分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法

摘要

本发明是一种分离纯化缘管浒苔（

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶（EC 1.15.1.1）是催化超氧化物自由基阴离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶，是生物体内重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。它具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。超氧化物歧化酶在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。超氧化物歧化酶广泛应用于食品、化妆和医药领域，海洋来源的超氧化物歧化酶具有催化温度低、抗疲劳等特点。从海洋植物出发，获得超氧化物歧化酶是今后研究和开发这类酶的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离简单、节约成本的分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法。

本发明所涉及的缘管浒苔是在中国江苏省连云港海域的海水中采集得到的，采集样本时间为2012年6月中旬。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，本发明是一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法，其特点是，其步骤如下：（1）样品处理：将采集的缘管浒苔先经过海水清洗去除泥沙和其他杂质，再用自来水和去离子分别清洗三次，挤干水；然后剪碎放入匀浆机中，并按1克浒苔加入3毫升50mM磷酸缓冲液、pH 7.4、含1 mM EDTA的比例，向匀浆机中加入4℃的50mM磷酸缓冲液，混匀并充分破碎浒苔细胞后将匀浆液置于4℃温度下冷藏2 h，然后取出过滤，取滤液在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液；

（2）硫酸铵盐析：向上述上清液中先加入硫酸铵至50%饱和度，在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至70% 饱和度, 在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，将沉淀物用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶解并透析得酶液；

（3）离子交换层析：将上述酶液装入层析柱中，层析柱选用GE healthcare的Q-sepharose FF阴离子交换层析填料，安装到Bio-Rad双流相快速蛋白层析仪上，柱床先用10 mM 、pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，设置程序分别进样，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为800 mM氯化钠，流速0.8 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液合并和超滤浓缩，进行凝胶过滤层析；

（4）凝胶过滤层析：将上述洗脱液按程序进入GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液为10 mM、 pH7.4，含150 mM 氯化钠的磷酸缓冲液，洗脱流速控制为0.3 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥得到缘管浒苔铁超氧化物歧化酶。

本发明方法简单合理，具有良好的可操作性，并且成本低，应用该方法将缘管浒苔铁超氧化物歧化酶纯化了103.6倍，回收率为19.1%，最终酶的比活力达1750 U/mg蛋白。

附图说明

图1离子交换层析色谱图。

图2凝胶过滤层析色谱图。

图3 SDS聚丙稀铣胺凝胶电泳， 泳道1是缘管浒苔超氧化物歧化酶，泳道2是Marker。

图4 凝胶过滤层析测量酶的分子质量。

图5 抑制剂法检测超氧化物歧化酶的类型。泳道1：酶经去离子水处理，泳道2：酶经5 mM氰化钾处理，泳道3：酶经5 mM过氧化氢处理，泳道4：酶经5 mM SDS处理。

图6 酶的催化温度曲线和热稳定性。■表示催化温度，●表示热稳定性。

图7 酶的pH稳定性图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法，其步骤如下：（1）样品处理：将采集的缘管浒苔先经过海水清洗去除泥沙和其他杂质，再用自来水和去离子分别清洗三次，挤干水；然后剪碎放入匀浆机中，并按1克浒苔加入3毫升50mM磷酸缓冲液、pH 7.4、含1 mM EDTA的比例，向匀浆机中加入4℃的50mM磷酸缓冲液，混匀并充分破碎浒苔细胞后将匀浆液置于4℃温度下冷藏2 h，然后取出过滤，取滤液在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液；

（2）硫酸铵盐析：向上述上清液中先加入硫酸铵至50%饱和度，在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至70% 饱和度, 在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，将沉淀物用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶解并透析得酶液；

（3）离子交换层析：将上述酶液装入层析柱中，层析柱选用GE healthcare的Q-sepharose FF阴离子交换层析填料，安装到Bio-Rad双流相快速蛋白层析仪上，柱床先用10 mM 、pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，设置程序分别进样，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为800 mM氯化钠，流速0.8 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液合并和超滤浓缩，进行凝胶过滤层析；

（4）凝胶过滤层析：将上述洗脱液按程序进入GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液为10 mM、 pH7.4，含150 mM 氯化钠的磷酸缓冲液，洗脱流速控制为0.3 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥得到缘管浒苔铁超氧化物歧化酶。 

实施例2，一种如实施例1所述分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法，一、纯化方法步骤如下：1.1样品处理：将采集的缘管浒苔先经过海水清洗去除泥沙和其他杂质，再用自来水和去离子分别清洗三次，挤干水于-40℃冰箱冷冻待用；

将处理过的浒苔剪碎，放入匀浆机中，并按1克浒苔加入3毫升预冷的50mM磷酸缓冲液、pH 7.4、含1 mM EDTA的比例，向匀浆机中加入4℃的50mM磷酸缓冲液，混匀并充分破碎浒苔细胞后将匀浆液置于4℃温度下冷藏2 h，然后取出匀浆液，用八层干净的纱布过滤，取滤液在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液备用；

1.2硫酸铵盐析：向上述上清液中先加入硫酸铵至50%饱和度，在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至70% 饱和度, 在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，将沉淀物用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶解并透析得酶液；

