一种从柚类果实中分离纯化柠檬苦素类化合物的方法

摘要

本发明提供一种分离纯化柠檬苦素类化合物的方法，通过样品提取与HZ-816树脂初步纯化、高速逆流色谱纯化、半制备液相色谱分离三个步骤完成。本发明采用溶剂提取与HZ-816树脂初步去杂，高速逆流色谱和半制备液相色谱联用的纯化分离技术，以柚类果实的囊衣为原料，操作简单，生产周期短，样品用量少，条件稳定容易控制，最终纯化得到三种柠檬苦素类化合物，三种化合物的纯度均在95%以上。本发明方法适用于工业化生产和科学研究。

说明书

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及以柚类果实囊衣为原料，采用大孔树脂、HSCCC（高速逆流色谱）和semi-pre HPLC（半制备型液相色谱）的联用技术同时分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸三种柠檬苦素类化合物的方法。 

背景技术

 柠檬苦素类化合物（Limonoid）是三萜类的植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科植物中，尤其在柑桔属的种子及果皮中含量丰富。迄今为止，已发现300余种柠檬苦素类似物，其中，在柑橘中含有100多种。柑橘果实中的柠檬苦素类化合物主要包括柠檬苦素类化合物苷元和糖苷。柠檬苦素类化合物苷元主要包括柠檬苦素、诺米林、黄柏酮和异黄柏酮酸等，糖苷一般为D环开环加入一个糖基。柑橘果实中的柠檬苦素类化合物在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗炎和昆虫拒食等方面具有重要生物活性。且随着研究的不断深入，相关活性机制也正得到进一步阐明。柠檬苦素类化合物是引起桔汁苦味的主要原因之一。自1989年发现柠檬苦素类化合物具有激活谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性以来，人们对其生物活性进行了大量的研究。近年来研究发现，柠檬苦素类化合物具有抗癌、抗HIV、抗菌和昆虫拒食活性等作用。 

柠檬苦素与诺米林是柑橘中主要的柠檬苦素类化合物。柠檬苦素（limonin）,别名：黄柏内酯、吴茱萸内酯，CAS：1180-71-8，分子式：C₂₆H₃₀O_8,分子量：470.53，化学名称为Limonoate D-ring-lactone； Limonoic acid di-delta-lactone 。存在于柠檬或其他柑橘类水果中一类物质，纯品白色、味苦，结晶状。诺米林（nomilin),CAS ：11630-77-0，分子式：C₂₈H₃₄O₉,分子量：514.57，外观：白色粉末,味道：味苦。异黄柏酮酸，又名异奥巴叩酸，分子式：C₂₆H₃₀O₈，分子量：472.54，该化合物暂无标准品出售。 

随着柠檬苦素类化合物结构的确定以及对其生物活性研究, 柑橘果实柠檬苦素类化合物的开发利用具有广阔的前景。以前人们对柠檬苦素化合物的研究是为了将其从柑橘果实中除去, 以提高柑橘的商品价值。随着对柠檬苦素类化合物生理活性的阐明, 目前人们对柠檬苦素类化合物的需求日益增加。国内外对柠檬苦素类似物的大规模提取分离以及作为功能性食品添加剂的应用研究已经开始, 而且可以预测, 在不远的将来柠檬苦素类似物将被广泛用于功能性食品添加剂、抗癌药物或者杀虫剂中。由于柠檬苦素类化合物结构与极性的相似性，单一的采用一种纯化方式对几种物质的分离纯化变得极为困难。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从柚类果实中分离纯化柠檬苦素类化合物的方法，是一种从柚类果实囊衣中分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的方法，该方法可快速有效的从柚囊衣中同时分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸，具体通过以下步骤实现： 

    （1）样品提取与大孔树脂去杂：取一定质量冷冻干燥的柚囊衣粉末用80%丙酮溶液（料液重量比1:20）超声提取三次（40℃），4000 rpm离心20 min，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，溶于体积比为50%乙醇中，约400 mL上HZ-816大孔树脂，树脂的柱床体积（BV）为30 mL,上样流速1 mL/min。上样后的大孔树脂先用4 倍柱床体积（BV）水冲洗以去掉杂质，然后用体积比为75%乙醇400mL洗脱，洗脱流速为0.9 mL/min，收集洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得大孔树脂除杂后的粗提物粉末。

