小双节RNA病毒检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明适用于生物技术领域，提供了一种小双节RNA病毒检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括含有特异性引物和探针的PCR反应液，该检测方法使用上述试剂盒进行检测。本发明小双节RNA病毒检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小双节RNA病毒检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

小双节RNA病毒是1988年由Pereira等在腹泻病人粪便样品中发现的，该病毒与病毒分类学中双节RNA病毒科的成员不同：病毒颗粒小,直径约为35nm；基因组两个dsRNA片段小，分别为1.5kb和2.5kb左右；仅感染哺乳动物。1993年Grohmann等在感染HIV的腹泻病人粪便中亦发现此种病毒感染。此外，1997年在我国河北省暴发的急性胃肠炎病人粪便中发现小双节RNA病毒，病人主要临床症状为恶心，呕吐，腹痛，腹泻，病程为2～5天，部分病人伴有发烧，发病年龄为18～46岁。

有关该病毒分子生物学性质的研究报道极少。目前，小双节RNA病毒常用的检测方法是电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法结合的方法：先用电镜检查病毒颗粒，再用聚丙烯酞胺凝胶电泳法检测病毒的核酸，具体操作如下：

1电镜法

取粪便样本3g，加入浓度为0.1M的PBS制成20%悬液，3000rpm离心20min，吸上清液5mL，滴在蜡盘上，200目载膜铜网覆盖在悬液上吸附5min，用滤纸稍吸干液体，在pH=6.8的2%（w/w）磷钨酸钠负染液染色5min，滤纸吸干液体，自然干燥后，应用JEOL-1200EX透射电镜，3万倍下辅以双目镜(l0x)观察，每个样品观察5-10个网孔。电镜观察病毒颗粒大小应一致，无包膜，表面结构不清晰，直径约为25nm。

2聚丙烯酞胺凝胶电泳

样本经浓度为0.1M的PBS制成20%悬液，3000rpm离心20min，吸取0.25m1粪便上清液加入0.25mL11%(v/v)SDS-0.1M醋酸钠缓冲液，振荡1min，再加入0.5m1酚-氯仿混合液，振荡1min,10000rpm离心5min，留取上层水相为RNA提取物。垂直板式不连续电泳，浓缩胶3%(pH=6.8)，分离胶10%(pH=6.8)，甘氨酸/Tris缓冲液20-40mA室温电泳5-7h，硝酸银染色，NaOH-甲醛显色，电泳结果有明显的核酸带，分子量大小约为2.5MD。

但是，采用该方法检测小双节RNA病毒具有周期长、操作烦琐、易污染、程序复杂等缺点，已远远不能满足快速检测小双节RNA病毒的要求。

发明内容

本发明实施例的一个目的在于提供一种小双节RNA病毒检测试剂盒，旨在解决现有技术操作繁琐的问题。

本发明实施例的另一个目的在于提供一种小双节RNA病毒进行RT-PCR一步检测的方法，旨在解决现有技术中灵敏度低、特异性差、周期长的问题。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种小双节RNA病毒检测试剂盒，包括RT-PCR反应液，其特征在于：所述RT-PCR反应液包括第一反应液和与所述第一反应液分离的第二反应液，其中，所述第二反应液包括针对小双节RNA病毒的上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述上游引物为：5’-AGATGTTTGATACAAAAGGACCAC-3’；所述下游引物为：5’-ATCCAACGTGCCAGAGTGTAGC-3’。

以及，一种小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法，该方法使用上述小双节RNA病毒检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

1）样本RNA提取；

2）RT-PCR一步检测；

3）结果判断，

其中，所述步骤2）PCR反应参数设置为：

第一阶段预变性42-50℃/10-15min，92-95℃/2-3min；

第二阶段92-95℃/5-10S，55-60℃/40-80S；

共35～40个循环。

本发明实施例提供了一种小双节RNA病毒检测试剂盒及其检测方法，具有以下优点：

1.本发明实施例首次建立了小双节RNA病毒的RT-PCR一步法检测试剂盒及其检测方法，用该方法可以对离体的哺乳动物粪便或其他需要进行小双节RNA病毒检测的离体样本进行小双节RNA病毒的检测。

2.本发明实施例采用特异性的荧光探针和高灵敏度的PCR仪进行检测，灵敏度高、操作简单且周期短、易于推广。

3.本发明实施例采用了根据小双节RNA病毒核苷酸序列特异性设计的引物和TaqMan探针，使得本方法具有比普通RT-PCR检测方法更高的特异性。

4.本发明实施例中采用全封闭的RT-PCR一步法检测试剂盒，与两步法检测试剂盒相比，操作简单，且避免了开盖时引入污染物的风险。

下面将结合实施例对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1是本发明实施例使用Ct值的示意性图；

