糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，该分析法包括：①固相抗体制备；②镧系元素离子标记抗体制备；③在步骤①制得的具有固相抗体的固相材料中，加入糖类抗原19-9标准品或待测样品，以及反应缓冲液，经孵育、洗涤固相材料后，加入稀释的标记抗体，再次孵育后进行荧光检测；本发明还提供相应的试剂盒。本发明具有较高的灵敏度、特异性、稳定性，而且检测时间短，检测CA19-9国家质控品符合率高的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，特别是涉及一种糖类抗原19-9时间 分辨免疫荧光分析法及试剂盒，并涉及使用混合标记抗体解决糖类抗原19-9(CA19-9)国家 质控品符合率的问题。

背景技术

CA19-9是一个消化道肿瘤相关糖类抗原，由胃肠上皮粘膜细胞分泌，分子量约5000KD， 其结构为Lea血型抗原物质与唾液酸Lexa的结合物，CA19-9检测对消化道恶性肿瘤有较高 的诊断价值，特别是对胰腺癌、胆囊胆管癌及肝癌具有较高阳性率；胰腺癌阳性率可高达85 ％-95％。CA19-9常用于治疗后的跟踪监控，当CA19-9持续升高时，提示肿瘤可能有残留或 者转移。某些乳腺癌、卵巢癌等肿瘤患者也会出现CA19-9的升高。

目前血清CA19-9检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂 性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有 效期短，此外还有一定的放射性污染。

时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧 光特性的镧系元素，代替霉、同位素等，作为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度 高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。然而，对CA19-9进行 时间分辨免疫荧光分析还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒。 通过本发明的方法，能解决现有技术中关于CA 19-9检测国家质控血清时存在的准确度不够 的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明的糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法，采用双标记的 方法，即分别用镧系元素离子标记CA19-9单克隆抗体A和CA19-9单克隆抗体B，然后混合 使用，其中，本发明具体的分析方法，包括步骤：

①固相抗体制备

将抗糖类抗原19-9单克隆抗体稀释后，作为包被液，包被固相材料，形成具有固相抗体 的固相材料；

②镧系元素离子标记抗体制备

选用配对抗糖类抗原19-9单克隆抗体2株，分别为第一抗糖类抗原19-9单克隆抗体和 第二抗糖类抗原19-9单克隆抗体，用常规方法进行镧系元素离子分别标记，形成标记抗体A、 B；根据CA19-9的质控品赋值，按比例混合标记后的抗体A、B，其中该标记抗体A、B与步 骤①抗体分别结合糖类抗原19-9不同的抗原决定簇，从而形成夹心复合物；

③在步骤①制得的具有固相抗体的固相材料中，加入糖类抗原19-9标准品或待测样品， 以及反应缓冲液，经孵育、洗涤固相材料后，加入稀释的混合标记抗体(标记抗体A、B的混 合物)，再次孵育后进行荧光检测。

所述步骤①中，具体制备步骤，包括：

(1)将抗糖类抗原19-9单克隆抗体用包被缓冲液稀释至抗体浓度为1.0～10.0μg/ml，作 为包被液，与固相材料接触并静置5～24小时；

其中，包被缓冲液包括：pH 9.3-9.7的50mM碳酸盐缓冲溶液；

固相材料包括：微孔反应条、或由微孔反应条形成的微孔反应板；

(2)用含表面活性剂的缓冲液，洗涤步骤(1)制备的抗体包被的固相材料后，加入含封 闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

其中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液，而 50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

含封闭蛋白的缓冲液，包括：含0.5％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲 液；

(3)弃去含封闭蛋白的缓冲液，干燥固相材料，完成固相抗体制备。

所述步骤②中，镧系元素离子包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Tb³⁺等，优选为Eu³⁺。形成镧系元 素离子的试剂(如DTTA-Eu)与抗糖类抗原19-9单克隆抗体的质量比为1∶2-1∶1。

所述步骤③中，糖类抗原19-9标准品的制备方法为：先分别将糖类抗原19-9稀释至所 需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得糖类抗原19-9标准品；其中，该标 准品优选为用含20％小牛血清、0.1％NaN₃的生理盐水将糖类抗原19-9配制成标准品；

反应缓冲液包括：pH 7.6-8.0的50mmol/L Tris-HCl，内含0.9％NaCl、2％BSA、0.05％ 牛IgG、0.1％Tween-20和0.1％NaN₃；

孵育、洗涤固相材料中，在20-25℃(室温)孵育1～2h后，采用含表面活性剂的缓冲 液的稀释液作为洗涤液，洗涤固相材料，其中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20 的50mM pH7.8TSA缓冲液，而50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％BSA、 16％的蔗糖。

