一株枯草芽孢杆菌及其在降解17β-雌二醇中的应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解17β-雌二醇中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CHS，它的保藏编号为CGMCC No.6128。枯草芽孢杆菌CHS可用于降解17β-雌二醇。本发明还保护一种制备产品的方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌CHS接种至含有氨氮的LB培养基中，37℃振荡培养12-36小时，然后将培养体系冻干，得到降解17β-雌二醇的产品。所述枯草芽孢杆菌CHS或所述产品在可用于降解禽畜废水。本发明适用于畜禽养殖废水高氨氮高pH的特性，具有成本低、操作简单、降解效率高的优点，环境相容性好、减少使用化学试剂、避免二次污染，在天然雌激素类物质污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解17β-雌二醇中的应用。

背景技术

雌激素（英文名称：estrogen；estrin；oestrogen），是由脊椎动物的卵巢、睾 丸、胎盘或肾上腺皮质所产生的十八碳固醇类激素。绝大部分哺乳动物的主要雌激素 是17β-雌二醇（E2），其他重要的雌激素有雌三醇和雌酮。

天然雌激素广泛分布在废水、动物排泄物、地表水以及地下水中。天然雌激素在 很低浓度下即显示出很强的内分泌干扰效应，如E2在1-10ng/L时就会使一些野生雄 性鱼类出现雌化现象。同其他污水相比，畜禽养殖业废水中雌激素类物质的含量非常 高，雌激素总量可达到1000-21000ng/L，其中E2在养猪废水中的浓度可达到 1000-16000ng/L，是城市污水含量的10倍以上。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在降解17β-雌二醇中的应用。

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CHS，已于2012年05月22日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6128。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CHS CGMCC No.6128简称枯草芽孢杆菌 CHS。

所述枯草芽孢杆菌CHS可用于降解17β-雌二醇。应用所述枯草芽孢杆菌CHS降 解17β-雌二醇时，反应体系的pH值可为6.25-8.75（如6.25-7.40或7.40-8.75）。

应用所述枯草芽孢杆菌CHS降解17β-雌二醇时，反应体系的氨氮浓度可为 0.6-10mg/L（如0.6-2mg/L或2-10mg/L）。所述氨氮具体是由(NH₄)₂CO₃或NH₄HCO₃提供 的。

本发明还保护一种制备降解17β-雌二醇的产品的方法，包括如下步骤：将所述 枯草芽孢杆菌CHS接种至含有氨氮的LB培养基中，37℃振荡培养12-36小时，然后将 培养体系冻干，得到降解17β-雌二醇的产品。

所述含有氨氮的LB培养基可为含有(NH₄)₂CO₃的LB培养基或含有NH₄HCO₃的LB培 养基。所述LB培养基的pH值具体可为8.25。所述接种后，所述枯草芽孢杆菌CHS的 初始浓度具体可为10⁴cfu/mL。完成所述振荡培养后，所述培养体系中所述枯草芽孢杆 菌CHS的浓度具体可为10⁸-10⁹cfu/mL。所述含有(NH₄)₂CO₃的LB培养基具体可为含有 10mg/L(NH₄)₂CO₃的LB培养基。所述含有NH₄HCO₃的LB培养基具体可为含有10mg/L NH₄HCO₃的LB培养基。所述振荡具体可采用200r/min的转速。

以上任一所述方法制备得到的降解17β-雌二醇的产品也属于本发明的保护范 围。

所述产品可用于降解17β-雌二醇。

所述枯草芽孢杆菌CHS或所述产品在可用于降解禽畜废水。

本发明的发明人采用生物工程技术手段，从畜禽养殖废水生物处理SBR反应器的 活性污泥中分离到一株能够高效降解17β-雌二醇的菌株。经形态、培养特征及生理 生化实验结果观察，鉴定出该菌为为枯草芽孢杆菌。该菌株对17β-雌二醇具有很高 降解效果。该菌在畜禽养殖废水的高氨氮浓度溶液和高pH溶液的条件下，依然表现出 良好的降解能力。实际应用中，可将该菌株扩大培养制成成品菌悬液或粉剂，投放于 实际的废水体系中。本发明具有成本低、操作简单、降解效率高、适应性强等优点。

