虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的试剂盒及其检测方法。本发明含有10×等温反应缓冲液、AMV 5U/μL、Rnasin 20U/μL、Bst DNA聚合酶8U/μL、10mM dNTP、25mM硫酸镁、20μM内引物1、20μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2、30μM环引物1、30μM环引物2和5M甜菜碱的反应液A和反应液B：1000×的荧光染料SYBR GreenI。通过对组织样品或细胞培养液中RNA提取、传染性胰腺坏死病毒的环介导等温扩增、扩增产物的显色检测等方法，从而实现对传染性胰腺坏死病毒的快速检测。本技术解决了现有检测技术检测时间长、操作复杂、需要昂贵仪器等缺点，适用于养殖场、兽医站等的快速现场检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的试剂盒及其使用方法。

背景技术

传染性胰腺坏死病是由传染性胰腺坏死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起的鲑科鱼类的急性传染病，虹鳟稚鱼的死亡率高达90%以上。1984年该病在我国西北地区某虹鳟鱼场爆发流行，稚鱼死亡率高达99.65%，而后国内的流行情况偶见报道。同时IPNV常发病于大量养殖鲑鳟鱼类的国家，如美国、日本、加拿大和欧洲等国。鉴于此病在世界上养殖鲑鳟鱼类的国家大面积发生且危害巨大，建立一种特异敏感的检测方法，进行该病的诊断和监测显得特别重要。

国外常用的虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒检测方法为补体结合试验、血清中和试验、免疫荧光试验等，相对耗时比较长、技术要求高、工作量大。而目前普遍采用的RT-PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点，但是RT-PCR法容易交叉污染、操作繁琐和需要价格较高的PCR仪等专业设备等缺点而限制了其应用。实时定量PCR技术虽然解决了常规RT-PCR检测方法的交叉污染问题，并简化了操作步骤，但却需要更昂贵的实时定量PCR设备，且PCR荧光探针的成本也较高，大大限制了其应用。

 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplication，LAMP）技术是Notmi等（2000年）开发出来的一种连续、恒温、基于酶反应的新型核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计两对特殊的内、外引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）在恒温（60～65℃）条件下启动循环链置换反应。在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应液中的Mg²⁺结合，形成副产物焦磷酸镁呈现乳白色沉淀，加入显色液即可肉眼观察判断沉淀与否。4条引物针对靶序列的6个特异性区域识别，保证了LAMP方法的高度特异性；本方法可检测到只及PCR法的1/10～1/100的拷贝数，灵敏度高；LAMP反应只需在恒定温度下反应即可，不需要预先的DNA变性等步骤，耗时短；本方法也不需要昂贵的仪器设备，只需一台水浴锅，投资小。因此，LAMP法检测非常适合于基层单位的检测需要。

发明内容

本发明的一个目的是解决现有技术中检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒所需周期长、现场应用困难、特异性低和灵敏性低的问题，提供一种基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplication，LAMP）技术检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的检测试剂盒及方法，可广泛用于虹鳟鱼养殖场、基层检测单位等的现场疾病诊断。

 本发明的技术方案是：

根据GenBank中所公布的来源于欧洲和亚太地区的多株传染性胰腺坏死病毒的核酸序列中同源性较高的部位，设计并合成环介导等温扩增用所用的特异性引物组。该引物组在实际应用中可实现对临床虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒特异性诊断。对该引物组进一步开发成虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒。

一种虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

（1）反应液A：含有10×等温反应缓冲液、AMV 5U/μL、Rnasin 20U/μL、Bst DNA聚合酶8U/μL、10mM dNTP、25mM硫酸镁、20μM内引物1、20μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2、30μM环引物1、30μM环引物2和5M甜菜碱，其中：

    10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 8.8）、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%的曲拉通X-100。

内引物1：(SEQ ID NO:1)

TCGGGGTCATACTTGCCATAGCTTTTCTGATCCCCAACCCAGAAC

内引物2：(SEQ ID NO:2)

