一种防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物及其应用。所述组合物由金丝桃素和黄芪甲甙按质量比1：5～6组成。通过检测小鼠血清溶血素形成和对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用实验，确定金丝桃素、黄芪甲甙按1：5质量配比，疗效最佳。本发明提供了一种具有较好疗效的防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物，为新药筛选提供了基础。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物及其应用。

（二）背景技术

贯叶连翘（Hypericum perforatum L.HP）为藤黄科金丝桃属 （Hypericum L.）植物贯叶连翘的全草，欧洲和北美称其为圣约翰草，是 近年来继银杏之后世界最畅销草药。金丝桃素（Hypericin，HY）是从 HP中提取的萘骈二蒽酮单体化合物，是HP主要活性成分，具有抗抑郁、 抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用；在德国，已与蛋白质结合用于临床抗忧郁， 治疗爱滋病。我国贯叶金丝桃资源比较丰富，但对其研究与应用很少。近 来研究表明，HY对多种病毒（DNA或RNA病毒）包括艾滋病病毒（HIV）、 疱疹病毒、炎病毒、副流感病毒、牛痘病毒、肝炎病毒、禽流感病毒等有 抗病毒作用，尤其对逆转录RNA病毒如HIV、副流感病毒、禽流感病毒 等作用显著，机理可能与抑制逆转录酶有关。金丝桃素目前有关治疗病毒 性心肌炎的研究，已有相关的实验研究报道（李乐，张益灵，陶厚权，丁 宝兴，王本兰.金丝桃素抑制慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织病理学改变。 中国医药指南，2011，9（33）:283-285）。黄芪是我国传统中药之一，参 与机体的多种代谢，具有广泛的药理作用，对病毒性心肌炎（VMC）有 确切疗效，临床已应用多年（唐立明.中药黄民的现代医学临床应用和研 究进展.中医临床研究2013，5（3）:117-120）。具有抑制病毒复制，改 善心功能、减轻心肌病理改变等疗效。黄芪甲甙为我国有自主知识产权的 一种黄芪皂甙类单体成份，为黄芪剂制中的主要有效成份，黄芪制剂的质 量控制标准都是以黄芪皂甙的含量为依据。已有研究证实，，黄芪甲甙明 显提高感染CVB3小鼠的生存率，改善心肌组织病理改变，减轻炎症细 胞浸润及坏死病灶，降低心肌组织中的病毒滴度及病毒RNA的复制水平， 对CVB3小鼠病毒性心肌炎有明显的治疗作用（何春枝，李双杰.黄芪甲 甙对急性病毒性心肌炎小鼠IGF-1及相关蛋白表达的作用研究.中国当代 儿科杂志，2011，13（9）:751-754）。但将金丝桃素与黄芪甲甙配伍应用， 治疗病毒性心肌炎未见研究报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物及其应 用。

本发明采用的技术方案是：

一种防治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物，由金丝桃素和黄芪甲甙按 质量比1：5～6组成。

优选的，所述组合物中金丝桃素和黄芪甲甙质量之比为1：5。

发明人利用柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus group B3，CVB3）感染 心肌，复制病毒性心肌炎小鼠模型，对金丝桃素组合物，经药效学整体动 物实验研究，取得了肯定的治疗效果，较单独的金丝桃素或黄芪甲甙疗效 更好。用正交实验方法，通过检测小鼠血清溶血素形成和对小鼠腹腔巨噬 细胞吞噬功能的作用实验，确定金丝桃素、黄芪甲甙按1：5质量配比， 疗效最佳。

本发明还涉及所述的组合物在制备防治病毒性心肌炎的药物中的应 用。本发明组合物可添加常规药用辅料，制成常规的剂型。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种具有较好疗效的防 治病毒性心肌炎的金丝桃素组合物，为新药筛选提供了基础。

（四）附图说明

图1为各组病毒性心肌炎小鼠心肌组织学改变（HE染色100x）；

A：对照组；B：模型组；C：金丝桃素组合物组30mg/kg/d治疗组；D： 金丝桃素组合物组100mg/kg/d治疗组E：金丝桃素组；F：黄芪甲甙组； 图2为各组小鼠心肌Masson染色（×400，深色条带反映心肌纤维化）；A： 对照组；B：模型组；C：金丝桃素组合物30mg/kg/d治疗组；D：金丝桃 素组合物100mg/kg/d治疗组；E：Cap50mg/kg/d治疗组。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：金丝桃素和黄芪甲甙组合物配比药效学实验