1.3离子交换层析，将硫酸铵盐析并透析过的酶液进行离子交换层析进一步纯化超氧化物歧化酶。将上述酶液装入层析柱中，层析柱选用GE healthcare的Q-sepharose FF阴离子交换层析填料，安装到Bio-Rad双流相快速蛋白层析仪上，柱床先用10 mM 、pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，设置程序分别进样，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为800 mM氯化钠，流速0.8 mL/min，检测洗脱液的超氧化物歧化酶和蛋白浓度，结果如图1所示，洗脱过程一共出现4个蛋白吸收峰，其中第3个吸收峰有超氧化物歧化酶活力，将这个峰的洗脱液收集保存，进行下一步的实验；

1.4凝胶过滤层析：将上述洗脱液按程序进入GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液先用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为150mM 氯化钠，流速控制为0.3 mL/min，洗脱结果如图2所示，有4个蛋白吸收峰，检测洗脱液，其中第3个峰检测得到超氧化物歧化酶活力，收集含有酶活力的洗脱液，透析并冷冻干燥得到缘管浒苔铁超氧化物歧化酶。 

二、本发明纯化的缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的部分性质

本发明纯化的缘管浒苔铁超氧化物歧化酶，对其性质进行了研究，基本摸清该酶的部分特性。

2.1超氧化物歧化酶活力的检测方法：

超氧化物歧化酶活力的检测采用邻苯三酚自氧化法。20 uL酶液与1.5 mL去离子水和1.43 mL Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.2）混匀，于25℃水浴锅中温育10 min，加入50 uL 6 mM邻苯三酚溶液立即开始计时，30 s后于325 nm处测量吸光值，在4 min内每隔30 s测量一个数值。空白实验由去离子水替代酶液。

2.2酶的相对分子量：

纯化的缘管浒苔超氧化物歧化酶进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），结果如图3所示，图中显示一条带，说明该酶已纯化至电泳纯，对应Marker得知该酶的分子量大约是23 kDa。

同时将纯化的缘管浒苔超氧化物歧化酶进行凝胶过滤层析测量酶的分子量。选用GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液为10 mM pH7.4的磷酸缓冲液（含150 mM 氯化钠），流速控制为0.3 mL/min，分子Marker选择磷酸化酶b（97 kDa），牛血清白蛋白（66 kDa），蛋清白蛋白（44.3 kDa）和细胞色素C（12.3 kDa）。结果如图4所示，缘管浒苔超氧化物歧化酶的分子量大约是46 kDa，由于本方法是在非变性条件下测量酶的分子量，而SDS-PAGE是在变性条件下测量分子量，SDS可能使超氧化物歧化酶分子中的亚基断开。结果表明缘管浒苔超氧化物歧化酶是一个包含两个亚基的酶，分子量为46 kDa，每个亚基的分子量是23 kDa。

2.3同工酶类型的检测：

将纯化的酶进行活性凝胶电泳，电泳结束后将凝胶分别切割分开，并于不同抑制剂中处理，再用NBT染色，最终在荧光灯下照射显色。结果如图5所示，泳道1、2、3和4分别经过去离子水、5 mM氰化钾、5 mM过氧化氢和5 mM SDS处理1 h，该酶对氰化钾和SDS不敏感而容易被过氧化氢抑制，因此缘管浒苔超氧化物歧化酶是一个铁型超氧化物歧化酶。

2.4酶的适宜催化温度和热稳定性：

纯化的超氧化物歧化酶于0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃水浴锅中测量酶活力，结果如图6所示，在35℃时酶达到最大催化效率，且随着温度的升高或降低，酶活力逐渐下降。实验结果还发现在0℃时酶也具有一定催化能力，结果表明缘管浒苔铁超氧化物歧化酶是一种适冷酶。实验同时在0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃检测酶的热稳定性，将纯化的缘管浒苔铁超氧化物歧化酶在上述温度的水浴锅（0℃于冰水混合物中）保温1 h后，同时冷却并于35℃下测量酶活力，并计算相对酶活力。结果如图6所示，酶在低于35℃的水浴锅中保温1 h保持100%相对酶活力，超过40℃酶的稳定性逐渐下降。

2.5酶的pH稳定性：

检测该超氧化物歧化酶的pH稳定性，首先将酶与不同的缓冲液混合，并于25℃水浴锅中温育1 h，再测量酶活力，并以最大酶活力为100%计算相对酶活力。50 mM不同pH的缓冲液：醋酸缓冲液（pH 3.0-6.0），磷酸缓冲液（pH 6.0-7.5），Tris-HCl缓冲液（7.5-9.0）和碳酸缓冲液（pH 9.0-11.0）。结果如图7所示，酶液的pH稳定性较好，在pH 5.0-10.0范围内保持80%以上相对酶活力，最高点在pH 7.0。

2.6金属离子对酶的影响：

检测金属离子对酶的影响，首先将酶与不同金属离子盐混合，终浓度为5 mM，并于35℃测量酶活力，并以最大酶活力为100%计算相对酶活力。结果如表1所示，Cu²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺和Ca²⁺对酶活力有轻微促进作用，Ag⁺，Al³⁺和Co²⁺对酶有不同程度的抑制作用，其它离子对酶的影响不大。

表1 金属离子对缘管浒苔铁超氧化物歧化酶活力的影响

2.7 酶的N端氨基酸序列：

采用Edman法测量纯化的缘管浒苔超氧化物歧化酶的N端氨基酸序列，结果测得其N端的前十一个氨基酸序列为ALELKAPPYEL。