四氢-β-咔啉-3-甲酰-二乙烯三胺-β-环糊精络铜,其制备,抗血栓作用和应用

摘要

本发明公开了将四氢β-咔啉羧酸通过二乙烯三胺为连接臂连接到环糊精上形成的6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精与铜形成的配合物及其制备方法。本发明进一步公开了该铜配合物的良好的体内抗血栓活性和体外血管舒张作用。本发明为发展生物利用度高、抗血栓活性强的药物提供了优秀候选化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工合成的四氢-β-咔啉-3-甲酰-二乙烯三胺-β-环糊精络铜，特别 是涉及这种对β-环糊精进行修饰和络合的策略，本发明还涉及该配合物的制备方法 以及在制备作为抗血栓剂药物中的应用。

背景技术

近年来，我国人口老龄化程度日益加剧，血栓性疾病发生率不断上升。尽管抗血 栓药物包括抗血小板类药物、抗凝血药物和溶血栓药三大类药物在开发应用和临床 治疗方面都取得了很大进展，但是发展更安全有效、高生物利用度的自主品牌的新 型抗血栓候选药物仍是当前新药研发的热点之一。β-咔啉类生物碱，是吲哚类生物碱 中非常重要的一类。这类生物碱种类繁多，表现出广泛的生物活性，如抗肿瘤活性、抗 血小板聚集、杀虫活性、抑菌活性、抗氧化活性、抗病毒活性、抗抑郁活性等等。 其中的3S-1，2，3，4-四氢咔啉羧酸体外抗血小板聚集能力是阿司匹林的6倍。然而咔啉 羧酸极低的水溶性限制了其作为抗血栓剂的应用。

环糊精是D-型吡喃葡萄糖以1，4-苷键首尾相连的环状分子，具有疏水的内腔和 亲水的外壁。其亲水外壁的羟基可以被选择性修饰。通过共价键的方法将药物分子 偶联到环糊精的边臂上，可以延缓药物在体内的释放。天然环糊精的主面和侧面羟 基可以被各种基团选择修饰生成功能性环糊精衍生物。本发明采取化学合成的方法 将咔啉羧酸通过柔性链二乙烯三胺共价键偶联到环糊精主面边臂上形成单取代环糊 精，该化合物不仅显著地提高了咔啉羧酸的水溶性，而且柔性链上提供的三个NH 基团与咔啉羧酸上的脂肪环上的NH基团可以共同与铜离子配位形成铜配合物。近 年来的研究表明，铜配合物在治疗心血管疾病上有着潜在的应用价值。环糊精修饰 的咔啉羧酸铜配合物的形成由于可以舒张血管，因此可以进一步提高化合物体内抗 血栓的能力。

发明内容

本发明的第一个内容是，提供一种名为6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯 三胺]-6-脱氧-β-环糊精的化合物与铜形成的配合物，其结构式如下：

本发明的第二个内容是，提供6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6- 脱氧-β-环糊精与铜形成的配合物(8)的制备方法，该方法包括：

1)在蒸馏水与硫酸存在下，L-色氨酸与甲醛在室温下反应成为四氢-β-咔啉羧酸；

2)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)与三乙胺存在下，步骤1所得产物与二碳酸二叔 丁酯(DIBOC)在室温下反应，成为N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

3)在二氯甲烷存在下，对甲苯磺酰氯与对甲苯磺酸在室温下脱水形成对甲苯磺 酸酐(Ts₂O)；

4)在蒸馏水中，用Ts₂O将β-环糊精的单个6-OH对甲苯磺酰化成为6-O-(p-甲 苯磺酰基)-β-环糊精；

5)在二乙烯三胺中，6-O-(p-甲苯磺酰基)-β-环糊精反应生成6-二乙烯三胺-6-脱氧 -β-环糊精；

6)将无水DMF存在下，N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与6-二乙烯三胺-6- 脱氧-β-环糊精缩合成为6-[(N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧 -β-环糊精；

7)在三氟醋酸(TFA)中6-[(N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6- 脱氧-β-环糊精脱除Boc得到6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β- 环糊精；

8)在冰浴下，向稍微过量的氯化铜水溶液中分批加入6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉 -3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精。然后，向溶液中滴加几滴氯仿，所得溶 液在5℃条件下放置二天。收集沉淀。得到6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙 烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精的铜配合物(8)。

该制备方法可以用图1的合成路线概括。

本发明的第三个内容是，提供铜配合物8的血管舒张活性和在制备血管舒张剂 中的应用。

本发明的第四个内容是，提供铜配合物8的抗血栓活性和在制备抗血栓剂中的 应用。

本发明选用咔啉羧酸修饰的β-环糊精做为抗血栓剂，通过亲水性环糊精的引入 显著提高的化合物7的水溶性。进一步通过铜离子与二乙烯三胺柔性链上的氮以及 与咔啉羧酸脂肪环上的氮原子的配位，得到的铜离子配合物可以舒张血管环，从而 进一步提高体内抗血栓能力。

