以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法，本发明以银杏落叶为原料，加入乙醇回流提取，合并提取液，滤过，浓缩，加水溶散，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用90%~95%乙醇解吸，收集90%~95%乙醇洗脱液，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用70%~75%甲醇解吸，收集70%~75%甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得含有30%~45%总黄酮和7%~15%总内酯的精制提取物。本发明以废弃的银杏落叶为提取原料，变废为宝，通过优选工艺制得含有总黄酮和总内酯活性成分高的精制提取物，具有很好的抗氧化，抗血小板聚集及其神经元细胞保护作用，且不良反应低，可作为防治心脑血管疾病的药物与保健食品的主要原料，具有重要的经济效应和环境保护作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药用植物废弃组织的开发利用，具体涉及一种银杏落叶的精制提取物及 其制备方法与应用。

背景技术

银杏叶为银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的干燥叶。银杏叶主要含有黄酮类和银杏内酯 类活性物质，其提取物及其制剂在临床上广泛用于治疗冠心病、高血压、脑梗死、痴呆、哮 喘、乙型肝炎、糖尿病等疾病。我国银杏资源十分丰富，其有效成分既是贵重的医药原料， 又可用于生产保健食品。银杏叶精制提取物主要来源于4～7年树龄的银杏叶，其它树龄的银 杏尤其是果用银杏的叶，由于银杏黄酮与内酯类成分含量偏低而不被采集利用，每到11月成 为落叶而成为废弃物。据初略统计，全国每年约有7500吨的银杏落叶被废弃，造成了极大的 资源浪费和环境污染。国内报道有四项项关于银杏落叶的专利，中国专利CN1066595公开了 应用银杏落叶提取药用冠心酮，经临床短期使用，对高血压脑血栓等一些慢性病疗效可观； 中国专利CN102876721A公开了一种快速高效破坏银杏落叶纤维结构的方法，该发明得到的 反应终产物即银杏落叶去纤维结构可用于细胞扩大培养或作为工业发酵的底物，解决了现有 工艺处置反应条件要求高，转化率低等技术问题；另外两项分别使用银杏落叶制成有机生物 肥以及食用菌培养料。CN102030590A以植物废弃物(银杏落叶等)为原料，发酵后制成有机生 物肥料，药肥合一，防治病菌；CN102265753A将银杏落叶等与营养物质和水混合，制成食 用菌培养料，合理解决了当前园林绿化的废弃物处理问题。但是均未报道同时提取出总黄酮 和总内酯含量高，白果酸等毒副成分含量少，药理活性强并接近银杏标准提取物及其制备技 术与方法。

因此，为了充分利用好银杏落叶资源，减少环境污染，很有必要以银杏落叶为原料设计 研发一种总黄酮和总内酯含量高，杂质少，不良反应低，药理活性强的银杏叶精制提取物。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，充分利用银杏落 叶资源，以银杏落叶为原料，采用现代提取分离方法，精制得到总黄酮和总内酯含量高，杂质 少，不良反应低，药理活性强的银杏叶精制提取物，本发明另一个目的在于提供银杏叶精制提 取物的制备方法和其应用，对资源综合利用和环境保护具有重要的意义。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种银杏叶精制提取物，它通过以下方法制备得到：

取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每次2 至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸 附，先用水洗澄清后，再用浓度为90%～95%乙醇解吸，收集90%～95%乙醇洗脱液，减压浓缩， 浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%～75%甲醇解吸，收集70%～75%甲醇洗脱液，减 压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%～35%重量百分比的总黄酮和7%～8%重量百分比的总内酯。

作为优选方案，以上所述的银杏叶精制提取物，它通过以下方法制备得到：

取银杏落叶，粉碎，加入7倍量浓度为70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液， 滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再 用浓度为95%乙醇解吸，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用 浓度为70%甲醇解吸，收集70%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%～35%重量百分 比的总黄酮和7%～8%重量百分比的总内酯；

所述的总黄酮包括槲皮素、山奈酚和异鼠李素；所述的总内酯包括银杏内酯、白果内酯、 银杏内酯A、银杏内酯B。

本发明根据银杏落叶中的化学成分及其理化性质，通过大量实验优选提取制备方法和精 制工艺（筛选了提取溶剂及其浓度，树脂柱类型及其树脂连用方式），实验结果表明，本发明 采用70%乙醇提取—AB-8大孔树脂柱吸附—聚酰胺柱吸附，并采用优选的浓度的乙醇洗脱液洗 脱，制备得到的总黄酮重量百分比可达30%～45%，总内酯重量百分比可达7%～15%；并且未检测 到白果酸等毒副性成分，药理实验结果表明，活性强且广泛，取得了很好的技术效果。

