一种检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法及其在癌症治疗中的应用

摘要

本发明提供了一种检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法及其在乳腺癌个体化治疗中的应用。本发明通过DNA测序的方法检测乳腺癌患者的病理组织中的PTEN，利用WesternBlot技术检测PI3K/AKT蛋白的表达情况，检测结果准确、可靠；本发明的检测方法，结合乳腺癌患者对曲妥珠单抗用药敏感性，可准确判断患者对曲妥珠单抗的耐药性，可为乳腺癌患者的诊断、治疗和评价提供依据，可以防止盲目的使用曲妥珠单抗（赫赛汀）给患者带来的治疗时机的错失以及经济损失。

说明书

技术领域

本发明属于核酸、蛋白检测方法领域，特别涉及一种检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法及其应用。 

背景技术

乳腺癌目前是世界各地女性中发病率最高，并且成为女性因癌症死亡的主要因素。随着全球人口老龄化及世界总人口的持续增长，以及在发展中国家及地区医疗设施的落后，癌症的发病率急剧上升。根据2011年A Cancer Journal for Clinicians 在线出版了《Global Cancer Statistics》全球肿瘤统计报告中显示，约有1270万癌症病例和760万癌症死亡者进行了评估，其中约56%的癌症病例和64%的癌症死亡者来自发展中国家或地区。乳腺癌在女性中发病率高，并且为女性癌症死亡的主要因素，占所有女性癌症病例的23%和癌症死亡数的14%。与十几年前相比，发展中国家或地区的女性癌症死亡的主因已从以宫颈癌为最常见原因，转变为以乳腺癌。甚至，发展中国家或地区的女性肺癌死亡率与宫颈癌一样高，以上两项均占女性癌症死亡数的11%。虽然发展中国家或地区中两性癌症总发病率为发达国家或地区的一半，但是癌症的死亡率却是相似的。发展中国家或地区中癌症患者将更加贫穷，大概是因为患者晚期就诊及没有得到适时的、标准化的治疗。 

在所有的乳腺癌患者中，HER2的过表达与之密切相关。研究发现 20%-25%的乳腺癌患者存在 HER2 基因的过表达或扩增。过表达的 HER2 与其他受体（尤其是 HER3）形成亲和力更强的异源二聚体，表现出更强的信号传导能力。如激活 MAPK 通路，进一步激活其转录因子 c-myc、c-jun 等，促进肿瘤的增殖、转化；激活 PI3K/AKT通路，活化的 AKT 可促使 p53 降解，还可以激活核因子-κB(NF-κB），降低 TNF-α的抗肿瘤能力。除此之外，高表达的 HER2 还可以抵抗他莫昔芬对雌激素受体阳性乳腺癌的治疗作用，这可能与 HER2 减低类固醇激素的表达有关。HER2 分子在乳腺癌发生发展及治疗耐药中起着重要的作用。 

曲妥珠单抗（赫赛汀）是重组人源化单克隆抗体，能与 HER2 的胞外区域特异性结合，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一个用于治疗 HER2 过表达转移性乳腺癌的生物治疗药物。研究显示，在HER2阳性乳腺癌妇女中，赫赛汀作为单药治疗、联用标准化疗或在标准化疗后使用，均可提高反应率、无病生存期和总生存期，同时保证生活质量。自1998年以来，赫赛汀已经在全世界用于治疗超过45万名HER2阳性乳腺癌患者。 

然而曲妥珠单抗（赫赛汀）对于患者的治疗费用也是相当可观的，在中国药用曲妥珠单抗一个疗程大概需要200,000人民币。曲妥珠单抗用于治疗 HER2 过表达的转移性乳腺癌患者，取得了较好的治疗效果，然而其单独治疗客观反应率却不高，9 个月的中位生存期只有 12%-34%，并且多数患者在使用该药一年之内就产生了耐药。 

因此，目前急需一种能够准确、有效判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗耐药性的方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白表达的方法，并且所述方法可用于检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法，所述的检测方法包括以下步骤：

A. DNA测序操作

1）总DNA提取：取手术患有乳腺癌患者的新鲜乳腺组织，生理盐水冲洗，并将所述组织剪碎，提取总DNA；

2）PCR扩增目的片段：以所述提取的总DNA为模板，以人工合成DNA序列为引物，利用PCR仪器进行PCR扩增，获得PCR产物；

3）琼脂糖凝胶电泳：利用琼脂糖凝胶电泳将所述PCR产物，进一步纯化，将目的片段切下，进行DNA测序；

B. Western Bloting操作

1）取手术患有乳腺癌患者的新鲜乳腺组织，将所述组织置于冰上，并用灭菌的预冷工具分离所述组织，得到组织块；

2）将所述组织块放入圆底Eppendorf管中，向管中加入液氮冷冻所述组织块，并将所述Eppendorf管置于冰上，进行均匀研磨，得到组织研磨物；

3）向所述组织研磨物中加入裂解缓冲液，所述裂解液加入的量为60μl/mg，冰浴下匀浆处理，而后将所述Eppendorf管置于4℃摇动1~2h，得到组织匀浆物，所述组织匀浆物中蛋白浓度至少达到0.1mg/ml；

