公开/公告号CN103305600A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-09-18
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申请/专利权人 海尔施生物医药股份有限公司;
申请/专利号CN201310032768.2
申请日2013-01-25
分类号C12Q1/68(20060101);G01N27/447(20060101);
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地址 315800 浙江省宁波市小港街道前进村半港河西159号
入库时间 2024-02-19 20:21:12
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-05-13
专利权的转移 IPC(主分类):C12Q1/68 变更前: 变更后: 登记生效日:20150422 申请日:20130125
专利申请权、专利权的转移
2014-09-17
授权
授权
2013-11-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20130125
实质审查的生效
2013-09-18
公开
公开
技术领域
本发明涉及抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法,尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法。
背景技术
最近几年,药物遗传学/药物基因组学在抗肿瘤药物作用机制等方面的研究获得了突破性进展,发现某些抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种(或一组)基因的表达和/或多态性显著相关。通过相关基因的检测,预测化疗及靶向药物的疗效,选择合适的药物进行个体化化疗,已经成为提高疗效、减少无效治疗的合理选择。
个体化治疗是根据患者的遗传学特点,采用特异和最佳的药物方案进行治疗的方法。大量临床数据表明,肿瘤组织中ERCC1/RRM1/TYMS/TUBB3等靶标基因mRNA表达水平可以分别预测患者对铂类/吉西他滨/氟尿嘧啶类/抗微管类等常用化疗药物的反应。根据患者肿瘤组织中mRNA表达水平的检测结果,制订个体化治疗方案,有助于选择适合患者的化疗药物,提高治疗的针对性。通过靶标检测选择化疗药物可以避免无效或有害的化疗、节省宝贵的治疗时间与治疗费用,提高患者生活质量。
目前,传统的检测基因表达(mRNA水平)的方法有以下多种:
(1)PCR检测方法:目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等,都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中,荧光定量PCR检测方法最为成熟。该方法的优点是灵敏性高,并可精确定量;该方法也有其缺点,通量低:一次只能检测一个基因的表达水平;成本相对较高:因一次只能检测一个基因,当一个样品同时需要检测多个基因表达时,必须一个一个检测,成本相对增高。
(2)分子杂交技术——Northern杂交和RNA原位杂交:互补的核苷酸序列通过 Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针对已知序列进行特异性的靶序列检测。分子杂交技术具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。但其操作步骤繁琐,且技术要求较高;同时该技术通量低,一次只能检测一个目的基因。
(3)基因芯片法:基因芯片是通过微加工技术,将数以万计,乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针),有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上,构成的一个二维DNA探针阵列,利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交,可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片法的优点是:1)高通量并行检测:当一个样品同时需要检测多个基因表达水平时,一次实验即可得出全部结果;2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果。但也存在如下缺点:1)成本较高:每个样品需要一个芯片,成本大于¥1000/样品,不利于大规模推广;探针的合成与固定比较复杂,特别是制作高密度的探针阵列,是主要的限速步骤;2)不能精确定量,重复性差;3)灵敏度较低且需核酸量较大,另外由于芯片的种类较多,难以制定一个统一的质量控制标准。
(4)转录组测序:转录组(transcriptome)广义上指某一生理条件下,细胞内所有转录产物的集合,包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA;狭义上指所有mRNA的集合。转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧啶(oligo-dT)进行亲和纯化的RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本,反映出它们的表达水平。相对于传统的芯片杂交平台,转录组测序无需预先针对已知序列设计探针,即可对任意物种的整体转录活动进行检测,提供更精确的数字化信号,更高的检测通量以及更广泛的检测范围,是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。随着测序技术的不断进步,测序通量越来越大,但其成本一直居高不下,普通病人无法承受,且测序的操作复杂,周期较长,目前暂不适用于临床医疗。
GenomeLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成,一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性,降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法,通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的表达,能 快速有效地检测基因的表达状况,克服了上述荧光定量PCR法存在的缺陷,具有以下优点:
1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术,实现单个反应检测30-40个位点,可同时做192个反应(如192个患者样品,每个样品检测30种腹泻病毒,30个位点),一天出结果;对于交叉感染患者,本方法可一次性给出准确报告,避免漏检。
2、准确性强:GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测,可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离,最大程度降低假阳性;