本发明的优点及效果：适用于畜禽养殖废水高氨氮高pH的特性；（2）具有成本低、 操作简单、降解效率高的优点；（3）环境相容性好，减少使用化学试剂，避免二次污 染；（4）在天然雌激素类物质污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中各个样本中17β-雌二醇的浓度。

图2为实施例3中各个样本中17β-雌二醇的浓度。

图3为实施例4中部分PCR-DGGE结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

17β-雌二醇（E2；17β-雌二醇标准品）：Sigma公司，货号为E8875-5G。

无机盐缓冲液的制备方法：将4.0g K₂HPO₄、4.0g NaH₂PO₄、2.0g(NH₄)₂SO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.01g CaCl₂·2H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O和0.01g MnSO₄·2H₂O用水溶解 并定容至1L。

LB培养基的制备方法：将10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl用水溶解 并定容至1L。

实施例中所用的PBS缓冲液为pH7.0，1M的PBS缓冲液。

实施例1、枯草芽孢杆菌CHS的获得和鉴定

一、枯草芽孢杆菌CHS的获得

污泥样本为2011年9月取自北京市通州区某种猪厂生物处理畜禽养殖废水的SBR 反应器的好氧活性污泥。

在容器中，加入曝气静置24h的污泥样本，再加入含10mg/L 17β-雌二醇的无机 盐缓冲液，于摇床中25℃恒温振荡，反复操作一个月，诱导菌株产生降解17β-雌二 醇的酶类。然后采用液体稀释法获得纯培养的菌株，再从中筛选耐污染浓度高、且对 污染物去除能力强的菌株。

最终获得一株以17β-雌二醇为唯一碳源的菌株，将其命名为CHS。

二、枯草芽孢杆菌CHS的鉴定

1、形态鉴定

菌落形态：椭圆形菌落、边缘整齐、半透明、灰白色、与培养基结合疏松易挑起； 单个细胞0.7～0.8×2～3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动。

2、生理生化鉴定

可利用糊精、D-果糖、麦芽糖、葡萄糖、尿苷等多种碳源。

3、分子鉴定

对菌株进行16S rRNA鉴定，其编码序列如序列表的序列1所示。将16S rRNA的 编码序列进行BLAST分析，发现与其同源性最好的菌株为Bacillus subtilis(GENBANK  ACCESSION NO.NR 027552.1），同源性为98%。

三、枯草芽孢杆菌CHS的保藏

根据细胞形态、生理生化、16S rRNA鉴定的结果，菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CHS，已于2012年05月22日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6128。 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CHS CGMCC No.6128简称枯草芽孢杆菌CHS。

实施例2、枯草芽孢杆菌CHS在降解17β-雌二醇中的应用（采用不同pH环境）

养猪废水的pH值通常为8.5-9.0，不同pH对枯草芽孢杆菌CHS降解17β-雌二醇 会有一定的影响，所以本实施例用于检测枯草芽孢杆菌CHS在不同pH环境中对17β- 雌二醇的降解能力。

1、将枯草芽孢杆菌CHS用PBS缓冲液配制成菌浓度为10⁸cfu/mL的菌悬液。

2、分组处理（采用平行处理，每组设置三个重复处理）

第一组：将1mL PBS缓冲液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲液（pH 值为7.40）中，37℃、200r/min振荡培养；

第二组：将1mL步骤1的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲 液（pH值为6.25）中（即枯草芽孢杆菌CHS的初始浓度为4.76×10⁶cfu/mL），37℃、 200r/min振荡培养；

第三组：将1mL步骤1的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲 液（pH值为7.40）中，37℃、200r/min振荡培养；

第四组：将1mL步骤1的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲 液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

从接种完开始计时，分别于0小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96 小时后取样。

3、将各个时间取得的样本分别进行如下处理：首先用超声波清洗机（KQ5200DE 型数控超声波，昆山市超声仪器有限公司）进行超声处理20min，以保证吸附及进入 细胞内未降解的17β-雌二醇进入上清液；然后离心（4000r/min，10min）取上清液， 采用UPLC检测17β-雌二醇的浓度，并采用质谱进一步鉴定UPLC收集的17β-雌二醇。

