单分子生物反应器制备单微纳米珠携带单根多聚物的方法

摘要

一种单分子生物反应器制备单微纳米珠携带单根多聚物的方法，上游为单分子生物反应器、下游为目的产物分离与富集器；将多聚物一端用活性基团标记，另一端或侧链用荧光物种标记，微纳米珠包被可与多聚物活性基团连接的活性基团，多聚物与微纳米珠按摩尔比1：≥10的比例注入单分子反应器，经完全连接后，经目的产物分离与富集器获得高纯度目的产物即单个微纳米珠只携带一根多聚物的复合物；本发明方法获得的目的产物，可用于单分子水平的核酸-蛋白质互作动力学、抗体筛选、单分子测序以及第二代测序仪的样品制备等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的单分子多聚物与单个纳米珠连接与富集的方 法，具体是在上游用一种单分子生物反应器，将单根多聚物分子连接到单个微纳 米珠上，在下游用分离与富集器收集单个微纳米珠只连接一根多聚物分子的目的 产物。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单 分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸 与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品 制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠， 但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解 决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表 了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文 （Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads in  microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中称 他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步 骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便、 大量制备并富集“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的产物”）的 方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、简便制备单个微纳 米珠连接单根多聚物分子的方法，用于在单分子水平研究核酸与相关蛋白分子相 互作用动力学、遗传诊断、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代核酸测序仪的样 品制备等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种制备单个微纳米珠连接单根多聚物分子的方法，具体是：采 用一内部有溶液通道的流室，流室分为上游的单分子生物反应器和下游的目的产 物分离与富集器，上游的单分子生物反应器，设有多聚物进样口和微纳米珠进样 口；将多聚物溶液和微纳米珠悬浮液注入流室，使反应成份在反应器充分反应后 彻底完成连接，完成反应器的功能；连接反应后的混合物经溶液通道进入流室下 游的目的产物分离与富集器，目的产物分离与富集器上游设有填充电泳缓冲液进 样口连接流室溶液通道，流室通道末端设有目的产物收集口和空微纳米珠出口， 分别连接目的产物收集容器和空微纳米珠收集容器；目的产物收集容器连接电源 正极，与目的产物收集容器对应的流室溶液通道另一处连接电源负极，利用外加 电场，使携带负电荷的目的产物经目的产物收集口进入目的产物收集容器，空微 纳米珠通过空微纳米珠出口进入空微纳米珠收集容器，完成目的产物分离与富集 器功能。

本发明方法中，所述多聚物和微纳米珠，可以采用现有方法制备，也可以按 照以下方法制备：

步骤一，在多聚物（包括DNA、RNA、以及二者之一与蛋白质或肽核酸连接 后的多聚物嵌合体）一端标记一种活性基团，另一端或侧链标记荧光分子，纯化 后溶解于连接缓冲液；

步骤二，采用可与标记多聚物活性基团发生连接反应的另一种活性基团包被 微纳米珠，纯化后溶解于连接缓冲液。

本发明方法中，对于在中性溶液携带负电荷的核酸分子，可直接按上述步骤 实施，对于蛋白质和肽核酸等多聚物分子，则需要事先连接一段核酸作为电分离 的介体，形成多聚物嵌合体。

所述的多聚物，是核酸、以及核酸与蛋白质、核酸与人工合成的肽核酸多聚 物连接后的嵌合体。

所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或 多聚物等，其直径在纳米至微米量级。

所述的荧光标记，是可以用于荧光显微镜观察多聚物的一类荧光分子。

所述的标记多聚物分子和包被微纳米珠的活性基团，是二者能够发生免疫绑 定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均 可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、 氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巯基-马来 酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。

本发明方法中，所述的包被微纳米珠表面的活性基团可以是中性、酸性或碱 性，后两种情况下，需要在上游单分子生物反应器混合产物进入目的产物分离与 富集器之前，通过钝化器进行钝化处理。所述钝化器，设有连接流室溶液通道的 钝化剂进样口，来自上游的微纳米珠在钝化剂进样口处与钝化剂混合，经过一段 流室溶液通道充分钝化后使微纳米珠表面不携带净电荷，然后进入下游的目的产 物分离与富集器区。

本发明方法中，所述多聚物进样口和微纳米珠进样口分别连接进样控制器， 多聚物与微纳米珠的进样速度按摩尔比1：≥10比例进样，连接反应后的结果是 一个微纳米珠上要么连接一个多聚物，要么不连接多聚物，没有连接一根以上多 聚物的机会，因微纳米珠数目远大于多聚物分子数目，因此，连接反应后也没有 自由的多聚物分子。