3、敏感性高,结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差,提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性,采用激光诱导荧光-PMT,具有超高灵敏度;
4、方法简便,使用经济:GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案;每个样品的检测成本少于¥50,利于大规模推广;
5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数,可随时根据需求调整检测的靶基因。
6、易于实现自动化:就样品制备而言,Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配,集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。
目前,国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒,包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品,所述的反转录引物包括以下表1中14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增 引物及RNA内参的RT扩增引物,所述的PCR引物包括以下表1中14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物,基因序列如下表1所示:
表1
所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物,所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA;反向引物扩增序列为GTACGACTCACTATAGGGA,所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
所述的阳性对照品为从肿瘤细胞提取的RNA混合物,所述的RNA混合物包含所述的14种抗肿瘤用药相关基因mRNA。
一种利用使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒的检测抗肿瘤用药相关基因表达水平的方法,具体包括以下步骤:
(1)采集样本并提取核酸
采集患者肿瘤组织石蜡包埋切片样品的分离培养物,从分离培养物中提取核酸;
(2)以患者核酸为模板进行RT反应
取5-20ng/ul的核酸样品RNA5μL,DEPC水8μL,5×RT缓冲液4μL,RT引物溶液2μL,RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录,反应条件:48°C1分钟;42°C60分钟;95°C5分钟;4°C直至收取RT产物;其中RT引物溶液中各RT引物浓度均为500nM,所述的RT引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物,基因序列如序列表中SEQ ID NO.1~NO.18所示;
(3)以反转录产物为模板进行PCR反应
取RT产物8.6μL,10×PCR缓冲液2μL,25mM的氯化镁4μL,PCR引物溶液2μL,DNA聚合酶1.4μL,X溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应,反应条件:95°C10分钟;94°C30秒钟,55°C30秒钟,70°C1分钟,循环35次;70°C1分钟;4°C直至收取PCR产物;其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物,所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA;反向引物扩增序列为GTACGACTCACTATAGGGA,所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记,PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM,PCR引物包括14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物,基因序列如序列表中SEQ ID NO.19~NO.38所示;
(4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL,GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL,DNA Marker0.5 μL,矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品,将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比,获得抗肿瘤用药相关基因的表达水平。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明一种使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法,由于该试剂盒引入了针对14个抗肿瘤用药相关的基因、4个内参基因等所设计的特异性扩增引物,根据这些基因的表达水平来指导多达24种抗肿瘤药物的用药情况,一天之内可完成192个患者样品的检测,既节约了生产成本和检测成本,又提高了检测效率及缩短了时间;四个内参基因的使用可用于监测整个反应系统、RT-PCR反应的效率以及评估RNA模板的质量,避免假阴性;反应内参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率,避免假阴性,使得检测具有更好的灵敏度和特异性,从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。
综上所述,本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法,可以同时针对14个抗肿瘤用药相关基因进行检测,检测敏感性高,特异性好,降低了常规PCR扩增的假阳性率,还能够有效解决常规PCR的易污染问题;具有非竞争性内对照体系,可靠性强,无假阴性结果,利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势,为临床提供一种优越的低成本的分子诊断方法,有助于化疗药物安全有效地使用。
附图说明
图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明一种使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒,该试剂盒中包括以下试剂:
1)RT引物(反转录引物RT primer Mix)
2)PCR引物(PCR Primer Mix)
