一种检测水产品中喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，包括包被有喹诺酮类药物与载体蛋白偶联物的酶标板、抗体工作液、酶标二抗、喹诺酮类系列标准品、浓缩复溶液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液。本发明的检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒为多残留检测试剂盒，可以同时测定水产品(鱼肉、虾肉)样本中12种喹诺酮类药物的总残留量，本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测喹诺酮类药物的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明公开的试剂盒操作简便、费用低廉、灵敏度高，整个操作时间仅需45分钟，能够现场监控且适合大量样本的筛查。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测喹诺酮类药物的酶联免疫检测试剂盒，用于检测水产品(鱼、虾等) 中的喹诺酮类药物含量或残留量。属于免疫学检测领域。

技术背景

喹诺酮类抗菌药(4-quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类较新的合成抗菌药， 该类药物的开发可以追溯到1962年，Lesher从合成抗疟药氯喹中分离出一种副产品-萘啶酸， 喹诺酮类历经40多年的发展，共开发出了四代喹诺酮类药物，共计50多种药物。

喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶位，通过选择性的抑制细菌DNA促旋 酶与拓扑异构酶IV而造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂，主要作用于革兰阴 性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。

喹诺酮抗菌药按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代，第一代喹诺酮 类抗菌药的品种有萘啶酸(Nalidixic acid)和吡咯酸(Piromidic acid)等，第二代喹诺酮类抗菌药 的品种有新恶酸(Cinoxacin)和甲氧恶喹酸(Miloxacin)等，第三代喹诺酮类抗菌药的品种有诺 氟沙星(Norfloxaicin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)和 环丙沙星(Ciprofloxacin)等，第四代喹诺酮类抗菌药的品种有加替沙星(Gatifloxacin)与莫昔沙 星(Moxifloxacin)等。

喹诺酮类药物可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染及其他类的各 种感染，还可用于抗肿瘤和抗病毒作用，但该类药物对人体也存在很大的不良反应，如胃肠 道反应、中枢反应、可诱发癫痈、影响软骨发育、易产生结晶尿及易导致肝损伤等。

喹诺酮类药物残留分析通常包括：选用适当的溶剂提取，进一步利用液液萃取法、固相 萃取法等进行净化、浓缩，最后用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography， HPLC)、高效毛细管电泳法(Capillary electrophorctic，CE)、液相色谱质谱联用技术(Liquid  chromatography-mas spectrometry，LC-MS)等方法进行检测，有时还使用气相色谱法(Gas  chromatography，GC)、高效薄层色谱法(High pefformancthinlay erchromatogram，HpTLC)、微 生物法(Microbiological assay，MA)、免疫分析法(Immunoassay，IA)等测定。

目前的检测方法主要是仪器分析法，而目前的酶联免疫分析方法，只能检测一种或者几 种药物，对于种类较多的喹诺酮类药物还远远不能达到同时检测多残留的要求。同时，因为 酶联免疫试剂盒因为操作简单，省时，是各个国家检测兽药残留的首选方法。所以建立喹诺 酮类药物多残留酶联免疫检测试剂盒对于于严把食品安全的检验环节有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种喹诺酮类药物的酶联免疫检测试剂盒。

一种喹诺酮类药物的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体 内的试剂，其特征在于，所述试剂包括喹诺酮类药物的特异性单克隆抗体、辣根过氧化酶标 记的羊抗鼠二抗、喹诺酮类药物系列标准溶液、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗 涤液。

所述酶标板的各孔包被有以喹诺酮类药物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；其中所述包 被抗原浓度优选5.0μg/mL。

所述喹诺酮类药物系列标准溶液分别是0ng/mL，0.2ng/mL，0.6ng/mL，1.8ng/mL，5.4 ng/mL和16.2ng/mL。

所述酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，其工作浓度优选为1∶2000。

所述喹诺酮类药物抗体是由诺氟沙星衍生物与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动 物制得的单克隆抗体，其工作浓度优选为1∶64000。

