，用浓度为25 g/L的琼脂糖凝胶电泳，80 V -100V，60min，观察结果。

（3）检测结果分析：被检样品同时扩增出大小为222 bp、124 bp和308bp的目的条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阳性；被检样品扩增出大小为308bp电泳条带，且有222 bp或124 bp任何一条电泳条带，扩增出222 bp条带，表明该样品新孢子虫病，扩增出124 bp条带，表明该样品弓形虫病，均为阳性；被检样品仅扩增出大小为308bp电泳条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阴性；被检样品不能扩展出大小为222 bp、124 bp和308bp中的任意一条电泳条带，表明反应中存在抑制成分，需重新进行检测。

本发明通过对牛新孢子虫病和弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度和重复性进行确证，通过对模板提取和PCR扩增过程进行监测，证明了上述步骤制备的牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，确保检测结果的准确性。

进一步，本发明提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒的应用，用该试剂盒分别扩增了感染牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等阳性牛组织核酸样品，被测样品除扩增出内标PRL基因308bp的条带，未出现其它条带，表明该方法具有较好的特异性。 

本发明用提供的内标多重PCR检测试剂盒分别对10倍梯度稀释稀释的三种阳性重组质粒混合物进行扩增，内标多重PCR方法对两种基因的最低检测限为7×10³ 拷贝/反应。而对应的单重PCR对每种基因的最低检测限均为7×10²拷贝/反应，双重PCR方法对两种基因的最低检测限为7×10³拷贝/反应，说明内标PRL基因对本研究所建立的内标多重PCR检测体系的灵敏度几乎没有影响，表明该方法具有较高的灵敏度。

本发明用提供的内标多重PCR检测试剂盒，利用内标多重PCR扩增体系，对7×10⁷拷贝/μL 的pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL阳性重组质粒混合物为模板进行3次重复检测，均可扩增出222bp、124 bp、308bp的特异片段，表明该方法具有较好的重复性。  

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果： 

（1）检测时间短：采用传统方法的检测时间至少需要在5天上，常规单重PCR检测对两种病的检测时间至少需要6天，采用本发明提供的试剂盒检测时间包括样品前处理到获得检测结果在3小时之内，较其它方法的检测时间大大缩短。

（2）检测灵敏度高：本发明可检测到7×10³个拷贝的重组质粒，与不含内标的双重PCR灵敏度相当。

（3）特异性好：通过对感染牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等阳性组织核酸样品检测，检测结果均为阴性，仅新孢子虫、弓形虫的阳性核酸样品检测为阳性。

（4）重复性好：通过对7×10⁷拷贝/μL pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL阳性重组质粒混合物为模板进行3次重复性检测，均可扩增出222bp、124 bp、308bp特异片段。 

（5）污染少：与常规单重PCR检测相比，本发明提供的整个反应在同一个封闭的管内进行，仅需一次实验操作，减少了过多操作过程造成的污染。

（7）可指示假阴性结果的发生：因该反应体系中的内标模板随着反应的进行而扩增，如果被测样品和内标模板均没有扩增，说明该检测结果为假阴性结果。

（8）流程简单：操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的训练便能很好完成。

（9）成本低：使用的试剂为分子生物学常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。

（10）内标设计合理：牛催乳素PRL基因位于第23号常染色体，其表达产物是催乳素，主要是在牛腺垂体前叶的泌乳细胞中表达，随血循环进入作用的靶器官，垂体外的很多器官如蜕膜组织、子宫肌、胎盘、羊水、下丘脑、胸腺、泪腺及淋巴组织等都有其合成，且该基因是牛产奶性状潜在的一个遗传标记，可将其作为内质控（IAC）。所设计的引物具有较好的特异性，经反应条件的优化，能够保证内标片段与两目的基因共扩增的进行，且内标基因的扩增不影响检测的灵敏度，从而通过内标的扩增可对模板提取和PCR扩增的全过程进行监控。

（11）实用价值高：本发明实现对试验过程实施监测，有效的解决了现有技术传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。