ATGATCCTGTCCCACAGGGAGGTTTTCGCTCCTTGTACTCCTCAGT

外引物1：GCTGGAGTGTCCAACTACG(SEQ ID NO:3)

外引物2：GGAGAAGTCGGTGATCTCGT(SEQ ID NO:4)

环引物1：GCTTGACTCTTGTGATCGGCTT(SEQ ID NO:5)

环引物2：TTCTTCAGGAAACGGCAATGT(SEQ ID NO:6)

 （2）反应液B：1000×的荧光染料SYBR GreenI。

本发明的另一个技术方案是：

一种虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒检测虹鳟鱼传染性胰

腺坏死病毒方法，其步骤包括：

（1）样品中RNA的提取

病鱼采取肾脏、脾脏等部位，加入适量无菌水，研磨器研磨至匀浆液，－20℃至室温反复冻溶2次以上，5000rpm/min离心5min，取上清备用；

病毒感染细胞液：可直接用于提取RNA。

A、在1.5ml离心管中加入被测样品400μl，加入600μl Trizol，剧烈振荡混匀，加入400μl氯仿，颠倒混匀，－20℃作用10min，13000rpm/min离心10min；

B、小心吸取上清600μl至新的离心管，加入600μl预冷异丙醇，颠倒混匀，常温沉淀15min；

C、13000rpm/min离心10min，小心倒去上清，加入1000μl预冷的75％乙醇洗沉淀，再小心倒去乙醇，13000rpm/min离心30S，用枪头小心吸弃残留乙醇，开盖挥发乙醇2min，加入25μl DEPC处理水溶解RNA，-20℃冰箱保存备用；

（2）虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的等温环介导扩增

在装有23μl反应液A的反应管中加入2μl待检RNA，于65℃恒温水浴锅中放置40min；

（3）扩增产物的显色检测

在上述反应管中加入1μl反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒，若颜色为黄色，则说明待检样品中不含有虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒。

 本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明根据GenBank中所公布的来源于多种欧洲株和亚太地区株的传染性胰腺坏死病毒的核酸序列中同源性较高的八个序列部位设计了六条环介导等温扩增所用的特异性引物组。并依据此引物组建立了一种虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明采用LAMP技术，特异性强，比目前普遍采用的PCR检测方法有更高的灵敏度，同时也不需要昂贵的PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪等设备，仅采用一台水浴锅即可，特别适于基层单位的推广应用。

具体实施方式

下面对本发明的试剂盒和检测方法进行具体的描述。

实施例1  扩增引物组的获得

根据传染性胰腺坏死病毒基因组序列中相对保守的VP2/NS区设计的环介导恒温扩增用引物组。从GenBank数据库中下载9株来源于世界不同地区的传染性胰腺坏死病毒的核酸序列，对应Accession Number如下：AF342729、M18049、AY379740、DQ536090、D00701.1、HQ833318.1、L40583.1、HQ833319、NC_001915.1。利用序列分析软件Clustal X进行同源性比较，在同源性最高的八个区域用在线的PrimerExplorer V4生物软件设计环介导恒温扩增用引物，并利用Primer Premier 5.0生物软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项参数的具体分析，最终确定本发明的6条环介导恒温扩增用引物组，并进一步以其为核心制备检测试剂盒。

实施例2 虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒

按下列配方制作虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒：

1、LAMP反应液A：含有10×等温反应缓冲液、AMV 5U/μL、Rnasin 20U/μL、Bst DNA聚合酶8U/μL、10mM dNTP、25mM硫酸镁、20μM内引物1、20μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2、30μM环引物1、30μM环引物2和5M甜菜碱，其中：10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 8.8）、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%的曲拉通X-100；

内引物1：(SEQ ID NO:1)

TCGGGGTCATACTTGCCATAGCTTTTCTGATCCCCAACCCAGAAC

内引物2：(SEQ ID NO:2)

