一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法

摘要

本发明公开了一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：将处理过的羊胎盘与pH为2.5-3.5的纯化水按照质量比为1∶（1-3）的比例混合，置于缝隙为8-9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用盐酸调节匀浆液pH为2.5-3.5，再进行研磨，得羊胎盘匀浆；加热羊胎盘匀浆至78-82℃，保温时间≥10min，冷却后用NaOH调节羊胎盘匀浆pH为6.5-6.8，然后在4000-6000r/min下离心30-45min，取上清液；用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘转移因子溶液。本发明方法简单便捷，可直接从羊胎盘中提取大量的转移因子，并且能够在常温下保存，给使用和运输节约大量的时间和金钱。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法。

背景技术

随着现代化养殖规模的不断扩大，目前病毒性疾病已成为困扰养殖户的一大难题，同时，由于各种原因，有时免疫往往会失败，爆发非典型性传染病，给诊断和治疗带来一定困难，依赖抗生素治疗会造成的耐药菌株的增加和交叉感染的产生，以及药物残留的严重爆发。转移因子作为免疫调节剂，在防治疾病方面发挥重要作用，提高免疫后的免疫效果，有效提高机体的抗病能力，是未来兽类免疫药物的发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：

（1）将处理过的羊胎盘与pH为2.5-3.5的纯化水按照质量比为1∶（1-3）的比例进行混合，置于缝隙为8-9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用盐酸调节匀浆液pH为2.5-3.5，再进行研磨，得羊胎盘匀浆；

（2）加热羊胎盘匀浆至78-82℃，保温时间不小于10min，冷却后用NaOH调节羊胎盘匀浆pH为6.5-6.8，然后在4000-6000r/min下离心30-45min，取上清液；

（3）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘转移因子溶液。

上述方法中，步骤（1）所述羊胎盘处理方法为：将冷冻健康的新鲜羊胎盘置于纯化水中融化，水温≤40℃，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗，控干水分。

较好的，步骤（1）中纯化水的pH用盐酸进行调节；羊胎盘和纯化水的质量比为1∶1。

上述方法步骤（2）中所述NaOH为10wt%的NaOH水溶液，所述加热在水浴罐中进行，冷却为水浴冷却，冷却温度至25℃。

本发明方法简单便捷，可直接从羊胎盘中提取大量的转移因子，并且能够在常温下保存，给使用和运输节约大量的时间和金钱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

（1）取5kg冷冻的新鲜羊胎盘置于40℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗3次，控干水分；

（2）将处理过的羊胎盘与pH为3.5的纯化水按照质量比为1∶3的比例进行混合，置于缝隙为9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用30%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为3.5，再进行研磨一次，得羊胎盘匀浆；

（3）在水浴罐中加热羊胎盘匀浆至82℃，保温时间10min，冷却后用质量浓度为10%的NaOH水溶液调节羊胎盘匀浆pH为6.8，然后在6000r/min下离心30min，弃去沉淀，取上清液；

（4）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘溶液。所得羊胎盘溶液的浓度为18mg/ml。

实施例2

（1）取10kg冷冻的新鲜羊胎盘置于30℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗4次，控干水分；

        （2）将处理过的羊胎盘与pH为2.5的纯化水按照质量比为1∶1的比例进行混合，置于缝隙为8μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用20%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为2.5，再进行研磨一次，得羊胎盘匀浆；

（3）在水浴罐中加热羊胎盘匀浆至78℃，保温时间20min，冷却后用质量浓度为10%的NaOH水溶液调节羊胎盘匀浆pH为6.5，然后在4000r/min下离心45min，弃去沉淀，取上清液；

（4）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘溶液，该溶液浓度为25mg/ml。

实施例3

（1）取8kg冷冻的新鲜羊胎盘置于35℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗3次，控干水分；

        （2）将处理过的羊胎盘与pH为3.0的纯化水按照质量比为1∶2的比例进行混合，置于缝隙为8.5μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用25%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为3.0，再进行研磨一次，得羊胎盘匀浆；

（3）在水浴罐中加热羊胎盘匀浆至80℃，保温时间18min，冷却后用NaOH固体调节羊胎盘匀浆pH为6.7，然后在5000r/min下离心40min，弃去沉淀，取上清液；

（4）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘溶液，该溶液浓度为20mg/ml。

利用福林酚测定法对实施例1所得羊胎盘溶液进行检测，确定羊胎盘溶液中转移因子含量，具体步骤如下：

试剂：碱性铜试液：取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。临用前，合并两液，并加水至500ml。

操作方法：(1)对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液；

(2)供试品溶液的制备：取实施例1所得羊胎盘溶液，稀释50倍得供试品溶液；

(3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中（分别命名为0-5号管），各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线；

 (4)测定法：精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，得羊胎盘溶液浓度为18mg/ml。