（12）应用效果好：采用本发明对临床收集的157份样品用该体系进行检测，均得到预期结果。

（13）借鉴意义大：采用本发明，为相关动物病检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。

（14）应用前景广阔：本发明能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。

附图说明

图1所示为不同引物对三种阳性质粒混合物的扩增试验结果，其中， 1为阴性对照，2为引物 GRA-F/GRA-R对三种阳性质粒混合物的扩增结果（124bp），3为引物Nc-F/Nc-R对三种阳性质粒混合物的扩增结果（222bp），4为引物PRL-F/PRL-R对三种阳性质粒混合物的共扩增结果（308bp），5为Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R、PRL-F/PRL-R三种引物对三种阳性质粒混合物pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL的共扩增结果（222bp、124 bp、308bp），M为100bp DNA Ladder。

图2所示为内标多重PCR的特异性试验结果，其中，1为阴性对照；2为Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R、PRL-F/PRL-R三种引物对三种阳性质粒混合物pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL的共扩增结果（222bp、124 bp、308bp），3-7为Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R、PRL-F/PRL-R三种引物对感染牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等阳性牛组织核酸样品扩增结果，M为100bp DNA Ladder。   

图3所示为PCR灵敏性试验结果，其中，A为引物GRA-F/GRA-R对7×10⁹-7×10¹拷贝/μL系列稀释的阳性质粒pMD-GRA6 单重PCR扩增结果（124bp），B为引物GRA-F/GRA-R 、Nc-F/Nc-R对7×10⁹-7×10¹拷贝/μL系列稀释的阳性质粒pMD-GRA6 和pMD-Nc5 双重PCR扩增结果（124bp、222bp），C为Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R、PRL-F/PRL-R三种引物对7×10⁹-7×10¹拷贝/μL系列稀释的阳性质粒pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL的共扩增结果（222bp、124 bp、308bp），其中，M为100bp DNA Ladder，1-9为7×10⁹-7×10¹拷贝/μL系列稀释的三种阳性质粒混合物，10为阴性对照 。 

图4所示为内标的抑制性试验结果，其中，1-9. 7×10⁹-7×10¹拷贝/μL系列稀释的pMD-Nc5、pMD-GRA6分别与7×10⁷拷贝/μL pMD-PRL的阳性质粒混合物的共扩增结果（222bp、124 bp、308bp），10.阴性对照，M为DL2000 marker。 

图5 所示为内标多重PCR重复性试验结果，其中，1为阴性对照，2-4为Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R、PRL-F/PRL-R三种引物对阳性质粒pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL的重复性共扩增结果（222bp、124 bp、308bp），M为100bp DNA Ladder。 

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施。

本发明中参照基因库中GenBank登录号为X84238.1的新孢子虫 Nc-5基因、GenBank登录号为HM776942.1的弓形虫GRA6基因和GenBank登录号为AF426315.1的牛催乳素PRL基因序列设计引物，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。

本发明中选用的阳性核酸、样品：犬新孢子虫和刚地弓形虫阳性核酸，由中国农业大学动物医学院获得，牛抗凝全血和肝脏、肾脏、流产胎儿等样品采自新疆不同地区；感染牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等阳性组织核酸样品由新疆出入境检验检疫局技术中心保存；牛催乳素PRL基因由新疆出入境检验检疫局技术中心保存的牛全血中获得。以上样品本领域普通技术人员也可通过公众渠道途径获得。

本发明中选用的主要试剂：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、10×buffer（包括Tris-HCl(pH8.4) 200mmoL/L、KCl200mmol/L、(NH₄)SO₄ 100mmol/L）、dNTP、Mg²⁺、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒、血液基因组DNA提取系统和DNAZol，购自天根生物技术（北京）有限公司；DL 2000 DNA Maker、100bp DNA Ladder购自鼎国昌盛生物技术（北京）有限责任公司；限制性内切 酶 EcoR I、pMD18-T载体等，购自宝生物工程（大连）有限公司；本发明采用抗凝全血按照血液基因组DNA提取系统说明书进行操作提取核酸，这是本领域常见做法。

