一种测定蔬果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹残留的方法

摘要

本发明涉及一种测定蔬果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹残留的方法，具体步骤包括:样品的制备；用磷酸处理样品；用乙腈提取目标物；去除提取液中的磷酸和水溶性杂质；用弗罗里硅土小柱和氨丙基粉进一步净化；用Agilent7890A气相色谱仪—电子捕获检测器进行检测，该测定方法对水果蔬菜样品用5%磷酸处理，避免样品在粉碎制备过程中四种农药的损失，适用于所有蔬菜和水果中对这四种农药残留的测定，且回收率均大于80%，该测定方法使得蔬菜和水果中这四种农药残留量测定更加准确可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及农药残留的检测及应用技术领域，特别涉及测定蔬菜水果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹农药残留量的测定。

背景技术

百菌清是一种非内吸性的取代苯类广谱性杀菌剂，克菌丹、灭菌丹和敌菌丹是一类多作用点的酞酰亚胺类广谱保护性杀菌剂，这四种杀菌剂对多种作物的真菌病害灭杀效果好，药害小，且有预防作用，广泛应用于水果蔬菜等农作物上。国外发达国家已经明确限定这几种农药在蔬菜水果中的最高残留限量，如日本肯定列表中规定蔬菜水果中敌菌丹不得检出，萝卜和苹果中百菌清的最高残留限量（MRL）分别为0.1mg/kg和2.0mg/kg，欧盟规定萝卜和菠菜中克菌丹的最高残留限量为0.1mg/kg等。这四种农药在碱性环境下不稳定，在有些蔬菜水果中的添加回收率低于35%，现有的文献检测方法和标准方法，多数没有涉及这四种农药在碱性环境下不稳定的问题，有的文献和标准方法则在样品打碎后，提取前加入磷酸或ZnAc溶液来提高克菌丹、灭菌丹、敌菌丹和百菌清的稳定性，但这四种农药在某些样品打碎时就会降解，因此作为一个阳性样品，在样品制备时直接将样品打碎，即使提取前再加磷酸来改变提取环境的pH值，并不能得到准确可靠的定量结果。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种测定蔬果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹残留的方法，该方法回收率高、测定更加准确。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种测定蔬果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹残留的方法，其特征在于：具体步骤包括:

1、样品的制备：将叶菜类样品切成2—3 cm的段，果实类样品切成长、宽、高约2—3cm的块；

2、用磷酸处理样品：加入磷酸溶液对样品进行处理，搅碎、混合，制备成均匀样品；

3、用乙腈提取目标物：步骤2所得样品内加入乙腈，进行高速均质和离心，离心后得到提取液，然后将提取液进行减压浓缩；

4、去除提取液中的磷酸和水溶性杂质：固相支持液液萃取柱内部填充Hydromatrix-硅藻土吸附剂，将浓缩后提取液过固相支持液液萃取柱，平衡10min，用不溶于水的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，进行浓缩至近干，待净化；

5、用弗罗里硅土小柱和氨丙基粉进一步净化：用10mL正己烷活化小柱，用3×2mL正己烷将上述制备的样品残渣转移至弗罗里硅土小柱中，然后用5%乙酸乙酯-正己烷15mL洗脱，收集洗脱液，并在40℃水浴上减压浓缩至近干，用正己烷准确定容至2.0mL，加入氨丙基粉150mg，涡混2分钟，过0.45μm有机相滤膜入进样小瓶，供气相色谱测定； 

6、用Agilent7890A气相色谱仪—电子捕获检测器进行检测：利用Agilent7890A气相色谱仪—电子捕获检测器来测定，选用DB-5石英毛细管柱，将色谱柱温度设为60℃，保持1.25min；以20℃/min升至180℃，保持7min；再以5℃/min升至230℃，保持7min；再以30℃/min升至270℃，保持5min；检测器温度设为300℃，进样口温度设为250℃，用高纯氮作载气，将柱流量设为1.4mL/min，尾吹气流量30mL/min, 将进样小瓶摆放到气相色谱仪的样品盘中，待仪器稳定后，进样测定，进样量1μL；外标法定量，计算农药的测定值。