所述喹诺酮类药物单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC NO.5885的氟喹诺酮类药物单克 隆杂交瘤细胞株D-3-1分泌产生的。

杂交瘤细胞株D-3-1已于2012年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC NO.5885。

所述显色液包括A液和B液，A液为过氧化氢脲溶液；B液为四甲基联苯胺溶液。

所述浓缩复溶液为pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

所述浓缩洗涤液为pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

所述包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。

所述封闭液为pH值为9.2，含有小牛血清的碳酸盐缓冲液。

本发明试剂盒最大检测范围为0ng/mL～16.2ng/mL。

附图说明

图1为诺氟沙星衍生物合成反应式。

图2为本发明喹诺酮类药物抗体的工作曲线。

具体实施方式

实施例1：本发明溶液的配制

本发明试剂盒中涉及的喹诺酮类药物标准溶液、酶标羊抗鼠抗体溶液、喹诺酮类药物抗 体溶液、底物显色溶液及洗涤溶液配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液 的主要成分及其配制方法是：

1、喹诺酮类药物标准溶液：以常规方法将喹诺酮类药物纯品用含有10％甲醇的0.05m mol/L，pH＝7.4的PBS配制成浓度分别为0ng/mL，0.2ng/mL，0.6ng/mL，1.8ng/mL，5.4ng/mL 和16.2ng/mL的喹诺酮类药物标准溶液，所述百分比为体积百分比。

2、酶标羊抗鼠抗体溶液：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用 洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度。

3、喹诺酮类药物抗体溶液：喹诺酮类药物抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆 抗体，将所得喹诺酮类药物抗体用洗涤溶液稀释成1∶64000的工作浓度。

4、底物显色溶液：A液配方为每1000mL去离子水中加入过氧化脲1g，柠檬酸10.3g， Na₂HPO₄·12 H₂O 35.8g，吐温-20100μL，调至pH＝5；B液配方为每1000mL去离子水中加入 四甲基联苯胺700mg，10.3g柠檬酸，调至pH＝2.6。

5、浓缩复溶液：pH值为7.4，含有10％卵清蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分 比为质量百分比。

6、浓缩洗涤液：pH值为7.2，含有体积百分比为0.8％吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂、 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。

7、包被缓冲液：pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。

8、封闭液：pH值为9.2，含有5％小牛血清、体积百分比为0.2％吐温-20、0.2mol/L的 碳酸盐缓冲液，所述百分比为体积百分比。

9、终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液。

实施例2：本发明酶标板的包被

本发明中包被酶标板采用将QNS-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，以设定的浓度， 设定的时间，在37℃恒温箱中反应包被。

本发明采用的包被液是pH＝9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被 的QNS-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用 的包被抗原浓度为5.0μg/mL。

包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN₃防止 变质。

本发明的酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、价格低廉、准确度高的特点， 可同时检测12种喹诺酮类药物的总残留量。有望在动物性食品，如水产品中的喹诺酮类药物 残留检测中发挥重要作用。

实施例3：衍生物、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备

(1)诺氟沙星衍生物合成

A，将诺氟沙星1mmol，溶于55ml三氯甲烷中，加入DCC 2mmol，DMAP催化剂适量， 对氨基苯乙酸乙酯1.5mmol，室温搅拌5h，TLC监测原料消失，过滤，将液相水洗，无水 NaS₂O₄干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/5)。

B，将上述产物溶于甲醇中，加NaOH0.76g，60℃室温搅拌5h，TLC监测原料消失，减 压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于1mol/L NaOH溶液，调节pH3～5，乙酸乙酯萃取，干燥，柱 层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/1)，得喹诺酮类半抗原。

(2)免疫原的合成

A，A液制备：取15mg诺氟沙星半抗原，溶解于1mL DMF中，取15mg EDC用0.2ml 水充分溶解后于加入溶解有半抗原的DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。