本发明提供的银杏叶精制提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取银杏落叶，粉碎，加入7至10倍量浓度为70%至85%的乙醇回流提取2至3次，每 次2至3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，得滤液；

（2）取步骤（1）制备得到的滤液上AB-8大孔树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为 90%～95%乙醇解吸，收集90%～95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用 浓度为70%～75%甲醇解吸，收集70%～75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到含有30%～35% 重量百分比的总黄酮和7%～8%重量百分比的总内酯。本发明根据银杏落叶中的化学成分及其理 化性质，通过大量实验优选提取制备方法和精制工艺。

本发明通过对不同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为AB-8 型的大孔吸附树脂吸附和纯化效果最佳，同时本发明对50%至95%不同浓度乙醇的洗脱能力 进行了优选，以总黄酮和总内酯含量作为指标，确定浓度为90%至95%的乙醇的洗脱物中总 黄酮和总内酯有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度90%至95%的乙醇为梯度洗脱溶剂； 作为进一步的优选方案，通过AB-8型的大孔吸附树脂吸附纯化后，本发明又优选聚酰胺柱与 AB-8型的大孔吸附树脂连用，再次进行纯化精制，本发明筛选了浓度为50%～90%甲醇，乙醇 等洗脱液，以总黄酮和总内酯含量作为指标，确定浓度为70%～75%甲醇作为洗脱液，活性成 分含量高，杂质少，活性最强。因此，本发明收集浓度70%至75%的甲醇洗脱液。

本发明所述的银杏叶精制提取物，所述的总黄酮测定的色谱条件为：

本发明根据银杏叶精制提取物的化学成分及其理化性质，通过大量实验筛选总黄酮检测 控制方法，Waters2695高效液相色谱仪：四元泵，在线脱气，柱温箱，自动进样器，Waters2998 DAD检测器，色谱柱：反相C18柱（优选KromasilC18column，200mm×4.6mm,5μm）； 流动相：体积比为50:50的甲醇和浓度0.4%磷酸溶液，检测波长：360nm；流速：1.0mL；柱 温：30℃；进样量：10μl。能够同时检测到槲皮苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素、木犀草素、 芹菜素等黄酮成分。通过该方法可以快速准确的检测银杏叶精制提取物中的黄酮类成分，对 控制银杏叶精制提取物的质量具有重要意义。

本发明所述的银杏叶精制提取物，所述的总内酯测定的色谱条件为：

本发明根据银杏叶精制提取物的化学成分及其理化性质，通过大量实验筛选总内酯检测 控制方法，WatersACQUITYUPLC系统：四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Xevo TQ检测器，银杏内酯质谱条件离子源：ESI-源；扫描方式：多反应监测方式；毛细管电压： 3.0kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：550℃；脱溶剂气流量：1000L·h^-1；锥孔气流 量：50L·h^-1；碰撞气流量：0.15mL·min^-1；取样锥孔电压18伏至35伏，碰撞能量14eV至 25eV。

其中银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A和银杏内酯B的主要质谱检测参数如表1所示：

表1 4种萜内酯成分的主要质谱检测参数

本发明所述的银杏叶精制提取物在制备抗血栓性疾病药物中的应用。

本发明所述的银杏叶精制提取物在制备抗氧化、抗衰老药物或保健品中的应用。

本发明所述的银杏叶精制提取物在制备神经系统保护药物中的应用。

有益效果：本发明提供的银杏叶精制提取物和现有技术相比具有以下优点：

1、本发明根据银杏落叶的理化性质，首次采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法纯化总 黄酮和总内酯，确定最佳的大孔树脂材料和聚酰胺材料，尤其在洗脱剂方面，重点考察了不 同浓度的乙醇的洗脱能力，确定最佳的洗脱工艺，可以最大程度得到纯度高活性强的总黄酮 和总内酯，并且不含白果酸等毒副成分，药理实验结果表明，本发明制备得到的银杏叶精制 提取物具有很好的抗氧化、抑制血小板聚集以及神经系统保护作用，取得了很好的技术效果。