本发明中选用的主要仪器：高速冷冻离心机（HITACHI CF16RX Ⅱ）、微量加样器（Eppendorf）、梯度PCR仪（Biometra）、电泳仪（ Bio-RAD MODEL200）、凝胶成像系统（INTASUXDT-40SM-15K）、微量核酸蛋白检测仪（Nano Drop ND1000）等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒的制备

牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒，所述的内标多重PCR检测试剂盒通过如下具体方法获得。

（1） 引物的设计与合成

依照GenBank登录号为X84238.1的新孢子虫 Nc-5基因、GenBank登录号为HM776942.1的弓形虫GRA6基因和GenBank登录号为AF426315.1的牛催乳素PRL基因，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为222 bp、124 bp和308 bp。 

（2） 模板DNA的制备与阳性重组质粒的构建 

按照抗凝全血血液基因组DNA提取系统进行操作提取核酸，肝脏、肾脏、流产胎儿等组织经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20 ℃保存备用。

本发明中，阳性重组质粒的构建以犬新孢子虫阳性核酸为模板，用引物Nc-F和Nc-R扩增出长度为222 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-Nc5。

本发明中，阳性重组质粒的构建以弓形虫阳性核酸为模板，用引物GRA-F和GRA-R扩增出长度为124 bp的片段，该片段克隆至pMD-18T载体，得到目标模板pMD-GRA6。

本发明中，阳性重组质粒的构建以牛催乳素PRL阳性核酸为模板，用引物PRL-F和PRL-R扩增出长度为308 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-PRL。   

（3） 内标多重PCR扩增体系的建立 

本发明采用 20μL反应体系：10×buffer 2.0 uL，dNTP浓度分别为2.5、2.0、1.5和1.0 mmol/L，引物浓度分别为0.75、0.50、0.25和0.125 μmol/L，Mg²⁺ 浓度分别为2、1.5、1.0 和 0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶分别为1.75、1.5、1.25、1.0、0.75和0.5U，退火温度分别为55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃和 60 ℃，循环参数分别为30、35和40；经优化一项时其他项参数不变，分别进行Nc-5、GRA6、PRL基因单重PCR反应条件的优化，优化后的内标多重PCR反应条件为：10×buffer 2.0 uL，dNTP 浓度为2.0 mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL三个基因所对应的上下游引物浓度分别为0.125 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，Mg²⁺ 浓度为1.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA 2μL，补去离子水至20 μL体系；扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃，30 s 58 ℃，45s 72 ℃，30 s 30个循环；最后经 72 ℃ 延伸10 min；试验检测结束后，用浓度为25 g/L的琼脂糖凝胶电泳，100V，60min，观察结果，在同一反应管中分别扩增出大小为222 bp、124 bp和308bp的电泳条带，与目的序列片段相符。

（4） 试剂盒的组成

根据本专业通用做法，本发明按可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，根据上述3中一个反应体系各成分的浓度，经计算，组装的试剂盒反应体系包括：0.5 mL PCR扩增试剂，包含Tris-HCl(pH8.4) 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L；5U/uL Taq DNA聚合酶75U；去离子水1.0mL。

（5）试剂盒反应条件和扩增条件

依据上述步骤（3），试剂盒反应条件为：PCR扩增试剂10 μL，DNA 2μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，补去离子水至25uL；扩增条件同上述步骤（3）。

通过上述方法提供的牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mL PCR扩增试剂混合液，包括Tris-HCl pH8.4， 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL Taq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：

（1）新孢子虫检测引物：

上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG

下游引物（Nc-R）：CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG

可以扩增GeneBank登录号为X84238.1，469-690位犬新孢子虫的Nc-5基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.1；

（2）弓形虫检测引物：

上游引物（GRA-F）：ATGATACAACCTCCGAAGCG

下游引物（GRA-R）：CGTCTTGTGCCCTGTTCTTC

可以扩增GeneBank登录号为HM776942.1，265-388位刚地弓形虫的GRA6基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.2；

