一种酶促制备(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的方法

摘要

本发明涉及一种酶促制备(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的方法，其以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，使该底物在酮还原酶的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，特别是，所述的酮还原酶为胞内酶，且为整细胞酶，且使反应在pH6.5～7.5的水相缓冲液中以及温度35～38℃下进行，其中不使用辅酶因子、不添加有机溶剂。本发明方法与已有的生物制备方法相比，无需使用昂贵的辅酶因子，也无需使用有机溶剂，成本更低，操作更简单，且底物转化率高，产品收率高，因而本发明方法更适于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的生物制备方法。

背景技术

(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯是制备(S)-奥拉西坦的一个必不可少的关键中间 体，其结构如下：

(S)-奥拉西坦是一种促智药，能改善提高人的思维，记忆力和学习能力。 奥拉西坦临床上用于轻中度血管性痴呆、老年性痴呆以及脑外伤等症引起的记 忆与智能障碍。目前临床使用的都是外消旋体奥拉西坦，国内外大量资料表明 (S)-奥拉西坦的药效明显优于(R)-奥拉西坦。大量实验证明，与外消旋体奥 拉西坦相比，(S)-奥拉西坦可以显著改善由于东莨菪碱造成的小鼠学习记忆 能力损伤。然而，目前国内外均未见(S)-奥拉西坦上市。(S)-3-羟基-4-氯丁酸 乙酯（I）的合成路线目前国内外报道的主要都是通过纯化学方面合成，如硼 氢化钠还原，硼烷还原，金属参与的不对称还原，这些方法在产业化方面都受 到很大的局限性。稀有金属参与的不对称还原成本太高；硼氢化钠或硼烷等还 原在产业化上危险性高，且三废难以处理。

中国现已申请的同类发明专利例如申请号200810124754.2、 201010213724.6、201110225388.1、201210069347.2等公开了数种酮还原酶制 备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法均采用昂贵的辅酶因子NAD 或NADP，并需要添加葡萄糖或异丙醇等作为氢供体，且必须添加有机溶剂形 成两相体系，并且需要分批补料加入底物，操作繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的 (S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种酶促制备(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的方法，其以4-氯乙酰乙酸乙酯为 底物，使该底物在酮还原酶的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基 丁酸乙酯，特别是，所述的酮还原酶为胞内酶，且为整细胞酶，且使反应在 pH6.5～7.5的水相缓冲液中以及温度35～38℃下进行，其中不使用辅酶因子、 不添加有机溶剂。

根据本发明，所述的水相缓冲液可以为磷酸钾缓冲液、乙酸钠缓冲液或 Tris-HCl缓冲液。

优选地，使反应在一价或二价金属离子存在下进行。进一步地，所述的 金属离子可以为Li⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺Zn²⁺、Mn²⁺中的一种或多种的 组合。金属离子可以其盐酸盐或硫酸盐的形式引入到反应的体系中。金属离子 与底物的摩尔比为0.01～0.03:1。

优选地，所述的酮还原酶为酶活在60U/ml～70U/ml之间的Cell  KRED-022酶液（可从例如尚科生物医药(上海)有限公司商购）。

根据本发明的一个具体和优选方面，所述的反应实施如下：向反应釜中 加入水相缓冲液，打开搅拌并开始加热，待反应釜中温度稳定在35～38℃后， 将底物一次性加入到反应釜中，再加入所述酮还原酶，进行反应，HPLC跟踪 反应进程，至底物转化完全后，反应停止，直接用乙酸乙酯分三次萃取，合并 乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤，分出乙酸乙酯，干燥浓缩即得(S)-3-羟基-4-氯丁 酸乙酯。

进一步地，在加入底物前，还向体系中加入一价或二价金属离子的盐酸 盐或硫酸盐。金属离子可以为Li⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺Zn²⁺或Mn²⁺。

根据本发明，底物在体系中的浓度可以发生变化，但是通常浓度为 1mM～2M，优选0.1M～1M。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明方法与已有的生物制备方法相比，无需使用昂贵的辅酶因子，也 无需使用有机溶剂，成本更低，操作更简单，且底物转化率高，产品收率高， 因而本发明方法更适于工业化生产。

具体实施方式

1、本发明所用的酮环酶及其活性测定

本发明所用酮还原酶为Cell KRED-022酶液，该酶液的酶活在 60～70U/ml之间，购自尚科生物医药(上海)有限公司。

酶活性的测定方法如下：根据下式将酶液在磷酸钾缓冲液下催化4-氯乙 酰乙酸乙酯还原成(S)-奥拉西坦关键中间体(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯：

如下进行标准的酶活分析试验：将总体积1ml基本反应混合物（200μl1M  K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液pH7.0，100μl0.01M CaCl₂，100μl0.50M4-氯乙酰 乙酸乙酯，600μl纯水）补加5μl酶液并在37℃反应。一单位酶活力定义为 每分钟生成1mM(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯所消耗的酶量。

检测方法用：1ml乙酸乙酯萃取反应混合物，将混合物用紫外分光光度计 检测，通过与标准物对比来确定生成物(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的浓度。本发 明所使用的整细胞酶均酶活达到60U/ml。

