表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基及其配制方法和发酵工艺

摘要

本发明公开一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基，所述重组酿酒酵母菌为腺嘌呤缺陷型酵母菌，所述发酵培养基包括有以下组分：酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、葡萄糖12～26g/L、海藻糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L。本发明还公开了相应的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基的配制方法、表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵工艺。本发明可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表达水平，且生产过程简单易于控制、发酵周期短。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种表达HBsAg的重组酿酒 酵母菌发酵培养基及其配制方法和发酵工艺。

背景技术

我国是乙型肝炎高流行区，每年平均报告发病人50多万例，而接种乙肝 疫苗是预防乙型肝炎最有效、最经济的方法。我国于1992年将乙型肝炎疫苗 纳入计划免疫管理，2009年开始，国家又将乙型肝炎免费接种范围扩大至对 15岁以下青少年儿童，以及医务人员、大学生和现役军人等，全国对乙肝疫 苗的需求愈来愈大。如今全国各乙肝疫苗厂家均在积极通过生产技术改进与 革新等提高生产效率或扩大产能，以满足因乙肝免费接种扩大到15岁以上和 其他高危人群形成的突然增长的市场需求。

目前，乙肝疫苗主要是采用重组酿酒酵母菌发酵生产而得。现有的重组 酿酒酵母菌发酵培养基主要组分为酵母粉、大豆蛋白胨、葡萄糖。这种培养 基碳源单一、微量因子缺乏，发酵密度小、以致发酵产量与HBsAg表达水平 低，难以满足乙型肝炎疫苗市场日益增长的需求。

为此，本领域内的技术人员进行了大量的研究，如何对培养基进行优化， 以实现重组酵母表达乙肝表面抗原的高密度培养和目的产物的高表达方面在 国内外有一些文献报道，但多限于实验室阶段，极少研究或应用于大规模生 产。已经公布的CN200410005407.X，CN200410005408.4专利申请文献均采 用分批流加培养技术进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，但流程控制较为 复杂，且发酵周期相对较长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌 发酵培养基，该培养基可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表 达水平，且生产过程较简单且易于控制、发酵周期短。

本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿酒 酵母菌发酵培养基的配制方法，该方法配制出的培养基可显著提高重组酿酒 酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表达水平，且生产过程易于控制、发酵周期短。

本发明更进一步所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿 酒酵母菌的发酵工艺，该发酵工艺可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量 和HBsAg表达水平，且生产过程较简单且易于控制、发酵周期短。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵培养基，所述重组酿酒酵母菌 为腺嘌呤缺陷型酵母菌，包括有以下组分：酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨 25～40g/L、葡萄糖12～26g/L、海藻糖10～30g/L、腺嘌呤0.05～0.2g/L。

优选地，各组分具体含量为：

酵母粉35g/L、大豆蛋白胨32g/L、葡萄糖20g/L、海藻糖10g/L、腺嘌呤 0.05g/L。

优选地，各组分具体含量为：

酵母粉42g/L、大豆蛋白胨35g/L、葡萄糖17g/L、海藻糖17g/L、腺嘌呤 0.1g/L。

优选地，所述重组酿酒酵母菌为腺嘌呤缺陷型酵母菌。

优选地，所述重组酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae2150-2-3 （pHBS56-GAP347/33）。

相应地，本发明还公开了一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基 的配制方法，该培养基为如上所述的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌培养基， 该方法包括以下步骤：

分别称取1个单位体积的酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、海藻 糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L，混合后加入到发酵罐中，搅拌均匀后经 121℃灭菌30分钟；

用注射用水对葡萄糖溶解，得到1个单位体积的葡萄糖溶液12～26g/L；

采用无菌操作将所得的葡萄糖溶液经0.2μm滤器除菌过滤后，加入到所 述发酵罐中，并搅拌均匀，即得所述发酵培养基。相应地，本发明还公开了 一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵工艺，包括以下步骤：

制备种子液；

按照如上所述的方法配制发酵培养基，在接种前标定溶氧电极的溶氧值 为100%；

以10%的接种量将所述种子液接种于所述发酵培养基中发酵；

在发酵过程中分多次采用无菌操作加入除菌过滤后的葡萄糖溶液，每次 加入的葡萄糖相对于发酵液的浓度为6g/L；

发酵至第48～55小时时后，终止发酵。

优选地，所述菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg 的重组酿酒酵母工作种子批菌种。

优选地，在所述发酵过程中，分多次在发酵第12、17、21小时加入所述 葡萄糖溶液。

本发明的有益效果是：

本发明的实施例通过在表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基组分 中加入适量海藻糖和腺嘌呤，提高重组酿酒酵母菌在发酵阶段的细胞量及抗 原表达量，从而显著提高了重组酿酒酵母菌表达HBsAg的发酵细胞量和 HBsAg表达水平。