本发明方法中，所述的单分子生物反应器，可以通过阵列技术实现高度并行 化，提高反应通量。

本发明方法中，所述的电泳缓冲液，是用于将溶液的pH值维持在近中性范围 以分离目的产物的溶液，可以是Good缓冲液，如25mM Hepes（pH7.5），1M KCl， 或其他电泳缓冲液，如Tris-TAE、Tris-TPE、Tris-TBE或碱性缓冲液等。填充电 泳缓冲液起到屏蔽微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的产物收集口的作用。所 述的填充电泳缓冲液液流的设置方式可以是侧流方式，也可以是鞘流方式；侧流 方式则是填充电泳缓冲液在样品流一侧形成屏蔽填充液流，鞘流方式则是填充电 泳缓冲液在样品流的四周形成屏蔽填充液流；填充电泳缓冲液设置为侧流时，目 的产物收集口及空微纳米珠出口的位置分别对应于填充电泳缓冲液和样品溶液进 入流室溶液通道时的位置；设置为鞘流时，目的产物出口与空微纳米珠出口分叉 即可，不受上游样品溶液和填充电泳缓冲液进入流室溶液通道时的位置影响。

所述的目的产物分离与富集器，是根据核酸在中性溶液携带负电荷，用核酸 电泳和流体力学原理分离目的产物的装置。样品在通过流室通道时，目的产物因 携带负电荷，在外加电场拉动下，离开溶液通道中的样品溶液流，经目的产物出 口进入与其电性质相反的目的产物收集容器，实现分离和收集目的产物的目的， 因空微纳米珠不携带电荷，不受外加电场力的影响，随样品溶液液流进入空微纳 米珠出口。部分流室通道的填充电泳缓冲液可以进入目的产物收集容器，也可以 不进入目的产物收集容器，后一种情况下，目的产物收集容器中事先加满电泳缓 冲液。

本发明方法中，可在各种条件（包括温度、装置内各通道的尺寸、形状、电 泳缓冲液组分、样品和填充电泳缓冲液进样速度以及电极间距）确定后，计算得 到能够将目的产物牵引至目的产物收集容器所需的最小外加电场的电压V_min，也 可以通过安装成像系统装备的荧光显微镜，自低向高调节外加电压，通过显微镜 观察带荧光标记的目的产物开始进入目的产物收集口，得出V_min。在外加电压V ≥V_min条件下，均可实现本发明的实施效果。

本发明方法中，所述多聚物溶液进样口、微纳米珠溶液进样口、钝化剂进样 口和目的产物富集器的填充电泳缓冲液人口，连接进样控制器，进样控制器可以 是注射泵、蠕动泵或鞘流泵等精量进样推进器。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效益：制备出的目的产物纯度接近 100%、数量多。在单分子DNA与相关蛋白分析中，在光学显微镜或荧光显微镜 辅助下，直接拾取目的产物，准确、便捷，不再需要复杂而缓慢的光学镊、磁镊 或原子力显微镜操作步骤；目的产物经修饰可用于在单分子水平研究DNA与相关 蛋白相互作用动力学、结合高灵敏纳米孔传感器测序DNA、检测免疫反应以及新 一代DNA测序仪的样品制备等。

附图说明

图1是填充电泳缓冲液设置为侧流，部分填充电泳缓冲液进入目的产物收集 容器的的装置。

图2是填充电泳缓冲液设置为侧流，填充电泳缓冲液不进入目的产物收集容 器的装置。

图3是填充电泳缓冲液设置为鞘流，填充电泳缓冲液不进入目的产物收集容 器的装置。

图4是填充电泳缓冲液设置为鞘流，部分填充电泳缓冲液进入目的产物收集 容器的装置。

图5是在包被微纳米珠的活性基团呈酸性或碱性时，单分子生物反应器输出 的混合物经钝化器钝化后，进入目的产物分离与富集器，其中，填充电泳缓冲液 设置为侧流，填充电泳缓冲液不进入目的产物收集容器的装置。

图6是在包被微纳米珠的活性基团呈酸性或碱性时，单分子生物反应器输出 的混合物经钝化器钝化后，进入目的产物富集器，其中，填充电泳缓冲液设置为 鞘流，部分填充电泳缓冲液进入目的产物收集容器的装置。