2、底物的专一性

用与上述1中描述相同的酶分析试验测定酶的底物专一性，在37℃下进 行反应。表1中比较了不同底物的相对活性（%），用4-氯乙酰乙酸乙酯得到 最好结果。

表1

底物名称 相对活性（%） 4-氯乙酰乙酸乙酯 100 苯乙酮 50 2,6-二氯苯乙酮 35 环己酮 20 3-戊酮 12

3、最适宜温度

通过使用与上面1描述相同的酶分析试验在37℃测量酶的活力，所述为： 使用4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物。如表2中所概述的，酶活力的最适宜温度 为35-38℃。

表2

温度（℃） 相对活力（%） 15 30 20 50 25 60 30 95 35 98

38 98 40 90 42 80 45 15

4、最适宜pH

通过使用与上面1描述相同的酶分析试验测量酶的活力与反应混合物的 pH值之间的相互关系，所述为：使用各种pH和缓冲液，并且使用4-氯乙酰 乙酸乙酯作为底物。酶反应的最适宜pH为6.5-7.5，如表3所示。

表3

5、金属离子的影响

过使用与上面1描述相同的酶分析试验研究金属离子对酶活力的影响，所述 为：使用4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物，并且将各种金属离子加入到反应体系中， 其中金属离子的终浓度为5mM。结果如表4所示。

表4

金属离子 相对酶活（%）

无 100 LiCl 102 NaCl 101 MgCl₂110 CaCl₂115 CuSO₄102 ZnCl₂110 CuCl₂108 MnCl₂115

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

向200L反应釜中注入配好的pH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制MgCl₂水溶液，称取19.0g（0.2mol） MgCl₂溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L MgCl₂水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称 量好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再准确量取10L 的酮还原酶酶液（60U/ml）加入反应体系中，记下反应开始时间。整个反应过 程中，密切关注反应体系温度、pH值，并且注意跟踪检测（HPLC）。至底物转 化完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，用饱 和食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得产品15.6Kg，纯度：98.8%， 收率：94.5%。产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3- 羟基-4-氯丁酸乙酯。

实施例2

向200L反应釜中注入配好的pH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制CaCl₂水溶液，称取22.3g（0.2mol） CaCl₂溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L CaCl₂水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称量 好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再准确量取10L的 酮还原酶酶液（65U/ml）加入反应体系中，记下反应开始时间。整个反应过程 中，密切关注反应体系温度、pH值，并且注意跟踪检测（HPLC）。至底物转化 完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，用饱和 食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得产品15.8Kg，纯度：98.9%， 收率：95.7%

产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3-羟基-4- 氯丁酸乙酯。

实施例3

向200L反应釜中注入配好的pH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制ZnCl₂水溶液，称取27.2g（0.2mol） ZnCl₂溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L ZnCl₂水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称量 好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再准确量取10L的 酮还原酶酶液（62U/ml）加入反应体系中，记下反应开始时间。整个反应过程 中，密切关注反应体系温度、pH值，并且注意跟踪检测（HPLC）。至底物转化 完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，用饱和 食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得产品15.5Kg，纯度：98.6%， 收率：93.9%

产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3-羟基-4- 氯丁酸乙酯。

实施例4

向200L反应釜中注入配好的pH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制MnCl₂水溶液，称取25.0g（0.2mol） MnCl₂溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L MnCl2水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称 量好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再向反应系中加 入2L甲苯，再准确量取10L的酮还原酶酶液（66U/ml）加入反应体系中，记下 反应开始时间。整个反应过程中，密切关注反应体系温度、PH值，并且注意跟 踪检测（HPLC）。至底物转化完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次 萃取，合并乙酸乙酯，用饱和食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得 产品15.8Kg，纯度：98.8%，收率：95.7%

产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3-羟基-4- 氯丁酸乙酯。

实施例5

向200L反应釜中注入配好的PH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制CuCl₂水溶液，称取26.8g（0.2mol） CuCl₂溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L CuCl₂水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称 量好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再准确量取10L 的酮还原酶酶液（60U/ml）加入反应体系中，记下反应开始时间。整个反应过 程中，密切关注反应体系温度、pH值，并且注意跟踪检测（HPLC）。至底物转 化完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，用饱 和食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得产品15.3Kg，纯度：98.5%， 收率：92.7%

产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3-羟基-4- 氯丁酸乙酯。

实施例6

向200L反应釜中注入配好的pH＝7.0的80L磷酸钾缓冲液，打开搅拌并且 开始加热，反应温度设定37℃。同时配制CuSO₄水溶液，称取32.0g（0.2mol） CuSO₄溶于去离子水中，配制成2L体积。待反应釜中温度稳定有37℃后，将 配好的2L CuSO₄水溶液一次性倒入反应釜内，继续搅拌10分钟后，然后把称 量好的4-氯乙酰乙酸乙酯（16.5Kg）一次性加入到反应釜中，再准确量取10L 的酮还原酶酶液（60U/ml）加入反应体系中，记下反应开始时间。整个反应过 程中，密切关注反应体系温度、pH值，并且注意跟踪检测（HPLC）。至底物转 化完全后，反应停止，直接用100L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，用饱 和食盐水洗3次，分出乙酸乙酯后干燥浓缩后即得产品15.2Kg，纯度：98.5%， 收率：92.1%

产物的鉴定：通过手性HPLC分析，与标准物比较鉴定产物为(S)-3-羟基-4- 氯丁酸乙酯。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够 了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本 发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。