（3）监控内标检测引物：

上游引物（PRL-F）：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC

下游引物（PRL-R）：CAATCTCTATGGCCCTCGA  

可以扩增GeneBank登录号为AF426315.1，8142-8449位牛催乳素PRL基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.3。

实施例二：模板的制备与阳性重组质粒的构建

1.引物和探针的设计与合成

本发明的引物代号、序列、位置见表1，其中，参照基因库中新孢子虫 Nc-5基因（GenBank登录号：X84238.1）、弓形虫GRA6基因（GenBank登录号：HM776942.1）和牛催乳素PRL基因（GenBank登录号：AF426315.1）序列设计引物，扩增的目的片段长度分别为222 bp、124 bp和308 bp，具体参见附后的基因序列表；本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。

表1 内标多重PCR引物设计结果

2. 模板DNA的制备与阳性重组质粒的构建

2.1模板DNA的制备

抗凝全血按照血液基因组DNA提取系统说明书进行操作提取核酸，肝脏、肾脏、流产胎儿等组织经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20 ℃保存备用。

2.2 阳性重组质粒的构建

 以犬新孢子虫阳性核酸为模板，用引物Nc-F/Nc-R扩增出长度为222 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-Nc5；以弓形虫阳性核酸为模板，用引物GRA-F/GRA-R扩增出长度为124 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-GRA6；以牛催乳素PRL阳性核酸为模板，用引物PRL-F/PRL-R扩增出长度为308 bp的片段，该片段克隆至pMD18-T载体，得到目标模板pMD-PRL。    

2.3 各引物对模板位置及PCR扩增部分序列如下：

新孢子虫Nc-5基因扩增序列，如SEQ ID NO.1：

GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTGTTGGGCGCAGCCTGCGGCAGCAAGGCTCCTTTTTGTTTGTGACTATAGTGTGTGAACGGGTGAACCGAGGGAGTTGGTAGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGGTTTGTGGTTAGTCATTCGTCACGTTGAAATCAGCCTGCGTCAGGGTGAGGACAGTGTGTCAATGATACTTATCGAGAGTTCAGTGTTCTGTGTTGAG

弓形虫GRA6基因扩增序列，如SEQ ID NO.2：

ATGATACAACCTCCGAAGCGGCGGAGGGCGACGTTGACCCTTTTCCCGTGCTGGCGAATGAGGGGAAGTCGGAGGCGCGTGGCCCGTCGCTCGAGGAAAGAATCGAAGAACAGGGCACAAGACG

牛催乳素PRL基因扩增序列，如SEQ ID NO.3：

TCAGCAAAGTATAAACCGATAGCTTACATTTTATAATTTTGCAACCTTCAAAAAATTTTCAATACATATAGGAAAAACCAGGAGTTTTTTAGGTCAATCACTCTGAGCAAAAATCACATGTTACCAAATCCACTGAATTATGCTTATTTTAATGAGATTGTTTCTTGTGGTCGTTCAGCATGAAGTCCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTGCGCTCTTGGAATGACCCTCTGTATCACCTAGTCACCGAGGTACGGGGTATGAAAGGAGCCCCAGATGCTATCCTATCGAGGGCCATAGAGATTG

以上划线部分为引物结合位置。

实施例三：内标多重PCR扩增体系的建立

1．单重PCR反应的优化

采用 20μL反应体系：10×buffer 2.0 uL，dNTP浓度分别为2.5、2.0、1.5和1.0 mmol/L，引物浓度分别为0.75、0.5 、0.25和0.125 μmol/L，Mg²⁺ 浓度分别为2、1.5、1.0 和 0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶分别为1.75、1.5、1.25、1.0、0.75和0.5U，退火温度分别为55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃和 60 ℃，循环参数分别为30、35和40。优化一项时其他项参数不变。优化后的单重PCR反应条件：10×buffer 2.0 uL，dNTP浓度为1.5 mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL引物浓度均为0.5 μmol/L，Mg²⁺ 浓度为0.5 mmol/L，TaqTaq DNA聚合酶1.0 U，DNA 2μL，补去离子水至20 μL体系；扩增条件为：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，58 ℃，45 s，72℃，30s，35个循环；最后经 72 ℃ 延伸10 min。不同的反应管中分别扩增出大小为124 bp、222 bp和308 bp的电泳条带，与目的片段相符。