具体实施方式

以下实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式、过程以及装置的工作原理，但本发明的保护范 围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件或按照制造商所建议的条件进行。

实施例1

如图1-2所示，本实施例采用一内部溶液通道的流室1，所述流室1溶液通道 分上游单分子生物反应器和下游目的产物分离与富集器；单分子生物反应器设有 多聚物溶液进样口2和微纳米珠悬浮液进样口3，反应组分经所述进样口2和进样 口3进入溶液通道，混合后在单分子生物反应器的反应区4充分反应，完成连接 反应后，进入下游目的产物富集器区；所述目的产物分离与富集器，目的产物分 离与富集器区内的上游设有填充电泳缓冲液入口5，填充电泳缓冲液与来自单分子 生物反应器的混合产物汇合，在二者流向流室溶液通道下游过程中，填充电泳缓 冲液形成侧流；所述流室1溶液通道下游的末端，设有目的产物收集口6和空微 纳米珠出口7，分别连接目的产物收集容器8和空微纳米珠收集容器9，两者的位 置分别对应于填充电泳缓冲液和混合产物溶液进入流室溶液通道时的位置；目的 产物收集容器连接电源正极，与之相对的流室溶液通道另一侧（如图1）或者其他 位置（如图2）连接电源负极。该装置中，全部混合产物溶液流进入空微纳米珠收 集容器9，全部目的产物进入目的产物收集容器8，从电泳缓冲液填充口5加入的 填充电泳缓冲液，不进入（图1）或部分进入（图2）目的产物收集容器8。连接 目的产物收集容器8的目的产物收集口6与连接空微纳米珠收集容器9的空微纳 米珠收集口7分叉处，安装高灵敏成像系统装备的荧光显微镜。

采用上述装置，将一端标记活性基团、另一端或侧链标记荧光分子的多聚物 分子与活性基团包被的微纳米珠分别装载到连接多聚物进样口2和连接微纳米珠 进样口3的进样器，按多聚物分子与微纳米珠摩尔比1：10的比例进样；随后启 动连接填充电泳缓冲液进样口5、盛有填充电泳缓冲液的进样器；利用外加电场使 目的产物经目的产物收集口6进入目的产物收集容器8，空微纳米珠经空微纳米珠 出口7进入空微纳米珠收集容器9。

本实施例中，目的产物收集口6与空纳米珠出口7分叉处，安装高灵敏成像 系统装备的荧光显微镜，用于观察和调节流室正负极间的电压。

本实施例中，多聚物进样口2、微纳米珠进样口3和填充电泳缓冲液入口5 采用注射泵或蠕动泵控制进样速度。

实施效果：本实施例可获得纯度90%以上的目的产物。

实施例2

如图3-4所示，本实施例采用一内部溶液通道的流室1，从所述的填充电泳缓 冲液入口5进入流室溶液通道的填充电泳缓冲液形成鞘流，填充电泳缓冲液用鞘 流泵控制进样速度，利用外加电场力使目的产物进入目的产物收集容器，其他操 作特征同实施例1。

实施效果：本实施例可获得纯度90%以上的目的产物。

实施例3

如图5-6所示，本实施例采用一内部溶液通道的流室1，所述流室1溶液通道 分上游单分子生物反应器、中游微纳米珠表面钝化器和下游目的产物分离与富集 器；单分子生物反应器设有多聚物进样口2和微纳米珠进样口3，反应组分经所述 进样口2和进样口3进入溶液通道混合后在单分子生物反应器的反应区4充分反 应，完成连接后进入流室溶液通道中游的钝化器；所述的钝化器，设有钝化剂进 样口5，钝化剂溶液与来自单分子生物反应器混合产物汇合后进入钝化区6充分混 匀并使包被微纳米珠表面的活性基团钝化，之后，进入流室溶液通道下游的目的 产物分离与富集器；所述目的产物分离与富集器，设有填充电泳缓冲液入口7，来 自钝化器的混合液与填充电泳缓冲液汇合，在两种溶液沿流室溶液通道向下游流 动过程中，填充电泳缓冲液形成屏蔽侧流（图5）或鞘流（图6）；所述流室1溶 液通道末端，设有目的产物收集口8和空微纳米珠出口9，分别连接目的产物收集 容器10和空微纳米珠收集容器11；在填充电泳缓冲液设置为侧流情况下，目的产 物收集口8和空微纳米珠收集口9的位置分别对应于填充电泳缓冲液和钝化后溶 液进入流室溶液通道时的位置；目的产物收集容器连接电源正极，与之相对的流 室溶液通道另一侧（如图5）或者其他位置（如图6）连接电源负极。该装置中， 来自钝化器的溶液，沿流室溶液通道经空微纳米珠收集口9全部进入空微纳米珠 收集容器11，目的产物在外加电场力的作用下经目的产物收集口8全部进入目的 产物收集容器10，从电泳缓冲液填充口7加入的填充电泳缓冲液，不进入（图5） 或部分进入（图6）目的产物收集容器10。连接目的产物收集容器10的目的产物 收集口8与连接空微纳米珠收集容器11的空微纳米珠收集口9分叉处，安装高灵 敏成像系统装备的荧光显微镜。