1材料与药物：

AS3120A超声波清洗器；AR2140电子分析天平；酶联免疫测定仪（奥 地利安图公司2010型）；油镜（OLYMPUS CH型）。

ICR小鼠240只，雌雄各半，体重16-20g，5～6周龄，由浙江大学试 验动物中心提供，动物合格证号：2009035。

0.9%生理盐水（NaCl）；2%、10%绵羊红细胞（郑州百基生物科技有 限公司）；1%鸡血红细胞（取自市售SPF公鸡，自备）；5%可溶性淀粉； 豚鼠血清（上海恒远生物科技有限公司）；

药物与试剂：

金丝桃素，Sigma公司，纯度98%，用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀 释，终浓度为0.15%，避光4℃保存。

黄芪甲甙，国家生物制品检定检测研究院提供。纯白色干粉剂，用0.5% 助溶剂羧甲基纤维素钠制成均匀混悬液，浓度8%。

按照金丝桃素和黄芪甲甙质量之比将上述溶液分别配制成1:1组，1:2 组，1:3组，1:4组，1:5组，1:6组1:7组1:8组2:1组，3:1组，4:1组 的组合物溶液。

2方法与结果

2.1分光光度法检测血清溶血素

方法：取小鼠140只（雌雄各半），随机分成14组，即空白对照组、 金丝桃素和黄芪甲甙组合物1:1组，1:2组，1:3组，1:4组，1:5组， 1:6组1:7组1:8组2:1组，3:1组，4:1组，单独金丝桃素或黄芪甲甙 组。连续灌胃给药7天（均为150mg生药/kg），给药第3天所有小鼠 腹腔注射2%的绵羊血红细胞悬液0.2mL，于第7天给药后2h将各鼠 摘眼球取血1mL离心，取10μL血清置已加入生理盐水的试管中，用 生理盐水稀释500倍，将稀释后血清加入96孔板中，每孔0.1mL，继 而加入等量的10%绵羊血红细胞悬液0.05mL和豚鼠血清（1:20稀释） 0.1mL，试验孔总体积为0.3mL。置37℃温箱温育30min，离心（2000 r/min）10min，取上清液200μL放入另一96孔板内，置酶标仪（A415） 测定吸收度值。

结果:实验结果如表1。

表1：金丝桃素和黄芪甲甙组合物对小鼠血清溶血素形成的影响（X±s）

注：与空白组相比，*P<0.01。

实验结果表明：金丝桃素和黄芪甲甙组合物1:1组、1:2组、1:4组、 1:5组、1:6组、1:7组、1:8组、2:1组、4:1组的配伍比例均能增强血 清溶血素的生成，但是1:5组的配伍比例为最佳。较单独用金丝桃素或 黄芪甲甙效果好，显示协同作用显著。

2.2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用

方法：取小鼠140只（雌雄各半），随机分成14组，即空白对照组、 1:1组，1:2组，1:3组，1:4组，1:5组，1:6组1:7组1:8组2:1组， 3:1组，4:1组，单独金丝桃素或黄芪甲甙组。连续灌胃给药7天（均 为150mg生药/kg），连续灌胃给药7天，给药第3天每只鼠腹腔注射 5%的可溶性淀粉1mL，于第7天给药后每只鼠腹腔注射1%鸡血红细 胞，1～1.5h后将小鼠断椎处死，固定在桌面上，腹部消毒后腹腔注射1 mL生理盐水，按摩腹腔，在腹部中央将皮肤剪一小口，上下撕开，暴露 腹膜，轻提腹膜剪一小口，吸取约0.2mL腹腔液滴于载玻片上，水平涂 片，将玻片放在湿盒内，置37℃温箱中孵育30min，取出，

用生理盐水淋洗，自然晾干后，用Giemsa—wright染液染色5min， 再用生理盐水淋洗，晾干后，油镜下观察，计数200个吞噬细胞中吞噬 的鸡血红细胞数，按下式计算。

结果:试验结果如表2。

表2：金丝桃素和黄芪甲甙组合物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用（X±s）

注：与空白组相比，*P<0.01。

实验结果表明：金丝桃素和黄芪甲甙组合物1:1组、1:2组、1:4组、 1:5组、1:6组、1:7组、2:1组的配伍比例均能增强腹腔巨噬细胞吞噬 功能，但是1:5组的配伍比例为最佳。较单独用金丝桃素或黄芪甲甙效 果好，显示协同作用显著。