2.双重PCR 反应条件的优化 

在单重PCR最佳反应条件前提下，用Nc-5、GRA6基因的上下游引物于一个反应管中同时进行双重PCR扩增，同1.2.3进行反应条件的优化和观察结果。优化后的双重PCR反应条件为：1×buffer，dNTP 1.5 mmol/L，Nc-5、GRA6引物浓度均为0.25 μmol/L，Mg²⁺ 浓度为1.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，DNA 2μL，去离子水补足20μL体系；扩增条件为：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，58 ℃，45s，72 ℃，30 s，35个循环；最后经 72 ℃ 延伸10 min。在同一反应管中分别扩增出大小为222 bp和124 bp的电泳条带，与目的片段相符。

3.内标多重PCR 反应的优化 

在双重PCR最佳反应条件前提下，用Nc-5、GRA6和PRL三个基因的三对引物于同一个反应管中进行内标多重PCR扩增，同2.1、2.2进行反应条件的优化和观察结果。

优化后的内标多重PCR反应条件为：10×buffer 2.0 uL，dNTP 浓度为2.0 mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL三个基因所对应的上下游引物浓度分别为0.125 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，Mg²⁺ 浓度为1.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA 2μL，去离子水补足20 μL体系；扩增条件同上。在同一反应管中分别扩增出大小为222 bp、124 bp和308bp的电泳条带，与目的片段相符。

参见附图1，同一反应体系中，以pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL等浓度的阳性混合质粒为模板，用相应的引物分别进行单重PCR和内标多重PCR扩增，均得到各自的目的条带，且各引物对各自基因具有较好的特异性。

实施例四：特异性检测

以实施例一中的多重反应体系和扩增条件分别扩增了牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等阳性牛组织核酸样品，被测样品均为阴性，说明方法具有较好的特异性，参见附图2。

应用本发明所建立的多重 PCR方法对三种等浓度混合的阳性重组质粒进行扩增，结果扩增出大小分别为 222 bp、124 bp和308bp的特异性条带，而对试验室保存的牛传染性鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛伊氏锥虫等牛组织阳性核酸样品除扩增出内标PRL基因308bp的条带，未出现其它条带，说明该方法具有较强的特异性。

实施例五：灵敏度检测

当pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL三种模板同时扩增时，会竞争酶、引物和dNTP，对扩增产生影响，应该重新研究共扩增体系的反应条件和检测低限。 

将已知浓度的pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL进行7×10⁹-7×10¹拷贝/μL梯度稀释后等量混合，用内标多重PCR方法进行扩增，同时以实施例一中的单重PCR方法和双重PCR方法进行同步检测，以确定该方法的灵敏度。反应体系和扩增条件同实施一。结果显示，内标多重PCR方法对两种基因的最低检测限为7×10³ 拷贝/反应。而单重PCR对每种基因的最低检测限均为7×10²拷贝/反应，双重PCR方法对两种基因的最低检测限为7×10³拷贝/反应。结果表明，内标PRL基因对本研究所建立的内标多重PCR检测体系的灵敏度几乎没有影响。参见附图3。 

实施例六：内标的抑制性试验

固定pMD-PRL的浓度为7×10⁷拷贝/μL不变，将已知浓度的pMD-Nc5、pMD-GRA6进行7×10⁹-10¹拷贝/μL梯度稀释后分别与之等量混合，用实施一中的内标多重PCR 方法进行扩增，并用实施三中的双重PCR方法进行同步检测，以验证内标的抑制性。反应体系和扩增条件同实施一和三。结果显示，内标多重PCR方法对Nc-5、GRA6两基因的最低检测限为7×10³ 拷贝/反应，这与同步进行的双重PCR方法的最低检测限相同，表明内标PRL基因对本研究所建立的内标多重PCR检测体系几乎没有抑制。参见附图4。 

