一种黑曲霉组成型表达元件、表达载体、重组黑曲霉及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种黑曲霉组成型表达元件、表达载体、重组黑曲霉及其构建方法和应用，所述表达元件由黑曲霉转录延伸因子基因启动子和黑曲霉转录延伸因子基因终止子组成；所述黑曲霉转录延伸因子基因启动子由1490、990或690个碱基组成，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；所述黑曲霉转录延伸因子基因终止子由1022个碱基组成，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明构建的组成型表达载体，无需诱导物的添加，即可启动蛋白表达，节约生产成本，可用于真核生物及微生物来源的药用蛋白及工业用酶类的制备。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程研究领域，具体涉及一种黑曲霉组成型表达载体及其 应用。

背景技术

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，某些丝状菌分泌的胞外总蛋白量达到 40g/L，这种高效的蛋白分泌能力是细菌等原核表达宿主所不能比拟的。丝状 真菌还具备各种基因翻译后加工能力，如糖基化修饰，信号肽切割及二硫键的 形成等。米曲霉，黑曲霉及里氏木霉等丝状真菌都是食品安全级菌株，被美国 食品与药品管理局认定为GRAS（Generally recognized as safe）菌株。在工业 用酶的生产中丝状菌发酵占据核心的地位，国际市场的酶制剂将近40%的酶 类生产来自于丝状真菌发酵。

黑曲霉是一种重要的工业微生物，可以用于淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素 酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等多种酶制剂发酵制备。随着黑曲霉的基因组测序 工作的完成，为深入研究黑曲霉蛋白分泌表达及其调控机制奠定了良好的基 础，同时也为通过基因工程手段提高黑曲霉的异源蛋白表达能力提供了新的思 路和方法。

黑曲霉是葡萄糖化酶的高产菌株，表明糖化酶基因的启动子具有高效转录 的作用，因此该基因的启动子被开发用于高表达载体的启动子。此外，Sucrase  A,、α-Amylase、Alcohol dehydrogenase I及Arabinanase等基因的启动子序列 被相继开发为表达载体的启动子元件。但这些表达载体在表达外源基因时，需 要加入麦芽糖、淀粉、蔗糖等物质进行诱导。对于重组蛋白的工业生产，一方 面增加了生产成本，另一方面有可能增加发酵液中背景蛋白的产生，增加了重 组蛋白纯化的难度。

相对于诱导型的启动子，组成型的启动子不需要添加诱导物即可以进行基 因的启动表达，在实际生产中可以降低生产的成本，因此更具有应有的价值。 在其他表达系统中，如毕赤酵母，米曲霉表达系统，木霉表达系统都相继开发 出高效的组成型表达载体。转录延伸因子基因（Transcription elongation factor 1，tef1）是黑曲霉中重要的看家基因，控制细胞内大量基因转录过程，其启 动子序列有可能是组成型的启动子并用于高效载体的构建。Storms R等人 （Storms R et al.Plasmid vectors for protein production,gene expression and  molecular manipulations in Aspergillus niger.2005,Plasmid53:191–204）报道了 含有黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子的黑曲霉组成型启动子的表达载体。到目前 为止，还没有利用黑曲霉Tef启动子构建表达载体的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需添加诱导物即可进行外源基因表达的黑 曲霉组成型表达元件。

本发明的第二个目的在于提供一种含有所述黑曲霉组成型表达元件的表 达载体及构建方法。

本发明的第三个目的在于提供含有所述表达载体的重组黑曲霉及构建方 法。

本发明的第四个目的在于提供上述重组黑曲霉的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种黑曲霉组成型表达元件，所述表达元件由黑曲霉转录延伸因子基因启 动子和黑曲霉转录延伸因子基因终止子组成；所述黑曲霉转录延伸因子基因启 动子由1490、990或690个碱基组成，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3所示；所述黑曲霉转录延伸因子基因终止子由1022个碱基组成， 序列如SEQ ID NO.5所示。

上述黑曲霉组成型表达元件构建表达载体的方法，包括以下步骤：

1)提取黑曲霉的基因组DNA，设计引物，利用PCR技术，并以黑曲 霉基因组DNA为模板，扩增并克隆长度为1490、990或690个碱基的黑 曲霉转录延伸因子基因的启动子和长度为1022碱基的终止子，分别命名为 P_tef1490、P_tef990、P_tef690、和T_tef；

2）将Amds基因通过kpnI和XhoI内切酶克隆进入pbluescript载体中， 获得中间载体一；将P_tef基因片段利用XhoI和HindIII内切酶克隆进入上 述中间载体一中，获得中间载体二；将T_tef基因片段利用XbaI和NotI克 隆进入中间载体二，获得黑曲霉表达载体pTef。