2、本发明根据总黄酮和总内酯的化学特征及其理化性质，通过大量实验确定检测总黄酮 和总内酯的检测方法，可操作性强，检测方法灵敏，准确，重复性好，检测效率高。

附图说明

图1为本发明提供的银杏叶精制提取物的制备工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改 均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

杏叶精制提取物的制备方法，其括以下步骤：

（1）取银杏落叶，粉碎，加入7倍量浓度为70%的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提 取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，得滤液；

（2）取步骤（1）制备得到的滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为95% 乙醇解吸，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为70%甲 醇解吸，收集70%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到杏叶精制提取物。

总黄酮测定的色谱条件为：

Waters2695高效液相色谱仪：四元泵，在线脱气，柱温箱，自动进样器，Waters2998DAD 检测器，色谱柱：反相C18柱；流动相：体积比为50:50的甲醇和浓度0.4%磷酸溶液，检测波 长：360nm；流速：1.0mL；柱温：30℃；进样量：10μl。

总内酯测定的色谱条件为：

WatersACQUITYUPLC系统：四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；XevoTQ检测器， 银杏内酯质谱条件离子源：ESI-源；扫描方式：多反应监测方式；毛细管电压：3.0kV；离 子源温度：150℃；脱溶剂气温度：550℃；脱溶剂气流量：1000L·h^-1；锥孔气流量：50L·h^-1； 碰撞气流量：0.15mL·min^-1；其中银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A和银杏内酯B的主要质 谱检测参数如表1所示：

表14种萜内酯成分的主要质谱检测参数

检测得到得到杏叶精制提取物中含有38%重量百分比的总黄酮和10%重量百分比的总内酯。

实施例2

银杏叶精制提取物的制备方法，其括以下步骤：

（1）取银杏落叶，粉碎，加入10倍量浓度为80%的乙醇回流提取2次，每次3小时，合并 提取液，滤过，减压回收乙醇，加入水溶散，静置，过滤，得滤液；

（2）取步骤（1）制备得到的滤液上AB-8树脂柱吸附，先用水洗澄清后，再用浓度为90% 乙醇解吸，收集90%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液上聚酰胺柱，先用水洗，再用浓度为75%甲 醇解吸，收集75%甲醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到杏叶精制提取物，通过以上实施例1 所述的检测方法检测，杏叶精制提取物中含有35%重量百分比的总黄酮和8%重量百分比的总内 酯.

实施例3药理实验

1实验材料

1.1实验试剂

柠檬酸三钠购买于上海凌锋化学试剂有限公司；FeSO4·7H₂O，水杨酸，过氧化氢（H₂O₂） 购买于无锡市亚盛化工有限公司；三吡啶三嗪（2,4,6-tripyridyl-s-triaz-ine，TPTZ）购自于sigma 公司；DPPH（1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl）购自于ALDRICHChemistry；二甲亚砜购自于 国药集团化学试剂有限公司；噻唑蓝（MTT）购自美国GIBC公司；TBS购自于北京索莱宝 科技有限公司；BSA购自于南京创瑞生物技术公司；银杏叶提取物：实施例1制备得到的银 杏叶精制提取物。

1.2实验动物

雄性新西兰家兔，体重2.0～2.5kg，由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供，动物合格 证：SCXK(苏)2007-0008。Sprague-Dawley大鼠乳鼠由上海斯莱克实验动物有限公司（SPF 级）提供，许可证号SCXK（沪）2007-0005。

1.3实验仪器

LG-PABER-I型血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；Anke（LXJ-11B） 离心机（上海安寿科学仪器厂）；AY120型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；酶联免 疫检测仪（美国Bio-Tek公司）。

2实验方法

2.1DPPH清除率的测定

在96孔板中加入实施例1制备得到的银杏叶精制提取物100μL，终浓度分别为100 μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、10μg·mL^-1、2.5μg·mL^-1。加入银杏叶精制提取物后，加入 溶于无水乙醇终浓度为0.05mg·mL^-1DPPH溶液，避光反应30min后在517nm波长下测定其 吸光度为A₀。同时作空白对照，在517nm波长下测定其吸光度为A₁。为扣除药物本底颜色 对实验的影响，在加入终浓度分别为100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、10μg·mL^-1、2.5 μg·mL^-1的药物后加入无水乙醇在517nm波长下测定其吸光度A₂，维生素C做阳性对照，按 照下列公式进行计算各样品受试药物对DPPH清除率(%)：[1-（A₀-A₂）/A₁]×100，计算IC₅₀。 2.2FRAP法测定