采用上述装置，将一端标记活性基团、另一端或侧链标记荧光分子的多聚物 分子与非中性活性基团包被的微纳米珠分别装载到连接多聚物进样口2和连接微 纳米珠进样口3的进样器，按多聚物分子与微纳米珠摩尔比1：10的比例进样； 随后启动连接流室溶液通道的钝化剂入口5、盛有非中性活性基团钝化剂溶液的进 样器和连接填充电泳缓冲液进样口7、盛有填充电泳缓冲液的进样器；利用外加电 场使目的产物经目的产物收集口8进入目的产物收集容器10，空微纳米珠经空微 纳米珠出口9进入空微纳米珠收集容器11。

实施效果：本实施例可获得纯度90%以上的目的产物。

实施例4

步骤一，线性λDNA的一端连接EML4-ALK基因融合产物蛋白的单克隆抗体 D5F3，侧链用TOTO-1标记，另一端用标记生物素，纯化后溶于连接缓冲液；

步骤二，将直径500nm的磁珠用抗链霉生物素包被，磁铁辅助纯化后悬浮于 连接缓冲液；

步骤三，采用如附图1所示的流室，将步骤一、二样品分别加入连接两个进 样口的蠕动泵，按多聚物：纳米珠的摩尔数比1：100的比例进样；待混合液进入 下游目的产物分离与富集器时，启动装有填充电泳缓冲液的蠕动泵，利用在目的 产物收集口和空微纳米珠出口分叉处安装的带有成像系统的荧光显微镜观察，从 小向大调节电极间的电压，使目的产物进入收集口，观察并记载目的产物进入收 集口的过程。

实施效果：该方法可获得纯度≥99%的目的产物。

在单分子DNA与相关蛋白分析中，在光学显微镜或荧光显微镜辅助下，用微 移液器直接拾取目的产物，准确、便捷，不再需要复杂而缓慢的光学镊、磁镊或 原子力显微镜操作步骤；目的产物经过修饰后，可用于研究DNA与相关蛋白相互 作用动力学、结合高灵敏纳米孔传感器测序DNA、抗体筛选以及第二代DNA测 序仪的样品制备等。

实施例5

步骤一，将λDNA一端标记氨基，另一端标记Cy3，纯化后溶于连接缓冲液；

步骤二，用环氧树脂包被直径1μm的硅珠，纯化后溶于连接缓冲液；

步骤三，采用如附图2所示的流室，将步骤一、二样品分别加入连接两个进 样口的注射泵，按DNA：微米珠的摩尔数比例1：10的比例进样；待混合液进入 下游目的产物分离与富集器时，启动连接电泳缓冲液进样口的注射泵；其他操作 特征同实施例4。

实施效果：用本实施例获得的目的产物可获得纯度在95.0%以上的目的产物。

实施例6

步骤一，将线性λDNA分别连接序列为（1）GCCGCACACG、（2） CAGGCACTTCT、（3）GCCGCGCACGT和（4）CAGGCGCTTCT的4种人工合 成手性肽核酸（PNA），DNA侧链用TOTO-1标记、自由端用地高辛标记，纯化 后溶于连接反应液；

步骤二，用抗地高辛蛋白包被直径700nm的聚苯乙烯（PS）珠，纯化后溶于 连接反应液；

步骤三，采用如附图3所示的流室，将步骤一、二样品分别加入连接两个进 样口的注射泵和鞘流泵，按多聚物：纳米珠的摩尔数比1：50的比例进样，同时 打开注射泵和鞘流泵，待混合液进入下游目的产物富集区时，打开连接填充电泳 缓冲液进样口、盛有填充电泳缓冲液的注射泵；其他操作特征同实施例4。