4）将所述组织匀浆物4℃离心10~20min，转速为8000~12000rpm，离心后轻轻吸取上清液，并将所述上清液移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即得到蛋白样本；

5）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：取所述蛋白样品，进行SDS-PAGE，电泳时间2h，电压120v，蛋白上样量20ng；

6）转膜：利用湿式三明治排列转膜，将上述SDS-PAGE的胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上；

7）膜的封闭：将所述硝酸纤维素膜置于封闭液中，常温封闭1h，再用TBST洗所述硝酸纤维素膜5~10s，得到封闭后的膜；

8）一抗孵育：将所述封闭后的膜加入TBST一抗稀释液，所述一抗稀释液的浓度为1：1000倍稀释，持续摇动4℃孵育过夜，而后将所述膜用TBST清洗3-5次，每次清洗5-10min，得到得到一抗处理后的膜；

9）二抗孵育：将所述一抗处理后的膜置于二抗稀释液，所述二抗稀释液的浓度为1：5000倍稀释，持续摇动室温孵育1-2h，得到二抗处理后的膜；

10）显影：将上述二抗处理后的膜，利用ECL进行显影，显影后，利用FluorChem Q软件进行灰度值分析，作图。

进一步的，步骤A. DNA测序操作中，所述总DNA 提取操作为： 

向所述剪碎的组织中加入DNA抽提缓冲液（0.33M NaAc，25mM EDTA，pH 6.4）、10%SDS和蛋白酶K（10mg/ml），55℃水浴3h，水浴期间数颠倒混匀；水浴后，再向组织中加入500μl异丙醇，轻轻颠倒混匀10min，而后12000rpm离心15min，弃上清液，沉淀物即为DNA沉淀，将DNA沉淀风干后，向DNA沉淀中加入TE缓冲液100μl溶解DNA沉淀，在Nano Drop测定所述DNA的浓度，比值大于1.8，置于-20℃备用。

进一步的，步骤A. DNA测序操作中，所述的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No：1、SEQ No：2、SEQ No：3和SEQ No：4所示。 

进一步的，步骤A. DNA测序操作中，所述PCR扩增反应的总体系为20μl，包括有： 

核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示：1μl；

核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示：1μl；

Taq DNA聚合酶：0.5μl；

所述提取的总DNA：2μl；

dNTP：2.5mM的dNTP 2μl；

ddH2O：补至20μl。

进一步的，步骤A. DNA测序操作中，所述PCR扩增反应的总体系为20μl，包括有： 

核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示：1μl；

核苷酸序列如序列表中SEQ No：4所示的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：4所示：1μl；

Taq DNA聚合酶：0.5μl；

所述提取的总DNA：2μl；

dNTP：2.5mM的dNTP 2μl；

ddH2O：补至20μl。

进一步的，步骤A. DNA测序操作中，所述PCR扩增目的片段的程序为：第一步，95℃预变性5min；第二步，95℃变性30s；第三步，62℃退火30s；第四步，72℃延伸30s；第二步至第四步共30个循环；第五步，72℃最后延伸10min；第六步，4℃保存。 

进一步的，所述的检测PTEN基因和PI3K/AKT蛋白方法可用于判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性。 

本发明相比现有技术具有以下有益效果： 

1、本发明通过DNA测序的方法检测乳腺癌患者的病理组织中的PTEN，利用Western Blot技术检测PI3K/AKT蛋白的表达情况，检测结果准确、可靠；

2、通过本发明的检测方法，结合乳腺癌患者对曲妥珠单抗用药敏感性，可准确判断患者对曲妥珠单抗的耐药性，可为乳腺癌患者的诊断、治疗和评价提供依据，可以防止盲目的使用曲妥珠单抗（赫赛汀）给患者带来的治疗时机的错失以及经济损失。

  

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为第5号外显子测序示意图； 

图2为第8号外显子测序示意图； 

图3为PI3K/AKT蛋白表达的Western Bloting检测结果图。 

  

具体实施例

实施例1

一种检测PTEN基因的方法，所述的检测方法包括以下步骤：

DNA测序操作

1）总DNA提取：取手术患有乳腺癌患者（女性A和女性B）的新鲜乳腺组织（包括癌组织和癌旁组织）1cm³×1cm³×1cm³大小，生理盐水冲洗3次，并用剪刀将所述组织剪碎，加入DNA抽提缓冲液（0.33M NaAc，25mM EDTA，pH 6.4）、10%SDS和蛋白酶K（10mg/ml），55℃水浴3h，水浴期间数颠倒混匀；水浴后，再向组织中加入500μl异丙醇，轻轻颠倒混匀10min，而后12000rpm离心15min，弃上清液，沉淀物即为DNA沉淀，将DNA沉淀风干后，向DNA沉淀中加入TE缓冲液100μl溶解DNA沉淀，在Nano Drop（DNA紫外分光光度计，美国GENE公司）测定所述DNA的浓度，比值大于1.8，置于-20℃备用。