3)25mM氯化镁(25mM MgCl2)
4)逆转录酶(Reverse transcripatase)
5)DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)
6)X溶液(Solution X)
7)10×PCR缓冲液(10×PCR Buffer)
8)5×RT缓冲液(5×RT buffer)
9)阳性对照(Positive Control)
11)无RNA酶/DNA酶超纯水(Dnase/Rnase Free ddH2O)
12)阳性对照品
上述反转录引物包括以下表1中14种抗肿瘤用药相关基因的RT扩增引物及RNA内参的RT扩增引物,所述的PCR引物包括以下表1中14种抗肿瘤用药相关基因的PCR扩增引物、RNA内参的PCR扩增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物,基因序列如表1所示:
表1抗肿瘤用药相关基因多重基因检测寡核苷酸序列
上述X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物,所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA;反向引物扩增序列为GTACGACTCACTATAGGGA,所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
上述阳性对照品为从肿瘤细胞提取的RNA混合物,包含上述14种抗肿瘤用药相关基因mRNA。
根据上述14种抗肿瘤用药相关基因的表达水平来指导多达24种抗肿瘤药物的用药情况,具体如下:
(1)BRCA1:表达水平与患者对铂类和抗微管类药物的敏感性呈正相关;
(2)DPYD:表达水平与5-FU(5-氟尿嘧啶)敏感性呈负相关;
(3)EGFR:表达水平与西妥昔单抗耐药性呈正相关;
(4)PTEN:表达下调是乳腺癌分化和转移的潜在标志;
(5)ERCC1:表达水平与铂类药物疗效呈负相关;
(6)STMN1:低表达水平接受紫杉醇类/顺铂(指紫杉醇与顺铂的联合用药)治疗效果较好;高表达水平患者肿瘤有转移风险;
(7)TUBB3:低表达水平接受紫杉醇类/顺铂或长春碱类治疗效果较好;高表达水平患者肿瘤有转移风险;
(8)RRM1:表达水平与吉西他滨耐药性呈正相关;
(9)VEGFR:表达水平与贝伐单抗疗效呈正相关;
(10)HER2:表达水平与赫赛汀疗效呈正相关;
(11)TYMP:表达水平与卡培他滨疗效呈正相关;表达水平低患者有较好的预后;
(12)TYMS:表达水平与5-FU疗效呈正相关;
(13)PDGFR:表达水平变化预测索拉非尼疗效;
(14)TOP2A:表达水平与患者对依托泊苷的敏感性呈正相关。
具体实施例二
本发明一种使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因的检测方法,采集患者肿瘤组织提取核酸,以患者核酸为模板进行反转录和PCR反应,最终用毛细电泳方法分离样品,具体步骤如下:
1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的使用石蜡包埋切片样品同步检测14种抗肿瘤用药相关基因的试剂盒,试剂盒中包括的组分同上述实施例1;
2、采集样本并提取核酸
采集患者肿瘤组织石蜡包埋切片样品的分离培养物,从分离培养物中提取核酸;
3、以患者核酸为模板进行反转录(RT)反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板见表2):
表2RT反应试剂和样品混合比例
注:在RT反应中加入,阳性对照品为从肿瘤细胞提取的RNA混合物,包含所述的14种抗肿瘤用药相关基因mRNA:用量为5μL/反应
2)混匀后按以下温度孵育(见表3):
表3RT反应条件
4、以反转录产物为模板进行PCR反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板见表4):
表4PCR反应试剂和样品混合比例
注:X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物,通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA,反向引物扩增序列为GTACGACTCACTATAGGGA,通用引物正向扩增引物带荧光标记。
2)混匀后按以下温度进行热循环反应(见表5):
表5PCR反应条件
5、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
1)制备GeXP样品(见表6):
表6GeXP样品混合比例
2)毛细电泳分离样品
将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离;毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术,具体程序为90℃变性120秒,进样电压2kv,30秒,分离电压6kv,35分钟。
6、结果分析(见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书)
根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析,其横坐标表示片段大小,纵坐标为信号强弱。根据GeXP遗传分析仪的软件获得的峰图谱,各基因峰的峰面积计算得到抗肿瘤用药相关基因的相对表达水平,根据这些基因的相对表达水平来指导多达24种抗肿瘤药物的用药情况。标准图谱如图1所示,其结果能准确检测出14种抗肿瘤用药相关基因的表达水平,各目标片段大小间隔适中,且信号不至于过饱和,各靶标间信号相对持平,且没有宽峰、双峰等现象。
具体实施例三
检测试剂盒灵敏度、特异性分析
灵敏度分析:将阳性对照品按一定ng值倍比稀释后,经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号,该ng值为最低检测线,也就是试剂盒的灵敏度。本试剂盒的灵敏度为1.0ng。
特异性分析:单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
机译: 聚核苷酸和聚核苷酸分离的植物细胞,转基因植物,DNA构建体,木材,木浆,由木材转化的植物的生产方法,木浆,修饰植物表型的方法,相关性基因在两个不同样品中的表达。在一个或多个基因在植物中的基因表达水平上具有植物的表型,并且基因表达与形成反应木材的倾向相关。一种或多种基因的表达,微结膜,检测样品中一种或多种基因的方法。样品和试剂盒中一种或多种基因编码的一种或多种核酸序列。
机译: 多聚核苷酸和多聚核苷酸分离的植物细胞,转基因植物,DNA,木材,木浆,微结缔的构建,用于检测一种或多种基因表达的组合,用于修饰植物表型的试剂盒和方法,生产转化植物,木材和木浆的特性,两个不同样品中基因表达的相关性。植物表型的存在与该基因在植物中一个或多个基因表达水平的关系以及形成植物的倾向反应木和样品中一个或多个基因的检测。
机译: 确定石蜡包埋的组织样品中表皮生长因子受体基因表达的方法及其水平与存活率的相关性