实施效果：该方法可以获得纯度95%以上的目的产物。

实施例7

步骤一，将待测序、长度约1kb的靶DNA片段一端连接接头A，侧链用 YOYO-1标记，另一端连接接头B（接头B距靶DNA远端的5’端携带由四聚乙 醇间隔的生物素），纯化后溶于连接反应液；

步骤二中，用抗链霉生物素包被直径20μm的磁珠，将携带生物素的引物1 与磁珠连接，纯化后溶于连接反应液；

步骤三、采用如附图4所示的流室，除靶DNA与磁珠按摩尔比200：1的比 例进样外，其他操作特征同实施例4。

实施效果：该方法可以获得纯度99.9%的目的产物，没有含两个或更多靶DNA 的复合物。产物可按照厂商的指导，做乳液PCR扩增、装载并测序。同理，该方 法还可用于其他基于微纳米珠阵列的第二代测序仪的样品制备，包括基于基于焦 磷酸测序的MiSeq、基于连接测序的SOLiD系列、Polonator系列、PinPoint Mini、 MaxSeq和基于合成测序的Ion Torrent PGM测序仪等的样品制备。

实施例8

步骤一，将线性λDNA一端标记氨基活性基团，另一端连接肿瘤坏死因子α （TNF-α）单克隆抗体，侧链标记YOYO-1荧光分子，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤二，将直径5μm的磁珠包被羧基活性基团，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤三，采用如附图5所示的流室，将步骤一、二样品分别加入连接两个进 样口的注射泵，按多聚物：微米珠的摩尔数比1：500比例进样；待反应混合产物 进入钝化器时，打开连接钝化器进样口、盛有碘甲烷的注射泵，待混合液进入下 游目的产物分离与富集器时，打开连接填充电泳缓冲液进样口、盛有填充电泳缓 冲液的注射泵；其他操作特征同实施例4。

实施效果：该方法可以获得纯度约100%的目的产物。

实施例9

步骤一，将线性λDNA一端连接肿瘤坏死因子α（TNF-α）单克隆抗体，另 一端标记琥珀酰亚胺碳酸酯，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤二，将直径5μm硅微米珠包被氨基活性基团，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤三，采用如附图6所示的流室，将步骤一、二样品分别加入连接两个进 样口的蠕动泵和鞘流泵，按多聚物与微米珠的摩尔比1：500的比例进样，同时打 开蠕动泵和鞘流泵，待反应混合产物进入钝化器时，打开连接钝化器进样口、盛 有乙酸的注射泵，在钝化器完成微米珠表面氨基的钝化，待混合液进入下游目的 产物分离与富集器时，打开连接填充电泳缓冲液进样口、盛有填充电泳缓冲液的 注射泵；其他操作特征同实施例4。

实施效果：该方法可以获得纯度约100%的目的产物。

由以上实施例可以看出，本发明制备出的目的产物纯度高、数量多，可获得 纯度90%以上的目的产物，操作准确、便捷。

当然，本发明中所用的活性基团不限于上述实施例中列出的，凡是可用于实 现连接核酸与微纳米珠的活性基团对均可，例如生物素-抗生物素蛋白、地高辛- 抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸 酯等）、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧 基-酰肼基、羰基-酰肼基等。

本发明中，单分子生物反应器、钝化器、目的产物分离与富集器，在外观上 可以与附图相同，也可以不同，凡是能够实现本发明目的和实施效果的均可。

本发明中，流室溶液通道的电源负极，可以设置在如图所示的位置，也可以 设置在其他位置，凡是能够实现本发明目的和效果的任何一处均可。

本发明中，在各种条件（包括温度、装置内各通道的尺寸、形状、电泳缓冲 液组分、样品和填充电泳缓冲液进样速度以及电极间距）确定后，经计算或显微 镜观察下自小到大调节电压，可以得出将目的产物牵引至目的产物收集容器所需 的最小电压阈值V_min，只要外加电压V≥V_min，后续就可不再借助光学手段（即用 荧光分子标记核酸及使用显微镜）而进行直接分离。

应当理解的是，本发明中的装置形状也并不局限于实施例附图中所示的形状， 还可以是其他形状，凡是能够实现本发明目的和实施效果的均可。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到， 上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后， 对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由 所附的权利要求来限定。