UPLC参数：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm 1.7μm），柱温 40℃、进样量10μL，流速0.2mL/min；

UPLC洗脱过程：洗脱液为A液（水）、B液（乙腈）或A液和B液的混合物；

在第0分钟，A液/洗脱液=65%，B液/洗脱液=35%；第0分钟至第4分钟，A 液/洗脱液由65%线性下降至50%，B液/洗脱液由35%线性上升至50%；第4至4.5分 钟，A液/洗脱液由50%线性下降至0%，B液/洗脱液由50%线性上升至100%；第4.5 至7分钟，洗脱液为B液；第7至7.5分钟，A液/洗脱液由0%线性上升至65%，B液/ 洗脱液由100%下降至35%；本段的比值均为体积比；

采用17β-雌二醇标准品进行上述UPLC，其保留时间为2.11，所以保留时间为2.11 的峰为目的峰。

通过17β-雌二醇标准品的浓度和峰面积制作标准曲线方程如下： y=58.761x+0.3935（x代表浓度，单位为mg/L；y代表峰面积）。

根据上述标准曲线方程可以得到上清液中的17β-雌二醇浓度。

各个样本中17β-雌二醇的浓度见图1（三个重复处理的平均值）。在pH6.25-8.75 的环境中，枯草芽孢杆菌CHS对17β-雌二醇均具有良好的降解效果。在96小时后枯 草芽孢杆菌CHS对初始浓度为1mg/L的17β-雌二醇的降解效率约为95%。

收集目的峰，并采用质谱鉴定该目的峰的物质组成。质谱条件见表1和表2。

表1质谱条件-1

  离子化模式  ESI阴离子   毛细管电压   3.3kV

  去溶剂化气压   600L/h   锥孔气压   50L/h   离子源温度   100℃   去溶剂化气压温度   400℃   离子能量   1.0

表2质谱条件-2

  化合物   母离子（m/z)   子离子(m/z)^a  碰撞电压(ev)   锥孔电压(V)   17β雌二醇标准品   271.4   183.1，145.2   40,45   45

目的峰的质谱结果和17β-雌二醇标准品的质谱结果一致，即目的峰确实为17β- 雌二醇。

实施例3、枯草芽孢杆菌CHS在降解17β-雌二醇中的应用（采用不同氨氮浓度）

养猪废水进水中的氨氮浓度高达996±10mg/L，通过SBR反应器稀释氨氮浓度为 30mg/L，所以本实施例用于检测枯草芽孢杆菌CHS在不同氨氮浓度中对17β-雌二醇 的降解能力。

1、同实施例2的步骤1。

2、分组处理（采用平行处理，每组设置三个重复处理）

第一组（空白组）：将1mL PBS缓冲液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机 盐缓冲液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

第二组：将1mL步骤1的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲 液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

第三组：将1mL步骤1的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇和0.6mg/L (NH₄)₂CO₃的无机盐缓冲液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

第四组：将1mL步骤的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇和2mg/L(NH₄)₂CO₃的无机盐缓冲液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

第五组：将1mL步骤的菌悬液接种至20mL含1mg/L 17β-雌二醇和10mg/L(NH₄)₂CO₃的无机盐缓冲液（pH值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养；

从接种完开始计时，分别于0小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96 小时后取样。

3、同实施例2的步骤3。

各个样本中17β-雌二醇的浓度见图2（三个重复处理的平均值）。在各个氨氮浓 度中，枯草芽孢杆菌CHS对17β-雌二醇均具有良好的降解效果。当(NH₄)₂CO₃的浓度 为10mg/L时，对枯草芽孢杆菌CHS降解17β-雌二醇具有促进作用。

