一种针对非活泼侧链的N-FMOC-氨基酸粗品结晶的新工艺

摘要

本发明公开一种针对非活泼侧链的N-FMOC-氨基酸粗品结晶的方法，包括以下步骤：1)将N-FMOC-氨基酸粗品溶解于乙醇/水体系中，配制成N-FMOC-氨基酸溶液，在60～80℃条件下，振荡使其完全溶解；2)将步骤1)所得溶液置于低温条件下使N-FMOC-氨基酸结晶，抽滤结晶母液，用步骤1)制备的乙醇/水体系充分洗涤结晶，并干燥得N-FMOC-氨基酸结晶纯品；3)将步骤2)中抽滤N-FMOC-氨基酸结晶后的剩余溶剂，置于蒸馏装置中，回收乙醇。

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对非活泼侧链的N-FMOC-氨基酸粗品结晶的 新工艺，还涉及由该方法纯化得到的N-FMOC-氨基酸结晶体。

背景技术

近年来，我国多肽及蛋白质类药物研究发展迅速，特别是许多具 有特殊生物活性的多肽呈现出更为广泛的应用价值，而目前多肽合成 的方法主要以固相合成法为主要方法。氨基和侧链活泼基团在接肽反 应中都需要保护起来，合成多肽后再脱去保护基团，否则会发生氨基 酸的错接和许多副反应。FMOC，即芴甲氧羰酰基为一种较常见的N- 端氨基酸保护基团，N-FMOC-氨基酸作为常见N保护氨基酸，是固相 合成法制备多肽的最基本原料。

N-FMOC-氨基酸制备过程大致可以分为两个阶段，即N-FMOC- 氨基酸合成与其产物的后期纯化。在后期纯化过程中，一般先在反应 结束后加水，用无水乙醚萃取水相中残余Fmoc-Cl；加酸调水相pH 值为2，析出目的N-FMOC-氨基酸，并用乙酸乙酯萃取；而后加入无 水硫酸镤吸附多余水份，用旋转蒸发去除乙酸乙酯，得到N-FMOC- 氨基酸粗品，最后有机溶剂重结晶或析出N-FMOC-氨基酸精品。E  Atherton等(1989)应用乙酸乙酯、石油醚、二甲基甲酰胺醚及二氯 甲烷-轻石油等重结晶得到N-FMOC-缬氨酸结晶、N-FMOC-异亮氨酸 (N-FMOC-L-Ileu-OH)、N-FMOC-蛋氨酸N-FMOC-L-Met-OH)、 FMOC-组氨酸(FMOC-L-His-OH)；杜秀敏(2004)在“Fmoc系列 保护氨基酸的制备研究”中，使用二氯甲烷/石油醚体系或乙酸乙酯/石 油醚体系的析出或结晶法析出N-FMOC-甘氨基酸 (N-FMOC-Gly-OH)、N-FMOC-L-亮氨酸(N-FMOC-Leu-OH)或 FMOC-L-异亮氨酸(N-FMOC-L-Ileu-OH)；洪镛裕等(2006)应用 异丙醇重结晶对Cbz2Arg(Pbf)2OH·CHA精制；赵萍萍等(2008)应 用石油醚结晶法对Fmoc His(Trt)OH进行精制。

由于N-FMOC-氨基酸粗品到精品结晶或析出方法主要应用石油 醚或其它有机溶剂，但从上述现有研究中不难看出，这些有机溶剂虽 然结晶效果较好，但都具有较大的毒性。我国目前FMOC-氨基酸产量 已近8000吨，需要石油醚等有机溶剂近320万吨，虽然石油醚在结 晶FMOC-氨基酸后可重复回收，但为了保证FMOC-氨基酸结晶的纯 度，通常情况下仅反复回收1-2次，如此以来，在FMOC-氨基酸制备 过程中产生了大量的有机废液。因此，研究绿色、环保、经济的新型 溶剂与方法，是目前亟待需要重点解决的问题。

因此，在确保N保护氨基酸提纯纯度前提下，提供一种更为绿色、 环保、更具经济性的N-FMOC-氨基酸粗品结晶的新工艺已经成为了该 领域目前研究的重点。

发明内容

基于上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种采用乙醇/水体 系替代传统的以石油醚为主的有毒溶剂体系进行N-FMOC-氨基酸粗 品结晶的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将N-FMOC-氨基酸粗品溶解于已制备成的乙醇/水体系(乙醇∶ 水＝1～4∶1～5)中，配制成浓度为22～55(g/l)的N-FMOC-氨基 酸溶液，在60～80℃条件下，振荡使其溶解；