以下是对上述技术方案的进一步优化：

加入磷酸溶液对样品进行处理的用量为：称取100g样品，加入5%磷酸溶液50g。

用乙腈提取目标物的步骤包括：称取用5%磷酸溶液处理好的样品15g，置于100mL塑料离心管中，加入乙腈40mL，高速均质2min，以5000r/min速度进行离心5min，提取液移入旋转蒸发瓶中，于旋转蒸发仪上在40℃水浴条件下减压浓缩。

所述Hydromatrix-硅藻土吸附剂是以硅藻属的化石为原料，经过高温纯化制成的具有高水可润湿比表面的吸附剂。

所述步骤4中乙酸乙酯的用量为100ml。

所述步骤4中，将洗脱液置于旋转蒸发仪中，控制旋转蒸发仪的压力为0.016MPa，于40℃水浴减压浓缩。

所述高纯氮为纯度＞99.999%的氮气。

气相色谱仪的进样口衬管用干净的惰性化内表面的衬管。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比具有以下优点：

该检测方法对水果蔬菜样品用5%磷酸处理，避免样品在粉碎制备过程中四种农药的损失，再用固相支持液液萃取技术除酸及水溶性杂质，提取液浓缩后用Florisil固相萃取柱和氨丙基粉净化，用气相色谱仪-电子捕获检测器检测，在检测油菜、萝卜、西葫芦、菜花、桃子、苹果、冬瓜7种水果蔬菜基质时无干扰现象出现；该测定方法适用于所有蔬菜和水果中对这四种农药残留的测定，且回收率均大于80%，该测定方法使得蔬菜和水果中这四种农药残留量测定更加准确可靠。

附图说明

图1是本发明实施例中添加 0.02mg/kg混标的萝卜在不同浓度磷酸处理下的回收率对比：

X轴—磷酸溶液的浓度（%）

Y轴—回收率（%）

曲线1—百菌清     曲线2—克菌丹     曲线3—灭菌丹    曲线4—敌菌丹；

图2 是本发明实施例中经5%磷酸处理的空白萝卜的色谱图；

图3 是本发明实施例中经5%磷酸处理的添加0.02 mg/kg混标萝卜的色谱图。

具体实施方式

实施例1

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

一种测定蔬果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹残留的方法，具体步骤如下：

1、样品的制备：

将叶菜类样品切成2—3 cm的段，果实类样品切成长、宽、高约2—3cm的块。

2、用磷酸处理样品：

准确称取100g样品，加入5%磷酸溶液50g，搅碎、混合，制备成均匀样品。

由于百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹四种农药在碱性环境中不稳定，而且在西葫芦、油菜、萝卜、菜花、桃子等基质样品打碎时就会降解，所以在样品制备时采用加磷酸的方法，避免了样品在粉碎制备过程中四种农药的损失。用磷酸溶液处理样品，不但可以提高这四种农药在这些基质中的回收率，还可以去除一些色素及杂质的干扰。 

为了选取最佳的磷酸溶液浓度，用0%、3%、5%、10%、15%、20%、25%的磷酸溶液分别对样品进行处理，切块样品加磷酸前添加2μg农药混合标准溶液做添加回收。

添加 0.02mg/kg混标的萝卜在不同浓度磷酸处理下的回收率对比见图1；

用5%磷酸处理的空白萝卜色谱图见图2；

经5%磷酸处理的添加0.02 mg/kg混标的萝卜色谱图见图3。

实验表明，未经磷酸处理、0%磷酸溶液处理的回收率情况基本相同，均低于35%；3%磷酸处理的回收率明显提高，但敌菌丹的回收率仍偏低，为68.8%，百菌清与克菌丹的回收率也低于80%；5%磷酸处理的4种农药的添加回收率均高于85%；10%、15%、 20%、25%磷酸处理的回收率情况与5%磷酸处理基本相同，但磷酸浓度高了一是对前处理设备有影响，二是用量大了浪费，因此选用5%磷酸对样品进行处理。