（2）高速逆流色谱（HSCCC）分离纯化：配制正己烷-正丁醇-甲醇-水（体积比2:1.3:1:3）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至1000 rpm，同时流动相以2 mL/min的速度通过HSCCC，待流出液分层后将大孔树脂粗提物粉末20mg溶于1mL上相与4mL下相的混合液中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱将不同的峰开始与结束之间的流出液分别收集，分为组份Ⅰ（进样后约60min-80min）,Ⅱ（进样后约125min-145min）,Ⅲ（进样后约150min-175min）。 

（3）半制备液相色谱（Semi-pre HPLC）分离制备：配制乙腈-甲醇-水（体积比30:25:45）溶剂体系，以8mL/min流速泵入semi-pre HPLC，基线稳定后，将所收集组份Ⅲ蒸干所得粉末溶于流动相中，进样体积不超过2 mL，根据色谱检测器采集的图谱将22-25min和30-40min之间的流出液分别收集，每管收集2 mL。用HPLC测定各管组分的纯度，分别合并含有单一柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的各管，在旋转蒸发仪上50℃条件下浓缩蒸干即得到柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸，回收率≥50%，产品纯度均≥95%。 

本发明纯化得到的柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）鉴定。 

本发明的另一个目的是提供所述的方法在柚类果实囊衣中分离纯化柠檬苦素类化合物中的应用，所述柠檬苦素类化合物包括柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸。 

本发明采用大孔树脂、HSCCC和semi-pre HPLC的联用技术，以柚类果实囊衣粉末为原料同时分离纯化得到高纯度的柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸。本发明相对于过去的工艺有如下优点：（1）不需要高温高压及惰性气体的保护，工艺简单；（2）不需要使用具有较大刺鼻气味的试剂，生产流程安全易操作；（3）可用于分离纯化性质非常接近的柠檬苦素类化合物，适用性广；（4）生产周期短，仅仅需要几个小时就可以完成整个纯化过程；（5）纯化产物回收率高，纯度高；（6）整个纯化过程通过HPLC和LC-MS进行精确定性定量，准确度高；（7）所用的溶剂可回收后重复利用，成本较低。 

附图说明

图1为本发明纯化工艺流程图。 

图2是粗提物的HPLC图谱，其中a为囊衣粗提物HPLC图谱，b为粗提物经HZ-816树脂纯化后HPLC图谱，c为粗提物经D4020树脂纯化后HPLC图谱，峰1为柚皮苷，2为新橙皮苷，3为异黄柏酮酸。4为柠檬苦素，5为诺米林。 

图3为实施例1的HSCCC图谱，图中组分Ⅰ为黄酮类杂质，组分Ⅱ为柠檬苦素，组分Ⅲ为诺米林和异黄柏酮酸的混合物。 

图4为实施例2的HSCCC图谱。图中组分Ⅰ为黄酮类杂质，组分Ⅱ为柠檬苦素，组分Ⅲ为诺米林和异黄柏酮酸的混合物。 

图5为经HSCCC纯化后的组份，组分Ⅰ（黄酮类杂质），组分Ⅱ（柠檬苦素），组分Ⅲ（诺米林和异黄柏酮酸的混合物）的HPLC图谱。 

图6为组份Ⅲ（诺米林和异黄柏酮酸的混合物）Semi-pre HPLC图谱。 

图7为经semi-pre HPLC纯化后异黄柏酮酸单体和诺米林单体HPLC图谱。 

图8为二级质谱鉴定图谱，其中a为大孔树脂，HSCCC和Semi-pre HPLC联用技术分离纯化得到的异黄柏酮酸单体二级质谱鉴定图谱；b为大孔树脂和HSCCC联用技术分离纯化得到的柠檬苦素单体二级质谱鉴定图谱；c为大孔树脂，HSCCC和Semi-pre HPLC联用技术分离纯化得到的诺米林单体二级质谱鉴定图谱。 