附图说明

图1为本发明6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精的 铜配合物(8)的合成路线。

i.甲醛、硫酸、水(室温)；ii.(Boc)₂O、三乙胺、DMF(室温)；iii.二氯甲烷、 对甲苯磺酰氯(室温)；iv.水(室温)；v.二乙烯三胺(80℃，氮气保护)；vi.N-羟 基苯并三氮唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)，冰浴；vii.TFA(室温)；viii. CuCl₂·2H₂O(室温)。

具体实施方式

以下结合附图、实施例和试验数据，对本发明上述的和另外的技术特征和优点 作更详细的说明。

实施例1制备1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

滴加0.1mL浓硫酸到200.0mL水中，加入5.000g色氨酸(24.5mmol)，待色 氨酸完全溶解后，滴加甲醛5.0mL。反应6h后终止反应，浓氨水调体系pH值至 6，产生大量白色沉淀。反应混合物在4℃冰箱中冷冻数小时，过滤得到标题化合 物3.985g，产率75％。ESI/MS(m/e)：217[M+H]⁺.

实施例2制备N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(5.000g，23.1mmol)悬浮在50.0mL DMF中，冰浴下加 入Boc₂O(6.545g，30.1mmol)，滴加三乙胺调反应体系pH到10。反应完全后，吹干 DMF，乙酸乙酯溶解产品混合物，5％硫酸氢钾洗三次，饱和NaCl溶液洗两次至酯 层pH中性，无水Na₂SO₄干燥酯层。滤去干燥剂后，旋干乙酸乙酯，用少量氯仿将 淡黄色固体洗到无色，得到干净的标题化合物4.308g，产率59％。ESI/MS(m/e)： 317[M+H]⁺.

实施例3制备4-甲苯磺酸酐(3)

TsCl(8.000g，42.0mmol)和TsOH·H₂O(2.000g，11mmol)溶解在50.0mL二氯甲 烷中，室温下搅拌过夜。反应液过滤后重结晶后得到标题化合物4.970g，产率62％。 ESI/MS(m/e)：327[M+H]⁺.

实施例4制备6-O-(p-甲苯磺酰基)-β-环糊精(4)

β-环糊精(10.000g，88.1mmol)溶解在220.0mL水中，加入Ts₂O(4.261g，13.1 mmol)反应2h。向反应液中滴加10％NaOH水溶液，搅拌20min后过滤。调滤液 pH值到中性，析出大量无色固体，过滤得到无色固体2.969g，产率26％。ESI/MS (m/e)：1290[M+H]⁺.

实施例5制备6-二乙烯三胺-6-脱氧-β-环糊精(5)

CD-OTs(1.000g)与3mL二乙烯三胺在90℃条件下搅拌加热。反应8h后，旋 干溶剂，产率95％。ESI/MS(m/e)：1243[M+Na]⁺.

实施例6制备6-[(2-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β- 环糊精(6)

将0.379g的N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸溶解在10mL无水DMF中，冰 水浴搅拌至全部溶解，加入HoBt(0.243g，2.8mmol)，冰浴下加入DCC(0.371g，1.8 mmol)。30min后，将0.610g的6-二乙烯三胺-6-脱氧-β-环糊精投入反应中。12h后， 停反应，反应液减压抽滤，得到无色微黄粉末0.769g粗产品。经柱层析分离得到纯 的标题化合物0.048g，产率6.36％。ESI/MS(m/e)：1519[M+H]⁺.¹HNMR(D₂O， 500MHZ，TMS，ppm)：δ＝1.46(s，9H)，δ＝2.65-3.05(m，2H)，δ＝3.10-4.45(br，67H)， δ＝4.6-5.25(m，7H)，δ＝7.15(t，1H，J＝7.5Hz)，δ＝7.2(t，1H，J＝7.5Hz)，δ＝7.45(d，1H， J＝7.5Hz)，δ＝7.45(d，1H，J＝7.5Hz).

实施例7制备6-[(1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精 (7)

将6-[(2-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3)-甲酰基-二乙烯三胺]-6-脱氧-β-环糊精 (0.200g，0.13mmol)溶于3mL三氟乙酸(TFA)，室温搅拌6-8h。停反应后，旋除 大量TFA，冰水浴下滴加浓氨水5mL，然后去除溶剂，得到淡黄色固体0.182g。 产品经葡聚糖凝胶G-25纯化后，得到淡黄色纯品0.106g，产率57％。Mp：270-271℃. ESI/MS(m/e)：1419[M+H]⁺.¹HNMR(D₂O，500MHZ，TMS，ppm)：δ＝2.45(s，3H)， δ＝2.90-4.15(br，60H)，δ＝4.9(m，3H)，δ＝7.10(t，1H，J＝7.5Hz)，δ＝7.35(t，1H，J＝7.5Hz)， δ＝7.85(d，1H，J＝7.5Hz)，δ＝8.00(d，1H，J＝7.5Hz).