西葫芦、油菜、萝卜、菜花、桃子、苹果、冬瓜7种不同基质样品制备时用磷酸溶液处理与不用磷酸溶液处理的添加回收率对比：

7种不同基质样品制备时用磷酸溶液处理与不用磷酸溶液处理的添加回收率对比：

取西葫芦、油菜、萝卜、菜花、桃子、苹果和冬瓜5种样品，将油菜切成2—3 cm的段，其它4种样品切成长、宽、高均为2—3cm的小块，按以下三种方式分别制备成三种不同的添加回收样品，A：制备样品时直接将样品搅碎，称取10g样品，加0.2μg百菌清、克菌丹、灭菌丹和敌菌丹农药混合标准溶液,涡混5分种，使农药与样品充分混合；B：制备样品时直接将样品搅碎，称取10g样品，加0.2μg百菌清、克菌丹、灭菌丹和敌菌丹农药混合标准溶液,涡混5分种，使农药与样品充分混合，然后在加溶剂提取之前加5%的磷酸2.5mL；C：称取100g切块样品, 添加2μg农药混合标准溶液，加5%的磷酸溶液50g，搅碎混合均匀后称取样品15g。

将制备称取好的A、B、C三种添加回收样品按照样品前处理步骤操作，结果见表1。

表1三种不同的添加回收样品的回收率对比

由表1中数据可以看出，制备样品时直接将样品搅碎，百菌清、克菌丹、灭菌丹、敌菌丹这四种农药在有些基质如西葫芦、油菜、萝卜中的添加回收率很低，均低于35%，而制备样品时直接将样品搅碎，添加农药标准溶液后涡混5分种，使农药与样品充分接触混合，提取之前再加磷酸溶液对添加回收率的提高没有作用，但是样品制备前先加磷酸溶液再搅碎样品，回收率则有显著提高，均大于80%。

由此可以得出结论，这类基质的阳性样品，如果直接将样品打碎，就会在样品制备过程中造成这四种农药的损失，所以样品制备前不加磷酸溶液处理就不能得到准确的定量结果。而制备样品时直接将样品搅碎，对于这四种农药的添加回收率没有影响的基质如苹果、冬瓜，制备样品前先加磷酸溶液再搅碎，对于回收率也没有任何影响，所以对蔬菜和水果中的百菌清、克菌丹、灭菌丹、敌菌丹检测时，制备样品前均可先加磷酸再搅碎。

该测定方法能准确测定蔬菜和水果中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹农药残留量，不仅大大提高了提取效率和添加回收率，也增强了净化效果。现有检测方法仅仅对一部分蔬菜和水果基质中的百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹的残留量有较好的回收率，但在西葫芦、油菜、萝卜、菜花、桃子等基质中的回收率却低于35%。而本测定方法适用于所有蔬菜和水果中对这四种农药的测定，且回收率均大于80%。本测定方法使得蔬菜和水果中这种农药残留量测定更加准确可靠。

3、用乙腈提取目标物：

称取用5%磷酸溶液处理好的样品15.0g，置于100mL塑料离心管中，加入乙腈40mL，于均质机上高速均质2min，以5000r/min速度进行离心5min，提取液移入旋转蒸发瓶中，于旋转蒸发仪上在40℃水浴条件下减压浓缩至20 mL左右。

提取溶剂的选择：根据净化方式的需要，提取溶剂需要与水互溶的溶剂，乙腈和丙酮是很好的选择，但丙酮在提取目标物的同时，也能提取出更多的杂质，而乙腈提取的杂质相对较少，所以选择乙腈做提取溶剂。

4、去除提取液中的磷酸和水溶性杂质：

固相支持液液萃取柱内部填充Hydromatrix-硅藻土吸附剂，该吸附剂以硅藻属的化石为原料，经过高温纯化，有高的水可润湿比表面，将浓缩后的含有水份的有机溶剂提取液过固相支持液液萃取柱，提取液中仅有有机溶剂没有水份回收率会很低，平衡10min，用100ml不溶于水的乙酸乙酯洗脱，这样磷酸和水溶性杂质保留在固相支持液液萃取柱的硅藻士吸附剂中，而不溶于水的农药则被乙酸乙酯洗脱下来。收集洗脱液，控制旋转蒸发仪的压力在0.016MPa，于40℃水浴减压浓缩至近干，待净化；

