深圳地区C组轮状病毒和G1型小双节RNA病毒的分子进化分析

摘要

研究背景： 世界卫生组织的数据显示全球每年有80万小于5岁的儿童死于腹泻疾病。在我国，2010年全国报告感染性腹泻病例74万例，而病毒性感染占实验室确诊病例的92.7％。A组轮状病毒、人星状病毒、人杯状病毒和肠道腺病毒是常见的腹泻病原体，凸隆病毒、冠状病毒、C组轮状病毒、小双节RNA病毒等也逐渐被确定为腹泻的新发病原体，其中C组轮状病毒和小双节RNA病毒在全球范围内广泛地被检出，且两者皆为节段型病毒，容易发生重配和重组，危害较大。深圳市外来人口众多，病毒发生基因交换的可能性高，且目前深圳地区尚未检出这两种病毒，研究意义重大。 C组轮状病毒(Group C Rotavirus，GCRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，可以引起人类和动物急性胃肠炎，全基因组包括11个节段的双链RNA，编码6个病毒结构蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP6)。GCRV在全球范围均有检出，其宿主有人、猪、牛、狗、鸡。GCRV主要引起腹泻的散发流行，目前仅在日本、中国和英国出现过暴发疫情的报道。全球的血清学监测显示，各国的人群GCRV感染率为33％～39％，以老年人群的感染率最高。相对城市地区而言，农村的GCRV感染，年龄越小且感染率越高。除VP3基因外，人类GCRV所有RNA片段均高度保守，其中VP6基因之间的同源性最高，非结构蛋白编码基因同源性稍低。GCRV的不同种类株的混合感染多有报道，提示GCRV可能突破物种限制，能在人、猪、牛之间实现跨种传播。不同组的轮状病毒(Rotavirus，RV)的共同感染不仅可能造成RV组间的基因转移，且会加大对肠道的伤害。与GARV引起的重症腹泻相比，GCRV引起的症状比较缓和，但人GCRV可能造成婴幼儿等不同人群的肝外胆道闭锁，而牛GCRV可能造成奶牛的减产，对人类的健康和经济都有不利的影响。 小双节RNA病毒(Picobirnavirus，PBV)是一组小的、非包膜的双节段的双链RNA病毒，大的节段基因编码衣壳蛋白、而小的节段基因编码依赖RNA的RNA聚合酶。PBV的宿主为包括人类在内的各种不同的脊椎动物。自从在1988年的一起儿童急性胃肠炎暴发中的腹泻样品中偶然检出以来，PBV在腹泻疾病的作用引起了研究者的关注。在非腹泻的健康宿主中，PBV也可被频繁检出，有研究推测PBV可能是免疫不全个体的机会致病菌。PBV的早期检测主要是PAGE-SS法，分为大基因组型和小基因组型。以两个原型株（1型的GGI/PBV/human/China/1-CHN-97/1997和2型的GGⅡ/PBV/human/USA/4-GA-91/1991）在编码RdRp区域的保守片段设计引物对，有效性在世界多个研究中得到验证。PBV在多个国家的人类粪便样品中检出，从低至0.09％到13％不等。目前从粪便和环境中检出的大部分PBV属于GⅠ型，且GenBank上的PBV序列，至少有95％是关于GⅠ型PBV，提示GⅠ型PBV一直是优势株，但也可能是GⅢ型的引物对的检测能力不足。目前采用的系统发育研究没有显示任何基于地理分布上的聚类，提示PBV的普遍存在和同时传播。猪PBV都属于GⅠ型，提示PBV可能作为准种存在，在系统发育分析显示，猪PBV与人PBV相关，人PBV也与猪PBV有关系，跨种属传播的可能很大。早期研究显示，没有发现核苷酸序列相同的PBV株，来自相同地理位置上的分离株，比起来自一些急性胃肠炎爆发的分离株，它们之间的关系更为紧密。后来，在加尔各答的腹泻小马的身上检出马PBV，它却与相同地域的人PBV共有完全一致的序列，且与匈牙利报道的猪PBV的同源性紧密相关。 研究方法： 收集2011年和2012年深圳腹泻哨点监测系统的腹泻疑似样品，经过样品的预处理、RNA的提取后，分别采用荧光实时PCR和RT-PCR筛查C组轮状病毒和小双节RNA病毒，分离得到的C组轮状病毒阳性株，通过17对特异引物对扩增C组轮状病毒的全基因组序列;小双节RNA阳性株仅扩增GⅠ型特异片段。对扩增的GCRV特异片段双向测序，拼接序列。从GenBank数据库中分别下载包含完整编码序列的I1节段的GCRV同源序列和GⅠ型PBV的同源序列，并采集关于序列的信息。寻找最优的核苷酸替代模型，采用最大似然法，重构基因的最大似然树。通过BLAST检索，了解与检出的GⅠ型PBV分离株最为相关的序列信息。构建核苷酸相似性和氨基酸相似性矩阵，了解阳性株之间的相似性，构建系统发育树，探究深圳地区GⅠ型PBV的聚类情况。 研究结果： 1.在2011年收集的1158份腹泻疑似样品中，筛查到2株GCRV分离株，命名为94-SZ11株和272-SZ11株。2名GCRV阳性的腹泻患者都是成人，GCRV在各个年龄组、性别、季节、医院的检出率都没有统计学差异，腹泻症状缓和。 2.成功扩增出GCRV的11个节段，经测序、拼接得到2个GCRV分离株的全基因组序列。11个节段基因在核苷酸和氨基酸的同源性分别为≥96.1％和≥97.0％，基因非常保守，同源性高。重构基于最优核苷酸替代模型的11个节段的最大似然树，对两个GCRV阳性株的11个节段进行分型，结果显示深圳地区的GCRV分离株都是G4-P[2]-12-R2-C2-M3-A2-N2-T2-E2-H2型。 3.在2012年收集的1143份腹泻疑似样品中，筛查到8株GⅠ型PBV，命名为78-SZ12、184-SZ12、187-SZ12、275-SZ12、406-SZ12、740-SZ12、827-SZ12、1077-SZ12分离株。8个GⅠ型PBV阳性的腹泻患者均为成人，男女比为5∶3，分别来自北大深圳医院和龙岗人民医院，检出率在年龄、性别、医院之间有统计学差异，在季节分布上没有统计学差异。8个GⅠ型PBV阳性患者，其中5例伴有诺如病毒GⅡ型的混合感染。 4.8个GⅠ型PBV分离株的基因相似性低，核苷酸和氨基酸相似性平均值分别为70％和74％。与其最相近的GⅠ型PBV参考株当中，4株曾从美国的污水中检出，4株曾从美国、印度、匈牙利的人体检出，核苷酸同源性显示为79％-100％。重构系统发育树结果表明深圳地区8株GⅠ型PBV形成两个进化支，其中一支与荷兰和匈牙利的参考株相近，另一支与印度和美国的参考株相近。 研究结论： 1.深圳地区的GCRV检出率低至0.16％，没有年龄组、性别、季节和医院分布差异。两个GCRV分离株94-SZ11和272-SZ11都属于M3群，与东亚株群最为紧密，与南亚株群关系较远。 2.人源GCRV在全球的起源时间和地点很可能是1973年的澳大利亚墨尔本。韩国的CAU10-312株可能是Bristol株与V508株的重组株传播到了韩国。 3.深圳地区的GⅠ型PBV仅在成人中检出，没有明显的季节特征，大部分伴有混合感染。8株GⅠ型PBV分成两个进化支，同一进化支的分离株相似性高，不同进化支之间相似性低。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 C组轮状病毒