将25mL0.3mol·L^-1醋酸盐缓冲溶液（3.1g醋酸钠和16mL冰醋酸用蒸馏水配成1L， PH3.6），2.5mL0.01moL·L^-1TPTZ溶液（0.04mol·L^-1HCl溶解），2.5mL0.02mol·L^-1FeCl3混 合配制成FRAP试剂。在96孔板中分别加入10μL实施例1制备得到的银杏叶精制提取物样 品溶液和100μLFRAP工作液，混匀，37℃反应10min，在593nm下测定吸光度，每份样 品重复3次。空白对照为95%乙醇代替样品溶液，维生素C为阳性对照。将5mmol·L^-1FeSO4·7H₂O溶液稀释成0.25，1，0.5，0.25，0.125mmol·L^-1，按上述方法测定吸光度，得到 标准曲线:Y=0.3536X+0.1356，R²=0.9907。银杏叶精制提取物抗氧化活性以达到同样吸光度所 需的FeSO4的物质的量（mmol）表示。

2.3OH·清除率的测定

在96孔板中加入终浓度为2.25mmol·L^-1的FeSO₄·7H₂O的溶液和终浓度为2.25mmol·L^-1的水杨酸各50μl，加入终始浓度分别为800μg·mL^-1、400μg·mL^-1、200μg·mL¹、100μg·mL^-1、 50μg·mL^-1实施例1制备得到的银杏叶精制提取物受试药物50μL后，加入终浓度为2.2 mmol·L^-1H₂O₂，37℃水浴锅加热30min在536nm波长下测定其吸光度为A₀。同时作空白对 照和阳性对照（维生素C），维生素C浓度与上述受试药物一致，在510nm波长下测定其吸 光度为A₁。为扣除药物本底颜色对实验的影响，在同法加入FeSO₄·7H₂O、水杨酸和各银杏 叶精制提取物受试药物各50μL后，加入50μL蒸馏水，37℃水浴锅加热20min后在510nm 波长下测定其吸光度为A₂。按照下列公式进行计算银杏叶精制提取物对OH·清除率(%)：[1- （A₀-A₂）/A₁]×100。

2.4血小板聚集实验

新西兰大耳白兔，雄性，戊巴比妥钠（30mg·kg^-1）麻醉，颈总动脉插管取血，按枸橼酸 钠（3.8%）1：9抗凝，以1000r/min离心10min，取富血小板血浆（PRP），剩余部分以3000r/min 离心10min，取贫血小板血浆（PPP），用PPP将PRP调数为（400～450）×10⁹·L^-1。聚集诱导 剂用PAF（溶解在pH为7.6的含0.25%小牛血清蛋白的TBS溶液中，终浓度440ng/mL），测试杯 通道加入搅拌珠，在每管250μLPRP中加入不同浓度的实施例1制备得到的银杏叶精制提取 物各10μL，对照组PRP中加入5%二甲亚砜溶液，用PPP调零，温育3min，加10μLPAF诱导 剂，用LG-PABER-I型血小板聚集凝血因子分析仪测定血小板6min内的最大聚集率，并按下 述公式计算药物对血小板聚集的抑制率。

2.5MTT法测定神经元细胞存活率

本实验应用的银杏叶提取物浓度根据预试验结果确定。

MTT溶液配制：称取100mgMTT（Amresco分装）于小烧杯中。加20mLPBS（0.01mol/L， pH=7.2），使其充分溶解，用0.22μm微孔过滤器除菌，分装于1.5mL的EP管中，4℃避光保存。

PBS溶液配制（用于溶解MTT）：8g氯化钠，1.15g磷酸氢二钾，0.2g磷酸二氢钾去离子 水定容至1000mL，用精密pH计调节pH=7.2，溶液浓度为0.01mol/L。121℃灭菌15min，室温 保存。

原代大鼠神经细胞的培养：取孕18～21dSD大鼠，以10%水合氯醛按3mL·kg^-1麻醉后 置75%酒精中浸泡10min，无菌操作剖取胎鼠脑，研磨分离脑细胞，加入含10%小牛血清和 10%马血清的DMEM培养液，用吸管轻轻吹打使其成单细胞悬液，显微镜下计数，然后按每 孔3×10⁴、3×10⁵个细胞分别种入预先用多聚赖氨酸包被的96孔、24孔培养板中，置37℃5% CO₂培养箱中培养，每2～3d半量换液，培养至5d，加入终浓度为10μmol·L^-1阿糖胞苷以 抑制非神经细胞的过度增殖，48h后全量换液后继续培养。