含表面活性剂的缓冲液的稀释液，是将含表面活性剂的缓冲液与水以体积比为1∶24的比 例稀释；

稀释的混合标记抗体，是先将单独标记好的抗体A和B按照质量比3∶1的比例混合至使 用浓度的20倍，再将混合后的标记抗体用反应缓冲液以体积比为1∶20稀释；稀释的标记抗 体总浓度(标记抗体A和B)为1-5μg/ml。

再次孵育中，在20-25℃(室温)孵育1～2h。

另外，再次孵育之后，经再次洗涤固相材料(含表面活性剂的缓冲液的稀释液洗涤)后， 可加入增强液进行荧光检测，其中，增强液为含1.0％冰乙酸和2.0％邻苯二甲酸氢钾的缓冲液， pH 3.0-4.5，该缓冲液中同时含有0.4％β-萘基甲酰三氟丙酮(β-NTA)，2％三正辛基氧膦 (TOPO)，0.1％Triton X-100。

根据上述方法，本发明还提供了一种糖类抗原19-9定量检测试剂盒，包括：包被抗糖类 抗原19-9单克隆抗体的固相材料，反应缓冲液，镧系元素离子标记的抗糖类抗原单克隆抗体 (混合的标记抗体A、B)，糖类抗原19-9标准品。

所述试剂盒，还包括：洗涤液(上述的含表面活性剂的缓冲液的稀释液)、增强液。

本发明中，采用的包被的固相材料为特异性抗体包被的固相材料，并使用双抗体夹心法， 通过试剂准备、加样反应、洗涤拍干、加增强液、测荧光值等步骤进行检测，具有如下有益 效果：

1)具有较好的稳定性，且分析灵敏度高(＜1U/ml)；

2)检测时间短(185min)；

3)特异性好，与干扰物质的交叉反应小；

4)检测CA19-9国家质控品时符合率高。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明的采用双抗体夹心二步法的反应原理图，其中，A为抗人CA 19-9单抗包 被于96孔荧光微孔板，与标准品或样品中的CA 19-9抗原；B为标准品或样品中的CA 19-9 抗原与包被单抗于微孔内表面发生免疫反应后，并洗涤；C为加入铕离子(Eu³⁺)标记的混合 抗CA 19-9单抗，进行免疫反应后，微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记的抗CA 19-9单 抗通过洗涤分离；D为微孔表面免疫复合物中的Eu³⁺被荧光增强液解离后，形成稳定的荧光配 合物，荧光强度与标准品或样品中的CA 19-9抗原浓度呈正比例，通过剂量-反应曲线可得出 样品中CA 19-9抗原浓度；

图2是本发明的操作流程图，其中，a为稀释待测样品，b为加入标准品和待测样品，c 为加入反应缓冲液，d为孵育，e为洗板，f为加入稀释后的铕标记物，g为孵育，h为洗板， i为加入增强液，j为检测。

具体实施方式

实施例：糖类抗原19-9(CA 19-9)测定

1、标准品配制

用含20％(v/v)小牛血清、0.1％NaN₃(w/v)的生理盐水将购于Hytest公司的糖类抗原 19-9配制成0、15、50、100、200、500U/ml标准液。分装，于2～8℃保存。

2、包被微孔反应条的制备

(1)将纯化的抗糖类抗原19-9单克隆抗体(购于Hystest公司)用pH 9.3-9.7的50mM 碳酸盐缓冲液稀释至1～10μg/ml(本实施例中，采用了4ug/ml)，然后按100μl/孔量 加入微孔反应条各孔内，静置5～24小时；

(2)用含表面活性剂的缓冲液，洗涤步骤(1)制备的抗体包被的微孔反应条后，加入 含封闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时，进行封闭；

其中，含表面活性剂的缓冲液，是含0.1％(V/V)Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液， 而50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、 16％(w/v)的蔗糖；

含封闭蛋白的缓冲液，是含0.5％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween-20的50mM pH7.8 TSA缓冲液；

(3)弃去含封闭蛋白的缓冲液，干燥微孔反应条，获得抗糖类抗原19-9单克隆抗体包被 的微孔反应条；

(4)将抗糖类抗原19-9单克隆抗体包被的微孔反应条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷 藏备用。

3、铕标记的抗糖类抗原19-9单克隆抗体的制备

(1)取待标记抗体(第一、二抗糖类抗原19-9单克隆抗体，分别购于Scipac和Meridian 公司)分别加入透析袋中，放入配制好的pH 9.4-9.6的50mM碳酸盐缓冲液中，室温透析过 夜；

(2)次日，取出抗体，分别稀释至0.2～5mg/ml，按质量比为1∶1的比例(DTTA-Eu： 抗体，即DTTA-Eu∶第一抗糖类抗原19-9单克隆抗体为1∶1，DTTA-Eu∶第二抗糖类抗原19-9 单克隆抗体为1∶1)，边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡10分钟，然后在黑 暗中静置24小时；