实施例2：金丝桃素组合物对急性病毒性心肌炎小鼠的治疗作用

材料与方法

1材料

药物与试剂

金丝桃素，Sigma公司，纯度98%，用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀 释，终浓度为0.15%，避光4℃保存。

病毒，柯萨奇病毒B组3型（CVB3），Nancy株，TCID₅₀=10^–6， 购自中科院细胞生物学研究所病毒室。在Hela-2细胞中传代，冻融离心 三次，上清液分装，在细胞测出50%组织感染率（TCID₅₀）为10^-6，-70℃ 低温冰箱保存备用。

黄芪甲甙，国家生物制品检定检测研究院提供。纯白色干粉剂，用助 溶剂羧甲基纤维素钠制成均匀混悬液，浓度8%。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒，TaKaRa生物公司生产；

TrizolRNA抽提试剂盒、引物，均购自上海生工生物工程公司。

动物4周龄健康♂Balb/c小鼠，体重17g～20g，购自浙江省医科院 实验动物中心，动物合格证号:2010004。

2模型的建立及分组给药

4周龄Balb/c小鼠85只，随机分为6组:模型对照组（A组，n=15）； 金丝桃素组合物（金丝桃素／黄芪甲甙＝1：5）30mg/kg，100mg/kg治疗 组（B，C组，均n=15）；金丝桃素和黄芪甲甙组（D，E组，均n=15） 空白对照组（F组，n=10），A，B，C，D，E组小鼠均给予等量含CVB₃TCID₅₀=10^–6的病毒稀释液0.2ml/只腹腔接种，连续7d，每天一次.建立 小鼠急性病毒性心肌炎模型；F组给予等体积Eagle's液（病毒稀释液） 腹腔注射，不接种病毒。

在接种病毒当日（第0天），即开始给药。A组，给予生理盐水灌胃； B、C组，给予30mg/kg、100mg/kg金丝桃素组合物灌胃；D、E组分别 给予30mg/kg金丝桃素、黄芪甲甙100mg/kg灌胃；F组给予生理盐水灌 胃；每日给药1次，持续14天。

3取材及标本的处理

病毒接种后，每天观察小鼠的活动状态、饮食情况、体型、毛色变化 及各组动物死亡情况。病毒接种后第14天，处死所有存活小鼠；取心脏， 心尖1/3放人福尔马林液固定，石蜡包埋，作病理学检查；余2/3置人 DEPC处理的EP管，-80℃冰箱保存，用于抽提总RNA和聚合酶链式反 应。

4病理学检查及半定量分析

常规苏木精-伊红（HE）染色，光镜下（100倍）观察心肌的病理改 变，并参考Rezkalla等文献方法，计算心肌病理学积分，即每张切片随机 取5个高倍镜视野，计算每个视野中炎症和坏死面积与视野中整个心肌切 片面积之比。其中：无病变积分为0，病变面积<25计1分；25～50计2 分；50～759/6计3分；>75计4分。

5RT-PCR技术检测小鼠心肌组织的TNF-a，IFN-ymRNA水平

逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）:Trizol法提取组织总RNA，紫 外分光光度计测A值及浓度；采用RNA电泳，鉴定RNA完整性。以Oligo dT-Adap-for为随机引物，进行逆转录获得cDNA，反应条件:30℃，10min， 45℃，1h，99℃，5min，5℃，5minx，以cDNA为模板进行扩增，所用 PCR引物，由上海生工生物工程公司合成。上下游引物序列及产物长度、 反应条件如下：

TNF-a：

5'-AGCCCACGTCGTAGCAAACCAC-3；

5'-ACACCCATTCCCTTCACAGAGC-3'；443bp；

条件：94℃，3min，94℃，45s，60℃，45s，72℃，45s，35个循环， 72℃，10min。

IFN-γ：

5'-AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGTAG-3'，

5'-GTCACAGrrrrCAGCTGTATAGGG-3；246bp；

条件：95℃，3min，95℃，30s，52℃，30s，72℃，45s，30个循环， 72℃，10min。

内参β-actin：

5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGC-CAGAC-3'，

5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-GAC-3'；产物长度592bp。

PCR反应结束后，产物跑电泳，通过天能凝胶处理系统，对各组 TNF-a，IFN-γmRNA表达进行半定量分析；根据条带灰度值计算产物相 对量，计算方法:目的条带灰度值/内参条带灰度值，进行组间比较。