图2是本发明实施例提供的小双节RNA病毒检测流程图；

图3是本发明实施例2提供的阴性结果示意图；

图4是本发明实施例2提供的阳性结果示意图；

图5是本发明对比实例提供的小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法中4例阳性的PCR扩增图谱。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。

实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。TaqMan探针的原理是：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan实时荧光定量PCR每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。如果以每个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条曲线，扩增曲线。一般地，将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数为Ct值，见附图1。当样本中含有所要检测样本的核酸序列时，所得到的曲线呈S型；当样本中不含所要检测样本的核酸序列时，则PCR过程不发生，TaqMan探针不被水解，不产生荧光信号，所得到的曲线呈水平线。

TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单、周期短等特点，可用于检测微量的RNA病毒。本发明实施例首次对小双节RNA病毒采用RT-PCR一步法进行检测并提供了检测试剂盒。

基于该理论，本发明实施例提供了一种小双节RNA病毒检测试剂盒，包括RT-PCR反应液、Trizol试剂、氯仿/异戊醇、异丙醇、DEPC-H₂O。

具体地，上述RT-PCR反应液包括第一反应液和第二反应液。

其中，该第一反应液包括DNA聚合酶、逆转录酶、显色剂和灭菌超纯水。在优选实施例中，第一反应液中该各组分含量为：

DNA聚合酶  0.15-0.3μL/管；

逆转录酶   0.1-0.3μL/管；

显色剂     0.01-0.02μL/管；

灭菌超纯水 补足至2μL。

所述DNA聚合酶优选为Taq酶，其浓度优选为5U/μL，体积优选为0.2μL/管；逆转录酶优选为M-MLV逆转录酶，体积优选为0.2μL/管；所述显色剂优选为溴酚蓝，体积优选为0.015μL/管。应当理解，应不同实验需要，各组分的规格可依照上述含量进行调整。

上述第二反应液包括针对小双节RNA病毒的上游引物、下游引物和TaqMan探针。其中，上游引物、所述下游引物和所述TaqMan探针是以小双节RNA病毒基因核酸为检测对象特异性设计，所述上游引物的核苷酸序列为：5’-AGATGTTTGATACAAAAGGACCAC-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-ATCCAACGTGCCAGAGTGTAGC-3’；所述TaqMan探针的核苷酸序列为：5’-(FAM-GGTCTGTACAGACTTCTCCAAGTTCG-DABCYL)-3’，其中FAM为报告荧光基团，DABCYL为淬灭荧光基团。

该第二反应液还包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs和灭菌超纯水，因此，作为优选实施例，第二反应液的该各组分含量为：

上游引物    0.1-0.2μL/管；

下游引物    0.1-0.2μL/管；

TaqMan探针  0.1-0.2μL/管；

缓冲液      2-4μL/管；

MgCl₂       2-4μL/管；

dNTPs       2-4μL/管；

灭菌超纯水  补足至18μL。

其中，所述上游引物浓度优选为50uM，体积优选为0.15μL/管；所述下游引物浓度优选为50uM，体积优选为0.15μL/管；所述Taqman探针浓度优选为50uM，体积优选为0.15μL/管；所述缓冲液优选为不含镁离子的Buffer，体积优选为3.0μL/管；所述MgCl₂的浓度优选为25mM，体积优选为3.0μL/管；所述dNTPs的体积优选为3μL/管，浓度优选为2.5mM，体积优选为3.0μL/管。应当理解，应不同实验需要，组分的规格可依照上述含量进行调整。

在优选实施例中，上述第一反应液和所述第二反应液通过所述稳定液隔开。上述稳定液优选为石蜡，更优选为固体石蜡（熔点高于50℃）与液体石蜡的比值为1:4～12（w/v）的石蜡，其体积优选为20～25μL/管，更优选为20μL/管。通过该优选石蜡稳定液将上述第一反应液和第二反应液分隔开，从而使得第二反应液中的DNA聚合酶尤其是Taq酶与第一反应液分离，有效保证了DNA聚合酶的活性，延长了本发明试剂盒的保存时间。在PCR反应过程中，由于温度在95℃，石蜡熔融，使得第一反应液和第二反应液混合，PCR反应得以进行。

上述Trizol试剂优选用30mL平口瓶包装；氯仿/异戊醇浓度优选为24:1(v/v)，优选8mL平口瓶包装；异丙醇优选20mL平口瓶包装；DEPC-H₂O优选1.5mL普通冻存管包装；RT-PCR反应液选用0.2mL的8联PCR反应管包装。