所述引物序列如下：

利用上述方法构建的表达载体构建重组黑曲霉的方法，包括以下步骤：

1）将脂肪酶calb基因克隆到黑曲霉表达载体pTef中，使用内切酶为 EcoRI和XbaI，获得calb表达载体pTef-calb；2）将pTef-calb转化黑曲 霉原生质体，筛选阳性重组菌株，即得到重组黑曲霉GAP-calb。重组的黑 曲霉菌株GAP3-calb表达产物分析，通过蛋白电泳检测及酶底物检测表明 重组菌株能够组成型表达脂肪酶calb。

上述方法构建的重组黑曲霉在制备工业酶制剂或药用蛋白质中的应用。

所述工业酶制剂为脂肪酶、蛋白酶、植酸酶或木聚糖酶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:

本发明构建的含有黑曲霉转录延伸因子的启动子和转录终止序列组成的 表达元件的组成型表达载体，无需诱导物的添加，即可启动蛋白表达，节约生 产成本。黑曲霉转录延伸因子的启动子长度为990bp时比其他长度的启动子转 录效率较高，而且比文献报道的丙酮酸激酶基因启动子外源基因表达能力高5 倍左右，可用于真核生物及微生物来源的药用蛋白及工业用酶类的制备。

附图说明

图1为黑曲霉组成型表达载体图谱。

图2为重组表达CALB重组表达电泳图；泳道一：蛋白分子量marker； 泳道二：不含calb基因的黑曲霉菌株培养上清；泳道三：黑曲霉重组菌 GAP3/pTef990-calb发酵上清。

图3为不同重组黑曲霉表达CALB活性比较图。

图4为连续传代重组黑曲霉酶活性比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方 式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

黑曲霉转录延伸因子基因启动子与终止子序列的获取

将黑曲霉菌种（购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心）接种于 PDA固体培养基上，28℃培养直至孢子成熟为止，取适量的孢子制备成悬液 接种于液体PDA中，于28℃，200rpm条件下培养3天，并收获菌丝体用于 提取黑曲霉基因组DNA。

黑曲霉基因组采用氯化苄法提取：将菌丝体与SDS和氯化苄混匀，50℃ 加热，后加入3M醋酸钠溶液混匀，冰水浴15min，离心15min，取上清，加 入等体积异丙醇室温沉淀20min。室温高速离心15min，沉淀用70％乙醇洗一 次，干燥后溶于Tris-EDTA缓冲液（TE），经RNAase消化后，用于后续试验。

根据Genbank公布的黑曲霉基因组信息(登录号：AM270408.1)，设计黑 曲霉转录延伸因子基因启动子不同长度的基因片段及转录终止序列，不同长度 的黑曲霉转录延伸因子基因启动子Ptef1490、Ptef990、Ptef690、Ptef390由 1490、990、690及390个碱基组成，扩增的序列如SEQ ID NO.1，EQ ID NO. 2，EQ ID NO.3及EQ ID NO.4所示，黑曲霉转录延伸因子基因终止子Ttef 由1022个碱基组成，如SEQ ID NO.5所示。引物序列如下：

表一引物信息列表

使用Takara公司的PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，以黑曲霉基因组为模 板，PCR反应条件：预变性98℃3min；再进行25循环：98℃变性5sec，55℃ 延伸10sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，PCR产物利用琼脂糖核酸 电泳检测大小，并进行胶回收纯化目的DNA片度，并将PCR产物送往华大基 因公司进行测序验证。

实施例2

黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子与终止子序列的获取

根据Genbank公布的黑曲霉丙酮酸激酶基因信息（登录号：S38698）设 计引物扩增获得其启动子及转录终止序列，黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子元件 序列如SEQ ID NO.7所示，终止子元件序列如SEQ ID NO.8所示。引物序列 如下：

表二引物信息列表

使用Takara公司PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，以上述提取的黑曲霉基 因组为模板，按照聚合酶说明书条件进行扩增，PCR产物大小利用琼脂糖核 酸电泳检测，并进行测序验证。

实施例3

黑曲霉组成型表达载体构建

根据Amds基因序列设计特异扩增引物，序列如下：Amds-F:

GGGGTACCTTTTGAATAGCTCGCCCGCT（KpnI）;Amds-R:

