醛酮还原酶TdAKR的克隆表达及催化合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

摘要

手性醇是合成大量重要手性药物的手型砌块。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是一种多功能的手性中间体，尤其可作为降血脂药物阿托伐他汀钙的关键中间体。由于生物催化不对称还原法生产(S)-CHBE具有反应条件温和、对映体选择性高、副产物少，对环境友好等优点，已越来越受到人们的重视。本论文从Torulaspora delbrueckii ZJB15080中得到一个醛酮还原酶基因，并对它做了一系列的研究。主要研究结果如下:
　　1.通过基因挖掘从T.delbrueckii ZJB15080中克隆了一株醛酮还原酶TdAKR，将其于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达，纯化后进行了酶学性质的研究。TdAKR分子量约为38.6kDa，最适温度与最适pH分别为30℃、7.0。在低于35℃和偏酸性环境中稳定性较好。TdAKR遵循强制顺序反应。对4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的最大反应速率(vmax)和对NADPH、COBE的表观米氏常数（Km）以及周转数(kcat）分别为47.51U·mg-1，0.07mM、1.19mM和30.56s-1。
　　2.对重组菌的产酶表达条件进行了优化。确定了最佳产酶表达条件为:接种量2％，加入培养基37℃培养2h后加入9g·L-1的乳糖，诱导温度和诱导时间分别为28℃和12h。此时比酶活达1932.6U·g-1，生物量为1.92g·L-1(DCW)。通过优化培养基组分，确定了加入10g·L-1的蔗糖和5g·L-1的NaNO3可使比酶活提高到2374.35U·g-1，生物量2.1g·L-1(DCW)。
　　3.研究了TdAKR与EsGDH双酶偶联体系不对称还原COBE生成(S)-CHBE的过程。在50g·L-1的底物浓度条件下，转化2h后产物得率为91.5％，e.e.值95.6％，时空产率549g·L-1·d-1。当底物浓度为75g·L-1时，反应3h后达到平衡，得率为90.3％，e.e.值95.7％，时空产率541.8g·L-1·d-1。在底物浓度进一步增大为100g·L-1时，反应在5.5h后趋于平衡，此时产物得率为87.2％，e.e.值95.6％，时空产率380.7g·L-1·d-1。而当底物浓度增大到125g·L-1时，产物得率明显降低仅为64.8％。实验结果显示，TdAKR具有良好的应用潜力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 手性化合物与手性醇概述

1．1．1 手性化合物概述

1．1．2 手性醇概述

1．2 醛酮还原酶不对称催化合成手性化合物

1．2．1 醛酮还原酶

1．2．2 醛酮还原酶的催化机制

1．2．3 醛酮还原酶在不对称合成中的应用

1．3 生物催化剂的筛选

1．3．1 宏基因组筛选

1．3．2 基因狩猎法

1．3．3 数据库挖掘法

1．4 醛酮还原酶的催化形式和辅酶再生

1．4．1 醛酮还原酶的催化形式

1．4．2 辅酶再生

1．5 生物法制备4-氯-3-羟基丁酸乙酯

1．5．1 外消旋体拆分法

1．5．2 不对称合成法

1．6 本文研究的思路和方法

第二章 醛酮还原酶TdAKR的克隆表达与酶学性质

2．2．1 主要实验试剂

2．2．2 菌种、质粒及培养基

2．2．3 实验仪器与设备

2．2．4 常用试剂配制

2．2．5 醛酮还原酶的挖掘

2．2．6 醛酮还原酶重组载体和工程菌的构建

2．2．7 重组醛酮还原酶的诱导表达

2．2．8 重组醛酮还原酶的SDS-PAGE分析

2．2．9 重组醛酮还原酶TdAKR的分离纯化及SDS-PAGE分析

2．2．10 重组醛酮还原酶TdAKR的分析

2．2．11 重组醛酮还原酶TdAKR的酶学性质研究

2．3 结果与讨论

2．3．3 醛酮还原酶的表达

2．3．4 TdAKR的多序列比对分析

2．3．5 TdAKR的纯化

2．3．6 pH对酶活的影响

2．3．7 温度对酶活的影响

2．3．8 金属离子和化学试剂对酶活的影响

2．3．9 TdAKR的底物特异性

2．3．11 动力学参数

2．4 本章小节

第三章 醛酮还原酶TdAKR的表达条件优化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要实验试剂

3．2．2 菌株与培养基

3．2．3 实验仪器设备

3．2．4 生物量的测定

3．2．5 粗酶液的制备

3．2．6 TdAKR比酶活的测定

3．2．7 重组菌株E．coli BL21(DE3)／pET-28a-tdakr的诱导条件的优化

3．2．8 重组菌株E．coli BL21(DE3)／pET-28a-tdakr的发酵培养基的优化

3．3 结果与讨论

3．3．1 接种量的影响

3．3．2 诱导剂加入时间的影响

3．3．3 诱导剂浓度的影响

3．3．4 诱导温度的影响

3．3．5 诱导时间的影响

3．3．6 C源及其浓度的影响

3．3．7 N源及其浓度的影响

3．3．8 磷酸盐浓度的影响

3．3．9 金属离子的影响

3．4 本章小结

第四章 重组E．coli BL21(DE3)／pET-28a-tdakr催化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要实验试剂

4．2．2 菌株与培养基

4．2．5 TdAKR与EsGDH双菌质量比对反应的影响

4．2．6 pH对反应的影响

4．2．7 温度对反应的影响

4．2．7 葡萄糖浓度对反应的影响

4．2．8 NADP+用量对反应的影响

4．2．9 不同底物浓度下的反应进程

4．2．10 数据计算方法

4．3 结果与讨论

4．3．2 pH对反应的影响

4．3．3 温度对反应的影响

4．3．4 葡萄糖浓度对反应的影响

4．3．5 NADP+用量对反应的影响

4．4．6 不同底物浓度下的反应进程

4．4 本章小节

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文