(3)将分别标记好的第一抗糖类抗原19-9单克隆抗体(标记好的抗体A)和第二抗糖 类抗原19-9单克隆抗体(标记好的抗体B)与游离DTTA-Eu通过Sephadex G50色谱柱(1× 50cm)分离，分离过程用核酸蛋白仪监控；

(4)用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在280nm处测吸光度，同时测荧 光强度，计算出Eu标抗体浓度；标记抗体浓度一般为0.1mg/ml；

(5)用0.2μm的过滤器过滤；

(6)将标记好的抗体A和抗体B按照质量比3∶1混合。

(7)加入0.3％(w/v)BSA，2～8℃保存。

4、操作步骤

1)试剂的准备

a)洗涤液：将40mL浓缩洗液和960mL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗 涤液备用。

其中，浓缩洗液为含0.1％(V/V)Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液，而50mM pH 7.8 TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％(w/v)BSA、16％(w/v)的蔗糖。

b)铕标记物：使用前一小时，用反应缓冲液按体积比为1∶20稀释上述制备的铕标记的 抗糖类抗原19-9单克隆抗体(标记好的抗体A和抗体B的混合抗体)。

其中，反应缓冲液是pH 7.8的50mmol/L Tris-HCl，内含0.9％(w/v)NaCl、2％(w/v) BSA、0.05％(w/v)牛IgG、0.1％(v/v)Tween-20和0.1％(w/v)NaN₃。

c)将上述反应缓冲液与待测样品、标准品和所需数量的包被有抗体的微孔反应条平衡至 室温(20～25℃)。

2)吸取25μl的标准品或样品，按顺序加入相应微孔底部。

3)在各微孔内加入100μl反应缓冲液，室温下于慢档振动120分钟。

4)用上述a)制备的洗涤液洗板4次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

5)在每个微孔内加入100μl已稀释的铕标记物溶液(上述b)制备)，室温下于慢档 振动60分钟。

6)用a)制备的洗涤液洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

7)在每个微孔内加入100μl的增强液【1.0％(v/v)冰乙酸和2.0％(w/v)邻苯二甲酸 氢钾缓冲液，pH 3.0-4.5，并含有0.4％(w/v)β-萘基甲酰三氟丙酮(β-NTA)、2％(w/v) 三正辛基氧膦(TOPO)、0.1％(v/v)Triton X-100】，室温下于慢档振动5分钟。

8)用时间分辨荧光测定仪(新波生物有限公司生产的Anytest2000荧光检测仪)检测。 以上糖类抗原19-9(CA 19-9)测定流程见表1或图2。

表1糖类抗原19-9(CA 19-9)测定流程

因此，根据上述步骤可制作成本发明的试剂盒，即包括：上述包被抗糖类抗原19-9单克 隆抗体的微孔反应条、反应缓冲液、铕标记的抗糖类抗原19-9单克隆抗体(混合抗体)、糖 类抗原19-9标准品、洗涤液、增强液。

另外，根据上述检测过程，对血样(购自达安基因公司的血清)，利用罗氏CA 19-9试剂 盒和本发明的方法(本发明试剂盒)，进行比较实验，检测结果见表2、表4。

其中，表2中的罗氏浓度是指血样经罗氏CA19-9试剂盒在罗氏cobasE411仪器上测得 的糖类抗原19-9浓度值；荧光值(CPS)是本发明方法测得的值。

表3是对表2中的血样的糖类抗原19-9测量值的阴阳性判断标准，根据该标准，对表2 进行统计，结果见表4。

表2糖类抗原19-9(CA19-9)血样检测结果

表2糖类抗原19-9(CA19-9)血样检测结果(续)

表3对表2中的血样的糖类抗原19-9测量值的阴阳性判断标准

表4根据表3的判断标准对表2中的72份血样的阴阳性统计

因此，由表2-4可知，与罗氏试剂盒相比，本发明试剂盒对血样的测量结果相关性好， 阴阳性符合率高，而且本发明试剂盒正常值范围可达0～39U/ml，与罗氏正常值检测范围 完全相同。

另外，使用上述本发明的试剂盒，通过双抗体混合标记的方法，检测CA19-9国家质控 血清II、III(购自中国药品生物制品检定所)，结果见6。由表5-6可知，通过本发明的 方法，CA19-9国家质控血清的符合率高，因此，有效的解决了检测CA19-9国家质控品符合 率的问题。

表5CA19-9国家质控品检测标准

表6糖类抗原19-9(CA19-9)国家质控品检测结果

5、特异性检测

按照上述操作步骤，对甲胎蛋白和神经元特异性烯醇化酶(均购自中国药品生物制品 检定所)作为交叉反应物质进行检测，结果见表7，其中，表观CA 19-9浓度为根据表2中 的标准品，检测到的交叉反应物质浓度。

表7交叉反应物质的检测结果

由表7可知，采用本发明的检测方法所得到的CA 19-9浓度具有较好的特异性，并且本 发明与干扰物质的交叉反应小。