在进一步优选实施例中，上述小双节RNA病毒检测试剂盒还包括阴性对照液和阳性对照液。其中，阴性对照液为不含有小双节RNA病毒RNA的其他RNA病毒基因组的Tris-EDTA缓冲液，浓度为0.01-0.015M，优选为0.012M，pH优选为7.8-8.2，更优选为8.0，可以用0.6mL普通带盖离心管包装；阳性对照液为使用浓度为0.01-0.015M、优选为0.012M，pH优选为7.8-8.2、更优选为8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存的小双节RNA病毒基因组RNA，可以用0.6mL普通带盖离心管包装。

因此，在具体实施例中，上述小双节RNA病毒检测试剂盒中各组分配备规格为：

Trizol试剂     13mL/瓶；

氯仿/异戊醇    3mL/瓶；

异丙醇         9mL/瓶；

DEPC-H₂O       1.5mL/瓶；

RT-PCR反应液   20μL/管；

阴性对照液     40μL/管；

阳性对照液     40μL/管。

应当理解，应不同实验需要，组分的规格可依照上述含量进行调整。

上述平口瓶、冻存管、反应管、离心管采用不同颜色的盖子加以区分，避免操作时取错组分或实验过程中由于混淆瓶盖造成的标品交叉污染。其中优选为，Trizol试剂配棕色盖；氯仿/异戊醇配绿色盖；异丙醇配黄色盖；DEPC-H₂O配黄色盖；RT-PCR反应液使用无色透明反应管；阴性对照使用紫色透明带盖离心管；阳性对照使用橙红色透明带盖离心管。

小双节RNA病毒实时荧光定量PCR是通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的荧光扩增曲线图，当扩增曲线图Ct值≤35，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值，结果表现为阴性。因此，为了形成对照，用于检测小双节RNA病毒的RT-PCR试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。

本发明实施例中，用于所述小双节RNA病毒RT-PCR试剂盒的荧光定量PCR仪为：ABI系列、Bio-Rad系列（ICycler/MJOpticon2）、StratageneMX系列、RocheLightCycler、CepheidSmartCycler、CorbettRotor-Gene、杭州博日系列等。

相应地，本实施例还提供了一种使用小双节RNA病毒检测试剂盒进行小双节RNA病毒检测的方法，包括附图2所示的以下步骤：

1）样本RNA提取；

2）RT-PCR一步检测；

3）结果判断。

步骤1）中的操作方法如下：取样品离心后加入Trizol试剂，迅速破碎细胞并保持RNA的完整性；再加入24:1（v/v）的氯仿/异戊醇，RNA溶于极性较大的水相中；离心后取上清液；加入等体积的异丙醇；离心，弃上清，用75%（v/v）的冰乙醇洗涤沉淀后，离心弃乙醇；沉淀室温干燥除去乙醇，用DEPC-H2O溶解沉淀，得到待检样本RNA。

步骤1）中所述样本为离体的哺乳动物粪便或其他需要进行小双节RNA病毒检测的离体样本。

步骤2）的操作步骤包括：取待检样本RNA，加入RT-PCR反应液，上机检测；

步骤2）中所述RT-PCR是指在逆转录酶的作用下，将小双节RNA病毒的样本RNA逆转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR，扩增cDNA片段。PCR反应的最常见的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性结果的产生。因此步骤2）中所述RT-PCR技术采用一步法完成，即将所述RT-PCR的两个步骤：mRNA逆转录为cDNA和以cDNA为模版进行PCR在同一个反应管进行，这样可以避免因操作过程中开盖造成的样品污染，增加了测试结果的准确性。

步骤2）中PCR反应参数设置：第一阶段预变性42-50℃/10-15min，92-95℃/2-3min；第二阶段92-95℃/5-10S，55-60℃/40-80S；共35-40个循环，优选40个循环。

步骤3）中，值得注意的是，每次试验设置有阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。

采用本发明实施例的检测方法对离体的哺乳动物粪便或其他需要进行小双节RNA病毒检测的离体样本进行检测，其直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而是属于对已经脱离人体或动物体的组织、体液或排泄物进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，用于对样品中是否含有小双节RNA病毒的信息进行判断，另外也可用于对食品安全性进行检测。