6统计学分析

计量资料用mean±SD表示，组间比较采用方差分析，做差异性检验； 计数资料采用确切概率法进行统计学分析。P<0.05为有统计学意义。

结果：

1.一般情况

模型对照组：接种后第4～5天，开始出现死亡，小鼠饮食减少，体 重停止增长；第14天时，存活小鼠12只；

金丝桃素组合物组30、100mg/kg/d治疗组，分别存活11只和12只， 死亡率与模型组差异无统计学意义，但一般情况较好，活动度可，体重较 前增加；

单独金丝桃素组和单独黄芪甲甙组，分别存活9只和10只；

空白对照组，毛色光泽，体重增长，无一例死亡。

2病理组织变化

心肌组织HE染色，光镜发现，

空白对照组（图A）:心肌细胞结构正常，排列整齐，间质无水肿；

模型对照组（图B）:心肌内可见大量的炎性细胞浸润，以淋巴和单 核细胞为主，且心肌细胞明显肿胀、心肌坏死，严重者可见病变融合成片。 病理半定量积分显示，模型对照组积分为2.81土0.31，空白对照组积分 为0，2者相比统计学差异显著（P<0.01）。

金丝桃素组合物30、100mg/kg/d治疗组（图C，D）:炎症浸较模型 对照组均减轻，炎性细胞减少，坏死面积减少，半定量积分分别为1.92 土0.25和1.68士0.29，2组与模型对照组比较相比统计学差异显著 （P<0.01）；但2治疗组间差异无统计学意义。

单独金丝桃素组和单独黄芪甲甙组（图E，F）：炎症浸较模型对照组 均减轻，炎性细胞减少，坏死面积减少，半定量积分分别为2.09土0.34 和2.19士0.27，2组与模型对照组比较相比统计学差异显著（P<0.01）； 但2治疗组间差异无统计学意义。2组与金丝桃素组合物100mg/kg/d治 疗组比较，统计学差异显著（P<0.01）。

3.TNF-a，IFN-γmRNA表达水平的影响

TNF-amRNA表达，模型对照组大量表达；金丝桃素组合物30，100 mg/kg/d治疗组，单独金丝桃素组和单独黄芪甲甙治疗组，表达量均有下 降，各治疗组与模型对照组半定量分析比较差异有统计学意义，见表，以 金丝桃素组合物100mg/kg/d治疗组作用最明显。

IFN-γmRNA表达，模型对照组表达增多；金丝桃素组合物30，100 mg/kg/d治疗组，单独金丝桃素组和单独黄芪甲甙治疗组，表达量均有下 降，各治疗组与模型对照组半定量分析比较差异有统计学意义，见表， 以金丝桃素组合物100mg/kg/d治疗组作用最明显。见表3。

表3：TNF-a、IFN-γmRNA半定量分析（x±S）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

结论：

1.HE染色，模型对照组小鼠心肌有明显的炎症细胞侵润；以淋巴和单 核细胞为主，且心肌细胞明显肿胀、心肌坏死，严重者可见病变融 合成片。

2.金丝桃素组合物30，100mg/kg/d治疗组，单独金丝桃素组和单独黄 芪甲甙治疗组:炎症浸较模型对照组均有减轻，炎性细胞侵润减少， 坏死面积减少，炎症改变均有明显减轻。上述治疗组均可抑制TNF-a、 IFN-γmRNA的表达，以金丝桃素组合物100mg/kg/d治疗组作用最 明显。

3金丝桃素组合物可能通过调节细胞因子的平衡，减轻病毒性心肌炎 小鼠的心肌炎症。对小鼠病毒性心肌炎起治疗作用。

实施例3：金丝桃素组合物保护小鼠病毒性心肌炎慢性期心肌的作用

1材料与方法

1.1实验动物及材料

健康雄性Balb/c小鼠，体重16g～20g，购自浙江大学医学院实验动物 中心，动物合格证号：2010012。

金丝桃素，Sigma公司，纯度98%，用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀 释，终浓度为0.15%，避光4℃保存。