无机酸会对气相色谱柱的固定相造成损伤，导致部分固定液流失，降低色谱柱性能，污染气相检测器，所以在样品净化时需要去除提取液中的磷酸溶液。传统的液液萃取方法（LLE）可以把提取液中的磷酸除去，但这种方法操作繁琐，要用玻璃仪器分液漏斗萃取2—3次，在萃取过程中易发生乳化现象，影响回收率和净化效果。固相支持液液萃取方法（SSLLE）是一种有效的去除提取液中磷酸和水溶性杂质的方法，这种方法避免了传统的液液萃取方法造成的乳化现象，且柱回收率高，净化效果好，结果重复性好。

5、用弗罗里硅土小柱和氨丙基粉进一步净化：

用10mL正己烷活化小柱，用3×2mL正己烷将上述制备的样品残渣转移至弗罗里硅土小柱中，然后用5%乙酸乙酯-正己烷15mL洗脱，收集洗脱液，并在40℃水浴上减压浓缩至近干，用正己烷准确定容至2.0mL，加入氨丙基粉150mg，涡混2分钟，过0.45μm有机相滤膜入进样小瓶，供气相色谱测定。

由于四种农药上机检测时受仪器状态影响很大，克菌丹、灭菌丹和敌菌丹则尤为严重，因此需选择一种净化效果好的净化方法，尽量减少对仪器进样口的污染。用硅镁吸附剂净化需手动装填层析柱，比较烦琐。石墨炭柱对百菌清的吸附作用很强，硅胶对克菌丹、敌菌丹及灭菌丹的吸附作用很强，用5%乙酸乙酯-正己烷难以洗脱，采用弗罗里硅土小柱（Florisil）来净化，5%乙酸乙酯-正己烷洗脱，并优化了洗脱液的用量，经实验洗脱液为10mL时这四种农药能被完全洗脱下来，考虑到实验的重复性和再现性，确定5%乙酸乙酯-正己烷洗脱体积为15mL。为进一步增加净化效果，获得更准确可靠的结果和良好的数据重复性，在用SPE小柱净化后进一步用氨丙基粉进行净化，以除去样品中的脂肪酸和极性色素等杂质。

6、用Agilent7890A气相色谱仪—电子捕获检测器进行检测：

利用Agilent7890A气相色谱仪—电子捕获检测器来测定，选用DB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，将色谱柱温度设为60℃，保持1.25min；以20℃/min升至180℃，保持7min；再以5℃/min升至230℃，保持7min；再以30℃/min升至270℃，保持5min。检测器温度设为300℃，进样口温度设为250℃。用纯度＞99.999%的高纯氮作载气，将柱流量设为1.4mL/min，尾吹气流量30mL/min, 将进样小瓶摆放到气相色谱仪的样品盘中，待仪器稳定后，进样测定，进样量1μL。

外标法定量，计算农药的测定值。

为了得到准确的定量结果和良好的数据重复性，气相色谱仪的进样口衬管需用干净的惰性化内表面的衬管，并保证色谱柱的柱效要高，以减少种农药进样后造成的分解或吸附。

对西葫芦、油菜、萝卜、苹果、冬瓜、菜花、桃子7种基质中百菌清、克菌丹、敌菌丹和灭菌丹四种农药的回收率和精密度按上述步骤进行测定：

回收率测定是在100g阴性样品中添加1μg混合标准溶液，加入5%磷酸溶液50g, 搅碎混合均匀后称取样品15g，按照样品前处理步骤操作，结果见表2。

表2 7种不同样品添加4种农药的回收率及相对标准偏差(n=6)

由表2中数据可见，这四种农药在7种蔬菜和水果中的添加回收率均大于80%，相对标准偏差均小于10.4%，回收率高且精密度好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。