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 

实施例1   

本发明分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的操作方法按照如下步骤进行，参见图1： 

（1）大孔树脂粗提物粉末的制备：20g冷冻干燥的柚类果实囊衣用80%丙酮（料液重量比1:20）超声提取三次（40℃），4000 rpm离心10 min，合并三次上清液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，溶于50%乙醇中，约400 mL上D4020大孔树脂，柱床体积（BV）为30 mL, 上样流速1 mL/min。上样后的D4020大孔树脂先用水冲洗4 BV以去掉杂质，然后用80%乙醇洗脱柠檬苦素类化合物，共洗脱约400mL至流出液中检测不到柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸，洗脱流速为0.9mL/min，合并洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得大孔树脂粗提物粉末。该步纯化得到粗提物粉末0.17 g，粉末中柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的总含量≥50%，结果见图2c。

（2）HSCCC进一步分离柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸：配制正己烷-正丁醇-甲醇-水（1:0.9:1:3）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至1000 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层后进样大孔树脂粗提物粉末，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，如图3所示，将不同的峰开始与结束之间的流出液分别收集所得到的组份，分为组份Ⅰ（进样后约60min-80min）,Ⅱ（进样后约125min-145min）,Ⅲ（进样后约150min-175min）。用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的试管，在旋转蒸发仪上50℃蒸干即得到柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸。该步纯化得到柠檬苦素单体以及诺米林与异黄柏酮酸混合物，粉末中柠檬苦素纯度≥90%，诺米林与异黄柏酮酸混合物在粉末中比重≥95%，结果见图3。 

（3）Semi-pre HPLC将诺米林与异黄柏酮酸分离：配制乙腈-甲醇-水（30:25:45）溶剂体系，以8mL/min流速泵入semi-pre HPLC，基线稳定后，将所收集组份Ⅲ蒸干所得粉末溶于流动相中，进样，进样体积不超过2mL，根据色谱采集的图谱，如图6所示出现的吸收峰，将22-25min和30-40min之间的流出液分别收集；用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有单一诺米林和异黄柏酮酸的试管，在旋转蒸发仪上50℃条件下浓缩蒸干即得到诺米林和异黄柏酮酸，回收率≥50%，产品纯度均≥95%。 

实施例2

本发明分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的操作方法按照如下步骤进行，参见图1： 

（1）大孔树脂粗提物粉末的制备：20g冷冻干燥的佛香柚囊衣用80%丙酮（料液重量比1:20）超声提取三次（40℃），4000 rpm离心20 min，合并三次上清液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，溶于50%乙醇中，约400 mL上HZ-816大孔树脂，柱床体积（BV）为30 mL, 上样流速1 mL/min。上样后的HZ-816大孔树脂先用水冲洗4 BV以去掉杂质，然后依次用75%乙醇洗脱，洗脱液约400mL，洗脱流速为0.9 mL/min，将洗脱液在旋转蒸发仪上50℃蒸干得大孔树脂粗提物粉末0.18g。该步纯化得到的粗提物粉末中柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的总含量≥70%。结果参见图2b。

（2）HSCCC进一步分离柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸：配制正己烷-正丁醇-甲醇-水（2:1.3:1:3）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至1000 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层后进样大孔树脂粗提物粉末，根据色谱仪检测器采集的图谱分管收集各组分，如图4所示，将不同的峰开始与结束之间的流出液分别收集所得到的组份，分为组份Ⅰ（进样后约60min-80min）,Ⅱ（进样后约125min-145min）,Ⅲ（进样后约150min-175min）。用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的试管，在旋转蒸发仪上50℃蒸干即得到柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸。该步纯化得到柠檬苦素单体以及诺米林与异黄柏酮酸混合物，粉末中柠檬苦素纯度≥95%，诺米林与异黄柏酮酸混合物在粉末中比重≥95%，结果参见图4。 