CCGCTCGAGCTAGACTGGAAACGCAACCC（XhoI）,使用Amds-F及 Amds-R，并以含有Amds基因的商业化pKLAC1载体（美国New England  Biolabs公司）扩增获得Amds基因片段，Amds基因序列如SEQ ID NO.9所 示。将Amds基因片段利用KpnI和XhoI酶切，克隆进入商业化载体pblusecript （美国stratagene公司）中获得中间载体一pblusecript-Amds。为了获得含有将 转录延伸因子基因表达元件的表达载体，将其启动子基因片段P_tef1490、 P_tef990、P_tef690及P_tef390分别利用XhoI和HindIII酶切，克隆进入中间载体 pbluescript-Amds中而获得pbluescript-P_tef1490，pbluescript-P_tef990， pbluescript-P_tef690pbluescript-P_tef390，进一步将T_tef基因片段利用XbaI和NotI 克隆到中间上述载体中，获得黑曲霉组成型表达载体pTef1490，pTef990， pTef690及pTef390。

为了获得含有将丙酮酸激酶基因表达元件的表达载体，将实施例2获得的 启动子基因片段Ppki及转录终止子片段Tpki，先后克隆到pbluescript-Amds 中而获得pPki表达载体。

实施例4

脂肪酶calb黑曲霉组成型表达载体构建及黑曲霉转化

使用calb forward：GGAATTCATGAAGCTACTCTCTCTGAC，calb reverse： GCTCTAGATCAGGGGGTGACGATGCCGG引物扩增脂肪酶calb基因，以南 极假丝酵母的基因组作为模板，PCR扩增程序为：预变性98℃3min；再进行 25循环：98℃变性5sec，55℃延伸10sec，72℃延伸40sec；最后72℃延伸 5min并通过EcoRI和XbaI酶切，分别克隆进入pTef系列载体及pPki载体中， 获得calb表达载体pTef1490-calb，pTef990-calb，pTef690-calb、pTef390-calb 及pPki-calb。脂肪酶calb基因序列如SEQ ID NO.6所示。

采用CaCl₂-PEG法将重组质粒转化到黑曲霉中，并将转化的菌涂布在乙酰 胺选择培养基在，30℃培养，直至平板上长出克隆。对在平板上长出的重组 克隆，进行培养提取其基因组，并利用calb forward和calb reverse引物进行 PCR鉴定calb基因整合到黑曲霉基因组中。从而获得重组黑曲霉calb基因表 达菌株GAP3/pTef1490-calb、GAP3/pTef990-calb、GAP3/pTef690-calb、 GAP3/pTef390-calb及GAP3/pPki-calb。

实施例5

重组黑曲霉calb基因拷贝数检测及重组菌株脂肪酶CALB的表达活性检 测

提取重组黑曲霉和野生型黑曲霉的基因组DNA，以三磷酸甘油醛基因 （GADPH）为参照基因，对calb基因整合到黑曲霉基因组的拷贝数进行检测。 采用双标准曲线法，分别利用含有GADPH基因和calb基因的质粒，进行实 时荧光定量PCR反应，建立标准曲线。利用荧光定量PCR检测重组菌株基因 组中calb基因起始模板拷贝数与GADPH基因起始模板拷贝数，两者的比值 即为calb基因在黑曲霉基因组中的拷贝数,结果显示挑选的重组菌株均含有单 个拷贝的calb基因。荧光定量PCR反应程序为：stage1：预变性95℃，30sec； stage2：PCR反应：95℃5sec，60℃20sec（40Cycles）；stage3：溶解曲 线分析65℃，15sec。

表三荧光定量引物信息表

将不同的重组菌GAP3/pTef1490-calb、GAP3/pTef990-calb、 GAP3/pTef690-calb、GAP3/pTef390-calb及GAP3/pPki-calb于PDA培养液中进 行培养，30℃培养4天。10000rpm，4℃离心15min取上清。利用硝基苯酚 酯脂肪酶人工底物（pnp-C8）进行脂肪酶活性检测：在10μl50mM Tris-HCl （pH8.0）、1mM pNPC的反应体系中加入10μl发酵液上清，40℃反应10min， 后加入异丙醇终止反应。1个单位酶活力单位定义为每分钟水解底物生产1μ mol硝基苯酚所需的酶量。

结果发现GAP3/pTef990-calb菌株发酵上清比其他重组菌的活性都要高， 结果如图4所示，活性依次是GAP3/pTef990-calb>GAP3/pTef1490-calb> GAP3/pTef690-calb>GAP3/pPki-calb>GAP3/pTef390-calb，其中， GAP3/pTef990-calb比GAP3/pPki-calb活性高大约5倍。

实施例6

重组菌株GAP3/pTef990-calb的遗传稳定性验证

将重组菌株GAP3/pTef990-calb在不含乙酰胺的PDA平板上进行进行30℃ 培养，连续传代五次，并对各次传代的重组菌株进行培养，并检测发酵上清的 酶活性。结果表明各次传代的GAP3/pTef990-calb表达脂肪酶的能力没有显著 差异，说明所构建的重组菌株具有很好的遗传稳定性。