实验方法：正常对照组：加入0.1%DMSO；LPS组：LPS10mg·L^-1作用24h；LPS+银杏 提精制取物组：在加入LPS前1h，加入不同浓银杏精制提取物作用24h，将接种在96孔培养 板的按以上分组处理的细胞，加入MTT（终浓度0.5g·L^–1）培养4h，弃去上清液，每孔加入 150μLDMSO，待颗粒溶解后，在570nm检测各孔的吸光度值（A），并根据公式计算细胞存 活率。细胞存活率（%）=（A实验组-A空白组）/（A正常对照组-A空白组）×100%。

2.6数据处理与统计

各组数据均以均数±标准差（mean±SD）表示，组间相关指标采用两两比较t检验。

3实验结果与讨论

3.1DPPH清除率的测定结果

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在无水乙醇中形成一种稳定的自由基，呈紫红色， 且具有典型的特征吸收峰。当反应体系中存在抗氧化剂时，抗氧化剂提供氢原子和电子给 DPPH自由基，生成无色产物，导致溶液的特征吸收峰下降，吸光值变小。在此反应中，体 系颜色变得越浅表明所检测物质的抗氧化能力越强。实施例1制备得到的银杏叶精制提取物 具有较强的清除DPPH的作用，具体实验结果见表2所示。

3.2FRAP法测定结果

Fe³⁺-三吡啶三嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并于593 nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。在高剂量时，实施例 1制备得到的银杏叶精制提取物FRAP值较高；具体实验结果见表3。

表2银杏叶精制提取物对DPPH自由基清除率实验结果

表3银杏叶精制提取物FRAP值结果

3.3OH·清除率的测定结果

各浓度银杏叶精制提取物对OH·均具有较好的清除能力，具体实验结果见表4所示。

表4银杏叶精制提取物对OH·自由基清除率实验结果

3.4血小板聚集实验结果

PAF是迄今发现的最强的血小板聚集诱导剂，其诱导作用是血栓丸A2(TXA2)的200倍， 是二磷酸腺苷（adenosinediphosphate，ADP）的500倍。在体内，PAF参与许多病理生理过 程，已发现PAF在血栓形成、哮喘、器官移植排斥、急性炎症、心脏过敏、内毒素及IgG导 致的休克等病理过程中起着重要的作用。银杏内酯是具有高度专属性的PAF受体阻断剂，而 对二磷酸腺苷、花生四烯酸、胶原、肾上腺素诱导的血小板聚集无作用。它能竞争性地抑制 PAF与血小板膜受体结合。研究显示，在人与兔血小板、中性白细胞、人肺细胞等的细胞膜 上，存在着特殊的PAF受体，PAF通过与受体结合而产生一系列生理反应。银杏内酯能竞争 性地与PAF受体结合，使PAF失去作用，从而表现出拮抗活性。实验结果表明，本发明实施 例1提供的银杏叶精制提取物各浓度体外对PAF诱导家兔血小板聚集均有较强的作用，并呈 量效关系，具体结果如表5所示。

表5银杏叶精制提取物对PAF诱导的血小板聚集的影响T

3.5银杏叶精制提取物对大鼠神经元细胞存活率的影响

脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）是一种以氨基苷为组成单位的磷脂，能够诱导小胶质 细胞分泌致炎细胞因子如肿瘤坏死因子A、白细胞介素1β和一氧化氮等，导致神经细胞损伤， 最后导致细胞死亡。表6结果显示，LPS作用24h可使大鼠神经元细胞存活率明显降低，从正 常对照组的（100±7.72）%降到（48.55±4.51）%。本发明提供的银杏叶精制提取物能明显 对抗LPS引起的神经元细胞存活率下降，并呈一定浓度依赖性。

表6银杏叶精制提取物对LPS诱导的神经元细胞损伤的影响

注：与正常对照组比较，^***P<0.001；与LPS组比较，^###P<0.001。

由以上实验结果表明，本发明以废弃的银杏落叶为提取原料，变费为宝，通过优选工艺 制备得到的含有总黄酮和总内酯活性成分高的精制提取物，具有很好的抗氧化，抗血小板聚 集及其神经元细胞保护作用，且不良反应低，具有重要的经济效应和环境保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明 的保护范围。