B，BSA偶联：称取BSA40mg，使之充分溶解在3mL PBS(PH＝7.2)中，将反应液A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，

C，透析：用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。 分装，于-20℃保存备用。

称取半抗原20mg和OVA 30mg，按上述步骤反应，得到包被抗原，供包被用。

(3)喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(QNS-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原 与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、 14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合 物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤 细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基 悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5 天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法 筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包 被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠 IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选， 先将细胞上清与100μg/mL的诺氟沙星等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的 酶标板中。同时用PBS取代诺氟沙星作对照，其余步骤同上。若经诺氟沙星阻断后的OD450nm 值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法 进行亚克隆化。

D，最后获得稳定分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株D-3-1，该细胞株已于2012 年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC NO.5885。

E，单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接 ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后 腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存 备用。

实施例4：ELISA检测方法的建立

(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

纵向用每种包被抗原按80.0μg/mL，40.0μg/mL，20.0μg/mL，10.0μg/mL，5.0μg/mL， 2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL的系列稀释度包被酶标板，100μL/孔，置于37℃恒温箱 2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入 50μL/孔一系列稀释的抗体(1∶1000至1∶512000)，再加入50μL/孔的1∶2000的辣根过氧化酶- 羊抗鼠IgG抗体，室温(20～25℃)孵育30min，洗板五次，最后一次拍干；分别加入底物显 色液A液50μL/孔，B液50μL/孔，室温(20～25℃)孵育15min，测定吸光值。以吸光度值 随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测 定。

(2)抗体灵敏度的测定

根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1∶64000， 包被抗原浓度为5.0μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：

A，包被：用0.05M pH＝9.6的碳酸盐包被溶液将包被抗原配成5.0μg/mL的溶液，每个 聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。

B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一 次，拍干。

C，加样：加不同浓度的喹诺酮类药物溶液50μL/孔，加入50μL/孔酶标二抗溶液，再加 入50μL/孔抗体工作液于上述已封闭的反应孔中，室温(20～25℃)避光孵育30min，然后洗 板五次，最后一次拍干。

D，显色：加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板 膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。

E，测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长 450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。

F，检测结果以抑制率计算：

百分吸光率(％)＝B/B₀，B是标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B₀是0ppb标准溶 液的平均吸光度值。

计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。

实施例5：检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒组成

A，包被有包被原(QNS-OVA)的固相载体(酶标板)；

B，标准品：0ng/mL，0.2ng/mL，0.6ng/mL，1.8ng/mL，5.4ng/mL，16.2ng/mL。

C，抗体工作液：用人工免疫抗原(QNS-BSA)免疫动物制备所得的单克隆抗体，将所 得喹诺酮类药物抗体用洗涤溶液稀释成1∶64000工作浓度。

D，酶标二抗：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG用洗涤溶液稀释成1∶2000的 工作浓度。

E，底物显色液：A液：1000mL去离子水中加入过氧化脲1g，柠檬酸10.3g，Na₂HPO₄·12 H₂O 35.8g，吐温-20100μL，调至pH＝5；B液：1000mL去离子水中加入四甲基联苯胺700mg， 10.3g柠檬酸，调至pH＝2.6。

F，终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液。

G，浓缩复溶液：pH值为7.4，含有10％吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂、0.2mol/L的磷 酸盐缓冲液。

H，浓缩洗涤溶液：所述浓缩洗涤液为pH值为7.2，含有0.8％吐温-20、0.01‰硫柳汞防 腐剂、0.01的磷酸盐缓冲液。

实施例6：检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒的应用

(1)试剂的配制

A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1∶19倍稀释后使用。

B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1∶4倍稀释后使用。

C，0.1M氢氧化钠溶液：称取2.0g氢氧化钠，加500mL去离子水溶解混匀。

(2)水产品(鱼、虾)样品前处理：

——取2.0±0.05g均质样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入1mL 0.1M氢氧化钠溶液， 再加入7mL乙腈，用振荡器充分振荡5min；3000g以上，室温(20-25℃)离心10min；