实施例4、枯草芽孢杆菌CHS粉剂对17β-雌二醇的降解作用

一、枯草芽孢杆菌CHS粉剂的制备

1、将枯草芽孢杆菌CHS接种至含有10mg/L(NH₄)₂CO₃的LB培养基（pH值为8.25） 中，使其初始浓度为10⁴cfu/mL，37℃、200r/min振荡培养12小时，完成培养后培养 体系中枯草芽孢杆菌CHS的浓度为10⁸cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品 Ⅰ。

2、将枯草芽孢杆菌CHS接种至含有10mg/L(NH₄)₂CO₃的LB培养基（pH值为8.75） 中，使其初始浓度为10⁴cfu/mL，37℃、200r/min振荡培养24小时，完成培养后培养 体系中枯草芽孢杆菌CHS的浓度为10⁹cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品 Ⅱ。

3、将枯草芽孢杆菌CHS接种至含有10mg/L NH₄HCO₃的LB培养基（pH值为8.25） 中，使其初始浓度为10⁴cfu/mL，37℃、200r/min振荡培养12小时，完成培养后培养 体系中枯草芽孢杆菌CHS的浓度为10⁸cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品 Ⅲ。

4、将枯草芽孢杆菌CHS接种至含有10mg/L NH₄HCO₃的LB培养基（pH值为8.75） 中，使其初始浓度为10⁴cfu/mL，37℃、200r/min振荡培养24小时，完成培养后培养 体系中枯草芽孢杆菌CHS的浓度为10⁹cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品 Ⅳ。

二、枯草芽孢杆菌CHS粉剂对17β-雌二醇的降解作用

1、分别将步骤一制备的产品Ⅰ、产品Ⅱ、产品Ⅲ和产品Ⅳ进行如下实验：

将1g步骤一制备的产品投放至20mL含1mg/L 17β-雌二醇的无机盐缓冲液（pH 值为8.75）中，37℃、200r/min振荡培养96小时。然后检测培养体系中的17β-雌 二醇浓度（方法同实施例2的步骤3）。

投放产品Ⅰ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为0.12mg/L。

投放产品Ⅱ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为0.08mg/L。

投放产品Ⅲ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为0.10mg/L。

投放产品Ⅳ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为0.07mg/L。

2、分别将步骤一制备的产品Ⅰ、产品Ⅱ、产品Ⅲ和产品Ⅳ进行如下实验：

禽畜养殖废水取自北京市通州区某种猪场附近的排污口，参数如下：COD平均值 为7250mg/L、总氮（TN）平均浓度为930mg/L、氨氮（NH₃-N）平均浓度为620mg/L、 总磷（TP）平均浓度为470mg/L、17β-雌二醇平均浓度为4230ng/L，pH平均值为8.68。 COD、NH₃-N、TN、TP分别采用美国哈希公司的method 8000、method 10031、method 10072、 method 10127并使用分光光度计（DR5000 HACH）测定。17β-雌二醇浓度的测定方法 同实施例2的步骤3。

将1g步骤一制备的产品投放至20mL禽畜养殖废水中，37℃、200r/min振荡培养， 96小时后检测培养体系中的17β-雌二醇浓度（方法同实施例2的步骤3），分别与48 小时后和96小时后提取总DNA进行PCR-DGGE。

投放产品Ⅰ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为62ng/L。

投放产品Ⅱ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为54ng/L。

投放产品Ⅲ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为58ng/L。

投放产品Ⅳ并振荡培养96小时后，培养体系中17β-雌二醇的浓度为43ng/L。

PCR-DGGE所用的引物对如下（枯草芽孢杆菌CHS的靶序列约240bp）：

5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG  -3’；

5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。

部分PCR-DGGE结果见图3（箭头标注目的带），其中泳道1为产品Ⅰ，泳道2为 禽畜养殖废水，泳道3为投放产品Ⅰ并振荡培养48小时后的禽畜养殖废水，泳道,4 为投放产品Ⅰ并振荡培养96小时后的禽畜养殖废水。产品Ⅱ、产品Ⅲ和产品Ⅳ的 PCR-DGGE结果与图3一致。结果表明，投放产品并振荡培养96小时后，枯草芽孢杆 菌CHS在活性污泥中依然占优势，并可以有效地去除17β-雌二醇，降解率可以达到 90%以上。