（3）Semi-pre HPLC将诺米林与异黄柏酮酸分离：配制乙腈-甲醇-水（30:25:45）溶剂体系，以8mL/min流速泵入semi-pre HPLC，基线稳定后，将所收集组份Ⅲ蒸干所得粉末溶于流动相中，进样，进样体积不超过2mL，根据色谱采集的图谱，如图6所示出现的吸收峰，将22-25min和30-40min之间的流出液分别收集；用HPLC测定各组分的纯度，分别合并含有单一诺米林和异黄柏酮酸的试管，在旋转蒸发仪上50℃条件下浓缩蒸干即得到诺米林和异黄柏酮酸，回收率≥50%，产品纯度均≥95%。 

实施例3   本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定 

1、纯化材料的选择

新鲜的佛香柚类果实囊衣，冷冻干燥至恒重，用磨样机磨成粉末。精确称取一定量的囊衣干样粉末，用80%丙酮（料液比1:20）超声提取30 min (40℃)，提取液在离心机上4000 rpm离心10 min，如此重复三次，合并上清液，用于柠檬苦素类化合物的HPLC分析。HPLC流动相包括3mM磷酸（A）和色谱乙腈（B），采用梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm，条件为溶剂A：0min：85%，0-5min：85%-77%，5-25min：77%-74%，25-30min：74%-60%，30-45min：60%-54%，45-50min：54-85%。结果表明，囊衣中含有较高的柠檬苦素类化合物含量，且杂质较少，可作为纯化材料。结果参见图2a。

2、大孔树脂的选择 

在前人的基础上选择出3种对柠檬苦素类化合物具有较好纯化效果的树脂，其理化性质参见表1。

3、乙醇洗脱浓度的选择及树脂的确定 

提取液进3种大孔树脂，上样流速1 mL/min, 直至流出液中检测的柠檬苦素或诺米林含量为上样液中5%时停止上样。上样后的大孔树脂先用水冲洗4个柱床体积（BV），以洗掉提取液中的杂质，然后依次用50%，60%，70%，75%，80%，90%乙醇洗脱，每个梯度4 BV，洗脱流速为0.9mL/min，用HPLC检测各乙醇浓度下洗脱液中柠檬苦素和诺米林的含量，确定最适乙醇洗脱浓度。结果表明，75%乙醇条件下的HZ-816，80%乙醇条件下的D4020树脂能快速高效洗脱柠檬苦素和诺米林（参见表2），但HZ-816中杂质最少，含量最高（图2b），故本发明选用HZ-816树脂在75%的乙醇条件下洗脱液蒸干得大孔树脂粗提物粉末。经大孔树脂纯化过的粗提物3种柠檬苦素类化合物纯度提高，杂质减少。

4. HSCCC溶剂体系的选择与semi-pre HPLC体系确定 

通过测定分配系数（K）来初步筛选用于HSCCC的溶剂体系。将预先配好的不同的溶剂体系充分混匀，静置分层后，吸取同样体积的上下相，加入大孔树脂粗提物粉末，分别测定上下相中柠檬苦素和诺米林的峰面积，上下相峰面积二者之比即为二者的分配系数。结果表明，正己烷-正丁醇-甲醇-水（2:1.3:1:3）溶剂体系中，K（柠檬苦素）=0.8，K（诺米林）=1.8，二者之比在0.5-2范围内（参见表3）。故本发明应用该溶剂体系进行进一步纯化。经HSCCC进一步纯化得到纯度较高的粉末（参见图4），结果表明组份Ⅰ为杂质峰,组份Ⅱ为高纯度柠檬苦素,组份Ⅲ为诺米林和异黄柏酮酸（参见图5）。因此对组份Ⅲ进一步进行Semi-pre HPLC纯化，色谱条件为：乙腈-甲醇-水（30:25:45）溶剂体系，以8mL/min恒定流速，检测波长210nm，将两者分开，得到高纯度物质（参见图6,7）。三种物质结构经二级质谱（MS/MS）鉴定。质谱条件：ESI离子源，正离子模式(ESI⁺）；干燥气(N₂)温度：350℃；流速：10.0 L／min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；质量扫描范围：m/z 50～1000。质谱数据采集采用MRM模式。破碎方式与文献报道一致，确认为柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸（参见图8）。

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