——取2mL上清液于10mL玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷用涡旋仪涡动30s，再加入1mL复溶工作液，涡动30s，3000g以 上，室温(20-25℃)离心5min；

——除去上层有机相，取下层50μL用于分析。

(3)检测步骤

A，加样：加标准品/样品50μL到对应的微孔中，直接加入酶标二抗50μL/孔，再加入抗 体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；

B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，洗涤5次，拍 干；

C，显色：加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板 膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。

D，测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波 长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。

本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B) 除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式 为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以喹诺酮类药物标准品溶液的浓度(ng/mL)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴， 绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的喹诺酮 类药物含量则可从标准曲线上读出。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析， 整个检测过程最多只需45分钟即可完成。

本发明检测喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法定性或定量检测样 品中喹诺酮类药物的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测 大批量样品；采用高特异性的喹诺酮类药物单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检 验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免 疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于 大批量样品筛选的定性、定量。本发明的试剂盒将在喹诺酮类药物的检测中发挥重要作用。

实施例7试剂盒技术参数的确定试验

(1)标准品精密度试验

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒， 每板各抽出20个微孔，测定0.6ng/mL标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

表1标准可重复性试验(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10个酶标板的20个酶标孔变异系数在 3.4％～11.6％之间，批间变异系数为7.7％，符合精密度小于或等于25％的规定。

(2)样本精密度和准确度试验

以1.0μg/kg和2.0μg/kg浓度的喹诺酮类药物对鱼肉和虾肉样本进行添加测定，分别取三 个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复6次，计算变异系数，结果见表2～3。

表2鱼肉样本精密度和准确度试验

表3虾肉样本精密度和准确度试验

结果表明，鱼肉样本添加回收率在68.0％～99.5％之间，虾肉样本添加回收率在 66.0％～99.0％之间，符合了《农业部文件》农医法【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判 标准中第四点准确度标准。鱼肉样本的板内变异系数均在2.9％～11.3％之间，批内变异系数在 6.6％～11.0％之间，虾肉样本的板内变异系数均在3.7％～11.5％之间，批内变异系数在 4.5％～11.1％之间，符合了《农业部文件》农医法【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标 准中第四点精密度标准。

(3)交叉反应率试验

以环丙沙星作为标准，设环丙沙星的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药 物均为与环丙沙星结构或者功能相似的喹诺酮类药物：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达 氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、恶喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙 星、双氟沙星、沙拉沙星。按试剂盒程序操作，但加入的竞争物分别为不同的喹诺酮类类似 物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC₅₀)。交叉反应率(％CR)即为 抗体对环丙沙星的IC₅₀与抗体对氟喹诺酮类竞争物的IC₅₀之比的百分数，按下式进行计算：

结果列于表4：

表4喹诺酮类药物试剂盒特异性试验

  竞争物   IC₅₀(ng/mL)   交叉反应率(％)   环丙沙星   0.713   100.0   恩诺沙星   0.859   83.0   氧氟沙星   0.712   100.0   达氟沙星   0.951   75.0   诺氟沙星   0.450   158.6   洛美沙星   0.990   72.0   培氟沙星   0.422   169.0   依诺沙星   0.857   83.2   恶喹酸   0.784   91.0   氟甲喹   0.977   73.0   麻保沙星   0.825   86.4   氨氟沙星   0.715   100.0   双氟沙星   891.250   ＜0.1   沙拉沙星   1782.500   ＜0.1

(4)试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％ 抑制浓度、喹诺酮类药物添加实际测定回收率均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中， 会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置15天，进行加速老化实验，结 果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒可能发生冷冻情况，将试剂盒放入-20 ℃冰箱冷冻15天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以 在2～8℃至少保存12个月以上。