实施例七：重复性检测  

以实施例一中的反应体系和扩增条件分别对7×10⁷拷贝/μL pMD-Nc5、pMD-GRA6和pMD-PRL阳性重组质粒为模板，进行3次重复检测，验证其稳定性。结果表明该方法具有很好的重复性和稳定性。参见附图5。

实施例八：试剂盒的组装

经上述实施例提供的反应体系和扩增条件优化后，组装检测试剂盒，根据本专业通用做法，本发明按可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，依据实施例三中一个反应体系的浓度，组装的试剂盒反应体系包括：0.5 mL PCR扩增试剂，包含Tris-HCl(pH8.4) 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L；5U/uL Taq DNA聚合酶75U；去离子水1.0mL。

依据实施例三，试剂盒反应条件为：PCR扩增试剂12.5μL，DNA 2μL，Taq酶0.3μL，补去离子水至25uL；扩增条件同上述实施例三。

按实施例四、例五和例七分别对试剂盒特异性、灵敏度和重复性进行验证，均与实施例四、例五和例七结果相同。

实施例九：对临床样品的检测

利用本发明的检测试剂盒分别对采自新疆五个不同地区的五个牛场随机采集的157 份流产牛全血、血清及肝脏、肾脏、流产胎儿牛组织等样品进行检测。结果显示，各地区所采集的样品中，有四个牛场存在弓形虫感染，有两个牛场存在新孢子虫感染。利用双重PCR方法检测到牛新孢子虫病阳性样品9份，阳性检出率为5.7 %，牛弓形虫病阳性样品20份，阳性检出率为12.7 %，混合感染样品8份，阳性检出率5.1%。利用该试剂盒检测到牛新孢子虫病阳性样品10份，阳性检出率为6.4 %，牛弓形虫病阳性样品20份，阳性检出率为12.7 %，混合感染样品9份，阳性检出率5.7 %。同时发现，上述样品中有4份样品无任何扩增条带，表明存在基因丢失或扩增过程中有抑制成分的存在，经重新提取核酸检测后，均得到了预期结果，且有一份样品新孢子虫病检测为阳性，进一步证明了该内标的监控作用。

序列表

<110>  新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

<130>  一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

<160>  3 

SEQ ID NO.1

<210>  1

<211>  222

<212>  DNA

<213> Neosporacaninum

<400>  1

gttgctctgc tgacgtgtcg ttgttgggcg cagcctgcgg cagcaaggct cctttttgtt    60

tgtgactata gtgtgtgaac gggtgaaccg agggagttgg tagcggtgag aggtgggata   120

cgtggtttgt ggttagtcat tcgtcacgtt gaaatcagcc tgcgtcaggg tgaggacagt   180

gtgtcaatga tacttatcga gagttcagtg ttctgtgttg ag                      222

SEQ ID NO.2

<210>  2

<211>  124

<212>  DNA

<213>  Toxoplasma

<400>  2

atgatacaac ctccgaagcg gcggagggcg acgttgaccc ttttcccgtg ctggcgaatg    60

aggggaagtc ggaggcgcgt ggcccgtcgc tcgaggaaag aatcgaagaa cagggcacaa   120

gacg                                                                124

SEQ ID NO.3

<210>  3

<211>  308

<212>  DNA

<213>  Bovine

<400>  3

tcagcaaagt ataaaccgat agcttacatt ttataatttt gcaaccttca aaaaattttc        60

aatacatata ggaaaaacca ggagtttttt aggtcaatca ctctgagcaa aaatcacatg     120

ttaccaaatc cactgaatta tgcttatttt aatgagattg tttcttgtgg tcgttcagca        180

tgaagtcctt atgagcttga ttcttgggtt gctgcgctct tggaatgacc ctctgtatca       240

cctagtcacc gaggtacggg gtatgaaagg agccccagat gctatcctat cgagggccat   300

agagattg                                                                               308