试验例1化合物7及配合物8的体外抗血管条舒张活性评价实验

将去交肾上腺素(NE)配置成0.1μmol/L的生理盐水溶液，乙酰胆碱配置成1mM 的生理盐水溶液。

大鼠胸主动脉环的制备：250g-300g雄性SD大鼠断颈处死，剪开胸骨，暴露 出心脏。用镊子轻轻夹起心脏，沿胸椎取下胸主动脉。立即在缓冲液中将胸主动脉 与其他组织分离，并保持血管内皮完整。在缓冲液中把胸主动脉剪成2mm宽的数 段血管环待用。

调试准备：打开MD3000操作软件，换能器调零、定标。打开氧气瓶 (95％O₂+5％CO₂)，调节控制阀让气泡均匀流出。将血管环挂在张力换能器上，并将 之放入缓冲液水浴中。水浴孵育1h。

测试：往水浴槽中加入去甲肾上腺素25μL，待胸主动脉环收缩达到稳定后， 完成测量，用缓冲液快速冲洗水浴槽2次，慢泡洗水浴槽1次，准备下次测试。

统计：用给样品药后收缩的格数除以给NE后舒张的为计算值。取5次的平均值。 根据公式“舒张百分率＝(L_Drug-L_Blank)/L_NE×100％”计算舒张百分率。

表1为化合物7和配合物8的血管条舒张活性评价数据。

表1化合物对大鼠胸主动脉环的舒张作用

n＝5；去甲肾上腺素(1μM)；乙酰胆碱＝81.24±3.40(100μM)。

试验例2大鼠血栓模型上化合物7和8的口服抗血栓活性

将化合物7配成10μmol/mL生理盐水溶液，用于体内的剂量为1μmol/kg。将配合物 8配成1μmol/mL生理盐水溶液，用于体内的剂量为100nmol/kg。母核1配成50μmol/L生 理盐水溶液，用于体内的剂量为5μmol/kg。阳性药阿司匹林配成10g/L生理盐水溶液， 即55.5mmol/mL的溶液，用于体内的剂量为180μmol/kg。空白对照为生理盐水，抗凝剂 为肝素钠2.4mg/mL生理盐水溶液。

实验中用于形成旁路循环的聚乙烯套事先装入6cm长经精密称重的丝线。聚乙烯管 (除丝线)经1％硅油乙醚溶液硅烷化，避免手术中出现溶血现象造成动物的损伤。

将实验动物SD雄性大鼠随机分组，n＝12，大鼠灌胃给药的体积为3mL/kg，灌胃30min 后用乌拉坦(20g/100mL，7mL/kg)麻醉，分离右颈总动脉和左颈总静脉。结扎颈总静脉远 心端，剪一小口，将一根充满肝素钠生理盐水溶液的聚乙烯管插入颈总静脉并固定，按1 mL/kg的剂量推注肝素钠生理盐水溶液。结扎颈总动脉远心端，用动脉夹夹住颈总动脉近 心端，剪一小口，将聚乙烯管另一端插入颈总动脉并固定。松开动脉夹，血流从右侧颈总 动脉经聚乙烯管流入左侧颈总静脉，形成旁路循环。15min后取出丝线，记录血栓湿重。 数据见表2，表3，用ANOVA检验对数据作统计分析，p＜0.05即认为有显著差异。

表2化合物对血栓重量的影响

注：n＝12，血栓湿重表示为均值a)与生理盐水组比p＜0.01；b)与生 理盐水组比p＜0.01，与阿司匹林组比p＜0.05；c)与生理盐水组及阿司匹林组比p＜ 0.01。

表3不同口服剂量化合物对血栓湿重的影响

n＝12，a)与生理盐水，100nmol/kg 7及10nmol/kg 7组比p＜0.01；b)与生 理盐水及10nmol/kg 7组比p＜0.01；c)与生理盐水组比p＜0.01；d)与生理盐水， 100nmol/kg 8及10nmol/kg 8组比p＜0.01；e)与生理盐水及10nmol/kg 8组比p＜ 0.01；f)与生理盐水组比p＜0.01。

结果表明，铜配合8对血管舒张作用比化合物7提高了80倍。化合物7在1 μmol/kg剂量下显示出比5μm/kg的母核优秀的抗血栓活性，其活性与180μmol/kg 的阿司匹林相当。铜配合物8在比化合物7低10倍的剂量下，表现出与化合物7相 当的体内抗血栓活力。此外，化合物7在1μmol/kg、100nmol/kg、10nmol/kg剂量 下，配合物100nmol/kg、10nmol/kg、1nmol/kg剂量下均显示出逐步降低的抗血栓 活性。可见，化合物7和配合物8的抗血栓作用呈现剂量依赖关系。

体内抗血栓活性实验表明将咔啉羧酸通过共价键的方式连接到环糊精的边臂 上，不仅提高了咔啉羧酸的水溶性，改善生物利用度提高了咔林羧酸的体内抗血栓 活性。同时，在与铜离子配位后由于显著地提高了对血管的舒张作用，使得体内抗 血栓活性继续提高了10倍。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的 范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明 的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。