病毒，柯萨奇病毒B组3型（CVB3），Nancy株，TCID₅₀=10^–6，购 自中科院细胞生物学研究所病毒室。在Hela-2细胞中传代，冻融离心三 次，上清液分装，在细胞测出50%组织感染率（TCID₅₀）为10^-6，-70℃ 低温冰箱保存备用。

黄芪甲甙，国家生物制品检定检测研究院提供。纯白色干粉剂，用助 溶剂羧甲基纤维素钠制成均匀混悬液，浓度8%。

卡托普利（captopril，Cap），上海旭东海普药业有限公司，批号 20091207。

白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）放免分析测定试剂盒，北京北方 生物技术研究所；

可溶性白细胞介素-2受体（soluble interleukin2receptor，sIL-2R）酶 联免疫ELISA试剂盒，购自深圳晶美公司。

Bio-Rad3550型自动酶联免疫测定仪（美国BioRad公司）；PE2400 基因扩增仪（美国PE公司）；液体闪烁计数器XH-6925，陕西国营二六 二厂；琼脂糖、Trizol及逆转录试剂盒购于上海生工生物工程技术公司； 细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）原位杂 交试剂盒及兔抗鼠ICAM-1单克隆抗体，山羊抗兔二抗，购于武汉博士德 生物公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1动物模型制备、分组及给药方法

健康雄性Balb/c小鼠70只随机分出正常对照组10只，注射不含病 毒的Eagel s培养液。造模组60只。造模组以递增病毒浓度法，间隔15d 分3次腹腔接种内含CVB₃TCID₅₀=10^–5的病毒稀释液0.2ml/只，60d 后成活小鼠为VMC慢性期心肌纤维化模型（经苏木精-伊红染色及心肌 纤维化特异性Masson染色确定模型成功）。

共42只小鼠造模成功，按照随机数字表法分成4组，模型组（12 只）、Cap组（10只）、金丝桃素组合物（金丝桃素／黄芪甲甙＝1：5） 30，100mg/kg/d治疗组（各10只），分别每日1次灌胃给药。Cap组给 予50mg/kg，模型组给予等量生理盐水，总疗程为30d。

1.2.1小鼠血清﹑心肌标本的采集及处理

于末次给药后第3天，将各组小鼠断颈法处死，从颈动脉处取血1.5 ml，室温下放置1h，2000r/min，离心10min，分离血清，-70℃冰箱储 存备用；同时，开胸取心脏，以预冷的生理盐水洗脱血液，沿左室长轴切 开心脏，迅速保存于-70℃冰箱中，用于RT-PCR，ELISA及Western blot 测定；每组3例心脏4%多聚甲醛灌注心脏，留取心脏标本，4%多聚甲醛 固定24h后，PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）清洗标本后常规脱水、包埋、 切片，用于组织学检测。

1.2.3血清IL-2检测

取血清标本，按照IL-2放免分析测定试剂盒说明进行操作，液体闪 烁计数器XH-6925测定血清中IL-2的含量。

1.2.4sIL-2R检测

采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。参照产品说明书进行操作。主 要步骤：标本激活、标准曲线建立、加样、加酶标抗体、加底物工作液、 终止液和显色等，最后在450nm处测吸光度值，根据各样品A值在标 准曲线上查出所测指标的含量。

1.2.5肌酸激酶检测

取血清标本，用全自动生化分析仪测定心肌肌酸激酶（creatine kinase， CK）含量。

1.2.6ICAM-1mRNA及ICAM-1蛋白质表达水平检测

按产品说明用TRIZOL（美国Promega公司）提取细胞总RNA，1% 琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度仪进行RNA定量和纯 度鉴定。依据逆转录试剂盒说明书操作合成单链脱氧核糖核酸（cDNA）。 根据GenBank序列委托上海生物工程公司合成ICAM-1和内参甘油醛磷 酸脱氢酶（GAPDH）引物序列。

ICAM-1引物：

上游5’-A GGACACAA GCAAGAGAAGAA-3’，下游5’-2GAGAA  GCCCAAACCCG2TATG-3’，扩增片段长度226bp。

反应条件：预变性95℃，3min；变性95℃，45s；退火60℃，40s； 共30个循环。

GAPDH引物：上游5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游 5’-TCCACCACCCT GT T GCT GTA-3’，扩增片段长度426bp。