ATGATCCTGTCCCACAGGGAGGTTTTCGCTCCTTGTACTCCTCAGT

外引物1：GCTGGAGTGTCCAACTACG(SEQ ID NO:3)

外引物2：GGAGAAGTCGGTGATCTCGT(SEQ ID NO:4)

环引物1：GCTTGACTCTTGTGATCGGCTT(SEQ ID NO:5)

环引物2：TTCTTCAGGAAACGGCAATGT(SEQ ID NO:6)

环介导等温扩增（LAMP）反应液A管每管23μL，最佳配比为： 2.5μL 10×等温反应缓冲液、1.0μL AMV （5U/μL）、1.0μL Rnasin （20U/μL）、1.0μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）、3.5μL 10mM dNTP、5μL 25mM硫酸镁、1.0μL 20μM内引物1、1.0μL  20μM内引物2、0.5μL 10μM外引物1、0.5μL 10μM外引物2、0.5μL 30μM环引物1、0.5μL 30μM环引物2、5.0μL 5M甜菜碱；

2、反应液B：1000×的荧光染料SYBR GreenI。

实施例3 虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒方法

上述虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒检测虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒方法，其步骤包括：

1、样品中RNA的提取

病鱼采取肾脏、脾脏等，加入适量无菌水，研磨器研磨至匀浆液，－20℃至室温反复冻溶2次以上，5000rpm/min离心5min，取上清备用；

病毒感染细胞液：可直接用于提取RNA；

A、在1.5ml离心管中加入被测样品400μl，加入600μl Trizol，剧烈振荡混匀，加入400μl氯仿，颠倒混匀，－20℃作用10min，13000rpm/min离心10min；

B、小心吸取上清600μl至新的离心管，加入600μl预冷异丙醇，颠倒混匀，常温沉淀15min；

C、13000rpm/min离心10min，小心倒去上清，加入1000μl预冷的75％乙醇洗沉淀，再小心倒去乙醇，13000rpm/min离心30S，用枪头小心吸弃残留乙醇，开盖挥发乙醇2min，加入25μl DEPC处理水溶解RNA，-20℃冰箱保存备用；

2、虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒的等温环介导扩增

在装有23μl反应液A的反应管中加入2μl待检RNA，于65℃恒温水浴锅中放置40min；

3、扩增产物的显色检测

在上述反应管中加入1μl反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒，若颜色为黄色，则说明待检样品中不含有虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒。

实施例4 虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒的敏感性检验

将提取的1μg传染性胰腺坏死病毒VR299株的RNA按10倍梯度稀释，采用本发明的虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法进行检测，同时设立常规的虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-PCR检测方法作为对照（上游引物：ATCTGCGGTGTAGACATCAAAG，下游引物：TGCAGTTCCTCGTCCATCCC，扩增程序：50℃孵育1h，94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，72℃5min，35个循环）。结果表明在1μg样品RNA稀释到10¹³次方时，依然能检测到信号，说明本试剂盒具有极高的灵敏性。而常规PCR稀释到10⁶次方时就无信号了。

实施例5 虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒的特异性检验

利用虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒对虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒（IPN）及虹鳟鱼常见的其他病毒如鱼出血性败血病病毒（VHS）、鱼传染性造血器官坏死病毒（IHN）进行检测；

具体操作同实施例3的具体方法，结果显示，本发明的试剂盒中仅对虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒（IPN）有特异性检测结果，对其他病原微生物检测均为阴性，说明本发明的试剂盒特异性良好。

实施例6 虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒对临床样品的检测

采集临床上怀疑虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒感染的病料20份，分别利用本试剂盒按实施例3的具体方法进行检测。同时分别对20份病料研磨、滤菌后上CHSE细胞进行病毒分离、鉴定；

结果表明，本试剂盒检测20份虹鳟鱼病料中有5份虹鳟鱼传染性胰腺坏死病毒阳性，与CHSE细胞分离病毒结果一致。