实施例1

小双节RNA病毒检测试剂盒

一种小双节RNA病毒检测试剂盒，包括RT-PCR反应液、Trizol试剂、氯仿/异戊醇、异丙醇、DEPC-H₂O、阴性对照液、阳性对照液，各组分含量为：

Trizol试剂    13mL/瓶；

氯仿/异戊醇   3mL/瓶；

异丙醇        9mL/瓶；

DEPC-H₂O      1.5mL/瓶；

RT-PCR反应液  20μL/管；

阴性对照液    40μL/管；

阳性对照液    40μL/管；

其中，阳性对照RNA：提取并使用小双节RNA病毒基因组RNA为阳性模板，使用0.01M、pH=8.0Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；阴性对照液：不含有小双节RNA病毒RNA的其他RNA病毒基因组的pH=8.0的Tris-EDTA缓冲液；氯仿/异戊醇为按体积比24:1配制的氯仿/异戊醇溶液，规格3mL/1瓶，数量1瓶；其中DEPC-H₂O配备2管，RT-PCR反应液配备3条，每条8管，其他组分配备1瓶或1管。

所述RT-PCR反应液包括第一反应液、第二反应液和稳定液，所述第一反应液与所述第二反应液通过稳定液隔开；其中，所述第二反应液包括小双节RNA病毒的上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述上游引物、所述下游引物和TaqMan探针是以小双节RNA病毒基因核酸为检测对象特异性设计，其核苷酸序列分别为：所述上游引物：5’-AGATGTTTGATACAAAAGGACCAC-3’；所述下游引物：5’-ATCCAACGTGCCAGAGTGTAGC-3’；TaqMan探针序列：5’-(FAM-GGTCTGTACAGACTTCTCCAAGTTCG-DABCYL)-3’，其中FAM为报告荧光基团，DABCYL为淬灭荧光基团。

其中，第一反应液的组分和含量如下：

DNA聚合酶   0.2μL/管；

逆转录酶    0.25μL/管；

显色剂      0.01μL/管。

第二反应液的组分和含量如下：

上游引物（50uM）     0.15μL/管；

下游引物（50uM）     0.15μL/管；

TaqMan探针（50uM）   0.15μL/管；

Buffer×10           3μL/管；

MgCl₂(25mM)          2.5μL/管；

dNTPs               3.5μL/管。

实施例二

小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法。

小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法包括以下步骤：

1.样本RNA提取

1.1取样品100μL于1.5mL离心管中，加入500μLTrizol试剂，室温剧烈震荡15秒，静置5分钟。

1.2加入120μL24:1（v/v）氯仿/异戊醇，剧烈震荡15秒，室温静置5分钟，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清置于另一新离心管中。

1.3加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，12000rpm、4℃离心10分钟。

1.4弃上清，用体积分数为75%（v/v）的冰乙醇洗涤沉淀，12000rpm、4℃离心5分钟，弃乙醇。

1.5沉淀室温干燥除去乙醇，用20～50μLDEPC-H₂O溶解沉淀待检。

2.RT-PCR一步检测方法

取5μL待检样本RNA，加入RT-PCR反应液。反应过程为：以待检样本RNA为模板逆转录成cDNA，再以合成的cDNA为模板，在引物的引导下进行PCR扩增，两步反应在同一反应管中完成。

反应条件为：第一阶段预变性42-50℃/10-15min，92-95℃/2-3min；第二阶段92-95℃/5-10S，55-60℃/40-80S；共40个循环。

3.结果判断

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线正好超过正常阴性对照品的跨增值上限为宜。质量控制原则以阴性对照组扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值。阳性对照组的扩增曲线图Ct值≤35，并有明显指数增长。每次试验必须设置阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。结果描述及判断：阴性，扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值，表明样品中不存在小双节RNA病毒，如附图3；阳性，扩增曲线图Ct值≤35，表明样品中存在小双节RNA病毒，如附图4。

对比实例

用电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法结合的方法与本发明阐述的小双节RNA病毒RT-PCR一步检测法进行对比。

取20例待检样本，每例平分为2份，分别用电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法结合的方法以及小双节RNA病毒RT-PCR一步检测法进行检测，对比试验结果。

一.电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法

取待检样本20例各一份，分别用电镜检查病毒颗粒，再用聚丙烯酞胺凝胶电泳法检测病毒的核酸，具体操作详见背景技术。

二.小双节RNA病毒RT-PCR一步检测法

取待检样本20例，按实施例1所述小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法进行检测。

三.实验结果

采用电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法结合的方法进行检测，结果为20例检测样品中，小双节RNA病毒阳性4例，阴性16例；而采用小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法结果为20例检测样品中，小双节RNA病毒阳性4例，阴性16例。

结果显示：本发明阐述的小双节RNA病毒RT-PCR一步检测法与用电镜法和聚丙烯酞胺凝胶电泳法结合的方法检测结果一致，提示本发明阐述的小双节RNA病毒RT-PCR一步检测法的准确性。附图5给出了小双节RNA病毒RT-PCR一步检测方法结果中4例阳性结果的PCR扩增图谱。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。