1．1．1 C组轮状病毒的概况

1．1．2 病原学和流行病学

1．1．3 分子流行病学

1．1．4 检测技术的发展

1．2 小双节RNA病毒

1．2．1 小双节RNA病毒的概况

1．2．2 病原学和流行病学

1．2．3 分子流行病学

1．2．4 检测技术的发展

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 实验所需试剂

2．1．3 实验主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品的预处理实验方法

2．2．2 RNA的提取

2．2．3 检测C组轮状病毒

2．2．4 检测GI型小双节RNA病毒

2．2．5 测序

2．2．6 序列分析

2．2．7 统计方法

第三章 实验结果

3．1 C组轮状病毒

3．1．1 荧光实时RT-PCR检测结果

3．1．2 GCRV阳性患者的年龄分布特征

3．1．3 GCRV阳性患者的性别分布特征

3．1．4 GCRV阳性患者的季节分布特征

3．1．5 GCRV患者的来源分布

3．1．6 测序结果与同源性比较

3．1．7 核苷酸替代模型

3．1．8 系统发育树重构和基于全基因组分型

3．2 GI型小双节RNA病毒

3．2．1 GI型PBV的检测结果

3．2．2 GI型PBV阳性患者的年龄分布特征

3．2．3 GI型PBV阳性患者的性别分布特征

3．2．4 GI型PBV阳性患者的季节分布特征

3．2．5 GI型PBV患者的来源分布

3．2．6 测序与亲缘关系检测

3．2．7 序列收集和系统发育分析

第四章 讨论

4．1 C组轮状病毒

4．2 GI型小双节RNA病毒

本研究的创新点和不足

第五章 全文小结

参考文献

附录一：深圳市腹泻病人病原体检测采样表

附录二：英文缩写注释

附录三：C组轮状病毒的参考株

附录四：小双节RNA病毒的参考株

攻读学位期间成果

致谢

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