反应条件：预变性95℃，3min；变性95℃，60s；退火60℃，60s； 共30个循环。

PCR产物经1.5%凝胶电泳溴化乙啶（EB）染色鉴定，拍照、密度 扫描分析，以电泳条带吸收度值IA（ICAM-1/GAPDH）表达各标本ICAM-1 mRNA含量。

取待测心肌组织，制备蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度，取40μg 总蛋白，与上样缓冲液混匀100℃煮沸5min，获得用于Western blot的蛋 白样品。SDS-PAGE凝胶电泳（110V，90min）后将样品转移到硝酸纤 维素膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭60min，然后与一抗（浓度为1： 200）结合，4℃振荡孵育过夜，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗膜， 结合二抗（浓度1：200）室温孵育2h，暗室显影，用Adobe Photoshop CS 8.01软件扫描并进行条带灰度分析。

1.3统计学分析

采用SPSS11.0统计软件进行数据分析和处理。计量资料以均数±标 准差表示，组间比较采用单因素方差分析和两组间比较采用LSD 法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠死亡情况

造模期间，60只造模小鼠死亡18只。治疗期间，小鼠食量渐增，皮 毛光泽度较前有改善，活动度增加，金丝桃素组合物100mg/kg/d治疗组 及Cap组改善显著；模型组小鼠死亡4只，Cap组死亡1只，金丝桃素 组合物30mg/kg/d治疗组死亡1只，对照组小鼠未见死亡。Cap组以及金 丝桃素组合物30，100mg/kg/d治疗组死亡率与模型组比较，差异有统计 学意义（X²=6.25，8.01和6.29，P均<0.05）。

2.2左心室心肌组织Masson染色

在Masson染色下，心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。与对照组相比， 模型组小鼠的心肌细胞及间质胶原明显增生，心肌细胞排列扭曲，治疗组 心肌细胞纤维化明显减轻。见图2。

2.3各组小鼠CK、IL-2及sIL-2R检测结果

模型组IL-2、sIL-2R及CK水平升高，与对照组相比差异有统计学 意义（F=80.64，P<0.01），金丝桃素组合物组或Cap组与模型组相比， IL-2、sIL-2R及CK显著下降，其中金丝桃素组合物30mg/kg，和100 mg/kg组，CK、IL-2及sIL-2R测定值表现出一定的剂量依赖性，见表1。

2.4RT-PCR和Western blot检测结果

模型组小鼠心肌ICAM-1mRNA及蛋白表达明显高于对照组 （F=127.12，P<0.01），金丝桃素组合物组或Cap组与模型组相比，ICAM-1 mRNA及蛋白表达显著下降，其中金丝桃素组合物30mg/kg，和100 mg/kg组，ICAM-1mRNA、ICAM-1蛋白测定值表现出一定的剂量依赖 性，见表4，5。

表4：各组小鼠之间IL-2、sIL-2R、CK和ICAM-1蛋白表达的比较

注：与对照组比较:^aP<0.01，；与模型组比较:^bP<0.05，^cP<0.01；与15 mg/kg Hyp组比较：^dP<0.01.

表5：各组小鼠之间ICAM-1mRNA的比较

注：与对照组比较:^aP<0.01，；与模型组比较:^bP<0.05，^cP<0.01；与 15mg/kg Hyp组比较；^dP<0.01.

3结论

1.VMC慢性期模型组小鼠心肌细胞肿胀、扭曲、纤维化程度明显， 模型组中血清IL-2、sIL-2R水平及CK活性升高，同时ICAM-1表达升高， 与对照组相比差异显著。

2.应用金丝桃素组合物或Cap均可明显改善VMC慢性期心肌组织 的纤维化改变，降低VMC慢性期小鼠模型IL-2及sIL-2R水平、CK活 性，抑制其ICAM-1mRNA及其蛋白质的表达，显示良好的心肌保护作 用。其中大剂量金丝桃素组合物的作用较Cap略强。Cap的作用与文献报 道一致，Cap可能通过抑制心肌胶原沉积，抑制血管紧张素II（Ang II） 的表达，进而下调转移生长因子（TGF-β1）的表达等发挥抗心肌纤维 化的作用。

3.金丝桃素组合物对VMC慢性期有心肌保护作用，其发生机制可 能与抑制ICAM-1的表达、降低血清IL-2、sIL-2R、CK活性的水平有关。