2)而后置于低温条件下使N-FMOC-氨基酸结晶，抽滤结晶母液， 用步骤1制备成的乙醇/水体系充分洗涤结晶，并干燥得N-FMOC-氨 基酸结晶纯品；

3)将步骤2)中抽滤N-FMOC-氨基酸结晶后的剩余溶剂，置于蒸 馏装置中，蒸馏回收乙醇。

本发明的又一个目的是提供一种通过上述乙醇/水体系进行 N-FMOC-氨基酸粗品结晶的方法获得的N-FMOC-氨基酸结晶。

本发明中采用乙醇/水体系替代传统的以石油醚为主的有毒溶剂 体系进行N-FMOC-氨基酸粗品结晶，并在抽滤N-FMOC-氨基酸结晶 后，应用蒸馏法回收滤液中的乙醇溶剂，乙醇回收次数可达数十次， 就N-FMOC-氨基酸粗品结晶操作而言，可以达到“零排放”的标准，是 一种绿色、环保、经济的工艺。

本发明制备的N-FMOC-氨基酸结晶，其纯度比较市售N-FMOC- 氨基酸产品，高效液相254nm波长下纯度≥99％，晶形更齐整。

附图说明

图1.N-FMCO-L-丙氨酸-不规则大片状晶体结晶形态示意

图2.N-FMCO-L-丙氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图3.N-FMCO-L-亮氨酸-长方形巨大晶体结晶形态示意图

图4.N-FMCO-L-亮氨酸--高效液相254nm波长下谱图

图5.N-FMCO-L-异亮氨酸-长细针状大晶体结晶形态示意图

图6.N-FMCO-L-异亮氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图7.N-FMCO-L-蛋氨酸-长粗棒状大晶体结晶形态示意图

图8.N-FMCO-L-蛋氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图9.N-FMCO-L-甘氨酸-长细棒状晶体结晶形态示意图

图10.N-FMCO-L-甘氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图11.N-FMCO-L-苯丙氨酸-长棒状大晶体结晶形态示意图

图12.N-FMCO-L-苯丙氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图13.N-FMCO-L-缬氨酸-长细棒状大晶体结晶形态示意图

图14.N-FMCO-L-缬氨酸-高效液相254nm波长下谱图

图15.N-FMCO-L-脯氨酸-长方形薄大块晶体结晶形态示意图

图16.N-FMCO-L-脯氨酸-高效液相254nm波长下谱图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1FMCO-L-丙氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-丙氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝3∶2体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-L-丙氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L- 丙氨基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝3∶2) 溶液中，配制成浓度为50.1(g/l)的N-FMOC-L-丙氨基酸，并充分 振摇，而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-丙氨基酸 完全呈溶解状态。

(4)N-FMOC-L-丙氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的 N-FMOC-L-丙氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-丙氨基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 丙氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝3∶2)溶液反复冲洗3次 以上，称取N-FMOC-L-丙氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称 量干燥后FMOC-L-丙氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.67)， 计算收率(90.3％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-丙氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例2FMCO-L-亮氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-亮氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝2∶3体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-L-亮氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L-亮 氨基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶 液中，配制成浓度为27.3(g/l)的N-FMOC-L-亮氨基酸，并充分振摇， 而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-亮氨基酸完全呈 溶解状态，。

(4)N-FMOC-L-亮氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的 N-FMOC-L-亮氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-亮氨基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 亮氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液反复冲洗3次 以上，称取N-FMOC-L-亮氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称 量干燥后FMOC-L-亮氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.73)， 计算收率(93.9％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-亮氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例3FMCO-L-异亮氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-异亮氨基酸结 晶要求，配制乙醇/水＝1∶1体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-L-异亮氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L- 异亮氨基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝1∶1) 溶液中，配制成浓度为53.8(g/l)的N-FMOC-L-异亮氨基酸，并充分 振摇，而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-异亮氨基 酸完全呈溶解状态，。

(4)N-FMOC-L-异亮氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的 N-FMOC-L-异亮氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-异亮氨基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 异亮氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝1∶1)溶液反复冲洗3 次以上，称取N-FMOC-L-异亮氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥， 称量干燥后FMOC-L-异亮氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥ 99.19)，计算收率(86.4％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-异亮氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例4FMCO-L-蛋氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-蛋氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝2∶3体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-L-蛋氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L-蛋 氨基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶 液中，配制成浓度为25.0(g/l)的N-FMOC-L-蛋氨基酸，并充分振摇， 而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-蛋氨基酸完全呈 溶解状态。