2）PCR扩增目的片段：以所述提取的总DNA为模板，以人工合成DNA序列为引物，利用PCR仪器进行PCR扩增，获得PCR产物； 

3）琼脂糖凝胶电泳：利用琼脂糖凝胶电泳将所述PCR产物，进一步纯化，将目的片段切下，进行DNA测序；

进一步的，所述DNA测序操作中，所述PCR扩增反应的总体系为20μl，包括有：

5号外显子，核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示：1μl；

核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示：1μl；

Taq DNA聚合酶：0.5μl；

所述提取的总DNA：2μl；

dNTP：2.5mM的dNTP 1μl；

ddH2O：补至20μl。

进一步的，所述DNA测序操作中，所述PCR扩增反应的总体系为20μl，包括有： 

8号外显子，核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示：1μl；

核苷酸序列如序列表中SEQ No：4所示的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示：1μl；

Taq DNA聚合酶：0.5μl；

所述提取的总DNA：2μl；

dNTP：2.5mM的dNTP 1μl；

ddH₂O：补至20μl。

进一步的，所述DNA测序操作中，所述PCR扩增目的片段的程序为：第一步，95℃预变性5min；第二步，95℃变性30s；第三步，62℃退火30s；第四步，72℃延伸30s；第二步至第四步共30个循环；第五步，72℃最后延伸10min；第六步，4℃保存。 

参见图1和图2，测序结果显示，女性A与女性B相比，女性A第5号外显子的第203碱基出现A（腺嘌呤）的插入突变；第8号外显子的第211碱基出现A-T（腺嘌呤-胸腺嘧啶）的移码突变。随后跟踪治疗发现，女性A化疗一个周期后，即出现曲妥珠单抗耐药性，而女性B化疗后并没有出现耐药性。因此所述的检测PTEN基因的方法可用于判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性。 

实施例2

一种检测PI3K/AKT蛋白的方法，所述的检测方法包括以下步骤：

Western Bloting操作

1）取手术患有乳腺癌患者（女性A和女性B）的新鲜乳腺组织，将所述组织置于冰上，并用灭菌的预冷工具分离所述组织，得到组织块；

2）将所述组织块放入圆底Eppendorf管中，向管中加入液氮冷冻所述组织块，并将所述Eppendorf管置于冰上，进行均匀研磨，得到组织研磨物；

3）向所述组织研磨物中加入裂解缓冲液，所述裂解液加入的量为60μl/mg，冰浴下匀浆处理，而后将所述Eppendorf管置于4℃下摇动2h，得到组织匀浆物，所述组织匀浆物中蛋白浓度至少达到0.1mg/ml；所述的裂解缓冲液购自碧云天公司；

4）将所述组织匀浆物4℃离心20min，转速为12000rpm，离心后轻轻吸取上清液，并将所述上清液移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即得到蛋白样本；

5）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：取所述蛋白样品，进行SDS-PAGE，电泳时间2h，电压120v，蛋白上样量20ng；

6）转膜：利用湿式三明治排列转膜，将上述SDS-PAGE的胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上；

7）膜的封闭：将所述硝酸纤维素膜置于封闭液中，常温封闭1h，再用TBST洗所述硝酸纤维素膜5s，得到封闭后的膜；

8）一抗孵育：将所述封闭后的膜加入TBST一抗稀释液（Phospho-Akt (Thr308) (244F9) Rabbit mAb 美国CST公司 货号#4056）中，工作浓度为1:1000倍稀释，所述P-AKT抗体购自CST公司，持续摇动4℃孵育过夜，而后将所述膜用TBST清洗3-5次，每次清洗5-10min，得到得到一抗处理后的膜；

9）二抗孵育：将所述一抗处理后的膜置于二抗稀释液（rabbit IgG-HRP 美国santa cruz公司 sc-2749）中，工作浓度1:5000倍稀释，所述二抗购自武汉博世德公司，持续摇动室温孵育1-2h，得到二抗处理后的膜；

10）显影：将上述二抗处理后的膜，利用ECL（Novex ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit，美国life technology 公司）进行显影，显影后，利用FluorChem Q软件进行灰度值分析，作图。

参见图3，结果发现女性A与女性B相比AKT被激活。随后跟踪治疗发现，女性A化疗一个周期即出现了曲妥珠单抗耐药性，而女性B化疗后并没有出现耐药性。 

参见表1，我们通过对45例乳腺癌患者免疫组化染色发现，当HER2呈阳性时（占25例），PTEN在乳腺癌组织中突变时，或者PI3K/AKT在乳腺癌样本中被激活，对于曲妥珠单抗（赫赛汀）的耐药性增强。即在乳腺癌组织中当PTEN的突变和PI3K/AKT被激活时，曲妥珠单抗（赫赛汀）对于患者的治疗耐药性增强。 

本发明以PTEN和PI3K/AKT阳性细胞占整个组织的百分比作为阳性结果及阴性结果的判断，即表达率高于30%为阳性（+）。结果发现当PTEN在乳腺癌组织突变时，同时PI3K/AKT被激活时，患者使用曲妥珠单抗（赫赛汀）对于患者的耐药性明显增强。X2检验分析显示PTEN和PI3K/AKT对于乳腺癌的治疗有显著相关性。P＜0.05，属于显著性差异。