(4)N-FMOC-L-蛋氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的 N-FMOC-L-蛋氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-蛋氨基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 蛋氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液反复冲洗3次 以上，称取N-FMOC-L-蛋氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称 量干燥后FMOC-L-蛋氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.67)， 计算收率(86.8％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-蛋氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例5FMCO-L-甘氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-甘氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝4∶5体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-甘氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-甘氨基 酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝4∶5)溶液中， 配制成浓度为22.2(g/l)的N-FMOC-甘氨基酸，并充分振摇，而后， 置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-甘氨基酸完全呈溶解状 态。

(4)N-FMOC-甘氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的N-FMOC- 甘氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-甘氨基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-甘氨 基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝4∶5)溶液反复冲洗3次以上， 称取N-FMOC-甘氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称量干燥后 FMOC-L-甘蛋氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.59)，计算收 率(90.7％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-甘氨基酸结晶后剩余溶剂，置 于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例6FMCO-L-苯丙氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-苯丙氨基酸结 晶要求，配制乙醇/水＝2∶1体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-苯丙氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L- 苯丙氨基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶1) 溶液中，配制成浓度为42.7(g/l)的N-FMOC-L-苯丙氨基酸，并充 分振摇，而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-苯丙氨 基酸完全呈溶解状态，。

(4)N-FMOC-L-苯丙氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的 N-FMOC-L-苯丙氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-苯丙基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 苯丙氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶1)溶液反复冲洗3 次以上，称取N-FMOC-L-苯丙氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥， 称量干燥后FMOC-L-苯丙氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥ 99.15)，计算收率(87.8％)。

(6)乙醇回收：捋抽滤N-FMOC-L-苯丙氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例7FMCO-L-缬氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-缬氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝2∶3体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-L-缬氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-缬氨 基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液 中，配制成浓度为26.4(g/l)的N-FMOC-L-缬氨基酸，并充分振摇， 而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-缬氨基酸完全呈 溶解状态。

(4)N-FMOC-缬氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的N-FMOC- L-缬氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-缬基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L-缬氨 基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液反复冲洗3次以上， 称取N-FMOC-L-缬氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称量干燥 后FMOC-L-缬氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.97)，计算收 率(89.9％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-缬氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

实施例8FMCO-L-脯氨酸纯化方法

(1)乙醇/水体系溶液准备：依据目的N-FMOC-L-脯氨基酸结晶 要求，配制乙醇/水＝2∶3体系溶液。

(2)保温装置准备：在水浴箱中，加入适量的水，接通电源后， 设定水浴箱温度，并加热到设定80℃。

(3)N-FMOC-缬氨基酸粗品溶解：取精确称取N-FMOC-L-脯氨 基酸粗品，并置于装有已准备好的乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液 中，配制成浓度为26.8(g/l)的N-FMOC-L-脯氨基酸，并充分振摇， 而后，置于达到设定温度的水浴中，直至N-FMOC-L-脯氨基酸完全呈 溶解状态。

(4)N-FMOC-脯氨基酸结晶：将已充分呈溶解状态的N-FMOC- L-脯氨基酸置于室温下，过夜，使其结晶。

(5)N-FMOC-L-缬基酸结晶处理：用抽滤器过滤N-FMOC-L- 脯氨基酸结晶，并用乙醇/水体系(乙醇/水＝2∶3)溶液反复冲洗3次 以上，称取N-FMOC-L-脯氨基酸结晶，后置于干燥器中自然干燥，称 量干燥后N-FMOC-L-脯氨基酸结晶(高效液相254nm下纯度≥99.27)， 计算收率(87.9％)。

(6)乙醇回收：将抽滤N-FMOC-L-脯氨基酸结晶后剩余溶剂， 置于蒸馏装置中，设定蒸馏参数，回收乙醇。

以上内容是结合具体的优选方案方式对本发明所作的详细说明，但 不能认定本发明只局限于这些。对于本发明所属技术领域的技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。如权利要求4中所述的乙醇/水体系 的比例为乙醇∶水＝1～5∶1～7；权利要求5中所述的配制成的N-FMOC- 氨基酸溶液浓度为10～70(g/l)；权利要求6所述的水浴加热的温度为 50～90℃。