具体实施方式

下面详细描述本发明提供的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵培养 基。所述发酵培养基包括有以下组分：酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、 葡萄糖12～26g/L、海藻糖10～30g/L、腺嘌呤0.05～0.2g/L。

其中，具体实现时，所述重组酿酒酵母菌为腺嘌呤缺陷型酵母菌。所述 重组酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae2150-2-3（pHBS56-GAP347/33）。

下面详细描述本发明的提供的上述表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发 酵培养基的制备方法。该方法主要包括以下步骤：

分别称取1个单位体积的酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、海藻 糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L，混合后加入到发酵罐中，搅拌均匀后经 121℃灭菌30分钟；

用注射用水对葡萄糖溶解，得到1个单位体积的葡萄糖溶液12～26g/L；

采用无菌操作将所得的葡萄糖溶液经0.2μm滤器除菌过滤后，加入到所 述发酵罐中，并搅拌均匀，即得所述发酵培养基。下面详细描述本发明的提 供的利用上述表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵工艺，包括以下步骤：

制备种子液；

按照前述实施例的方法配制发酵培养基，在接种前标定溶氧电极的溶氧 值为100%；

以10%的接种量将所述种子液接种于所述发酵培养基中发酵；

在发酵过程中分多次采用无菌操作加入除菌过滤后的葡萄糖溶液，每次 加入的葡萄糖相对于发酵液的浓度为6g/L；

发酵至第48～55小时，其发酵液在660nm波长下的吸光值不再增加及溶 氧基本维持不变，终止发酵。

具体实现时，所述制备种子液步骤具体包括：

取表达HBsAg的重组酿酒酵母菌种，在0.25L锥形瓶中27-29℃摇瓶培 养17-19小时、在2L锥形瓶中27-29℃摇瓶培养17-19小时、在70L种子罐 中27-29℃发酵培养16-22小时后，得到种子液。

其中，在所述发酵过程中，可分别在发酵第12、17、21小时加入所述葡 萄糖溶液。

本实施例中，所述菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达 HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种。

下列实施例旨在进一步举例更具体地描述本发明的具体实施方式，但是 应理解所述实施例仅为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：应用于10L发酵罐发酵

本实施例的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基包括以下组分：

酵母粉35g/L、大豆蛋白胨32g/L、葡萄糖20g/L、海藻糖10g/L、腺嘌呤 0.05g/L。

其配制方法如下：

分别称取1个单位体积的酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、海藻 糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L，混合后加入到发酵罐中，搅拌均匀后经 121℃灭菌30分钟；

用注射用水对葡萄糖溶解，得到1个单位体积的葡萄糖溶液12～26g/L；

采用无菌操作将所得的葡萄糖溶液经0.2μm滤器除菌过滤后，加入到所 述发酵罐中，并搅拌均匀，调pH值为5.0±0.1，即得所述发酵培养基。

采用本实施例的发酵培养基发酵与现有技术发酵的比较

本实施例的发酵培养基发酵步骤如下：

（1）按照现有的重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产工艺制备种子液，具 体的讲取以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌 种经0.25L锥形瓶27-29℃摇瓶培养17-19小时、2L锥形瓶27-29℃摇瓶培养 17-19小时、70L种子罐27-29℃发酵培养16-22小时后作为种子液；

（2）配制发酵培养基，在接种前标定10L发酵罐溶氧电极的溶氧值为 100%；

（3）以10%的接种量将步骤（1）所得的种子液接种于步骤（2）的发酵 培养基中；

（4）发酵，在发酵第12、17、21小时无菌操作分别加入除菌过滤后的 葡萄糖溶液，使其每次加入的葡萄糖终浓度（相对于发酵液）为6g/L；

（5）发酵至第48～52小时，其发酵液在660nm波长下的吸光值不再增 加及溶氧基本维持不变，终止发酵。得到细胞重量0.0853g/ml（湿重），单位 发酵液中HBsAg含量为168μg/ml。

对照实验1

现有技术发酵培养基的主要组分为：

酵母粉42g/L、大豆蛋白胨35g/L，葡萄糖17g/L。

发酵过程

培养基的配制过程及种子液的生产过程如上所述，再以10%的接种量将 种子液接种于该发酵培养基中，然后发酵44～48小时，其发酵液在660nm波 长下的吸光值不再增加及溶氧基本维持不变，终止发酵。得到细胞重量 0.0713g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为108μg/ml。

结果分析1

应用本发明的优化培养基进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，得到细 胞重量0.0853g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为168μg/ml；而现有 的发酵培养基进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，得到细胞重量 0.0713g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为108μg/ml。

实验证明本发明的优化培养基进行生产能够提高重组酵母菌在发酵阶段 的细胞量及抗原表达量，从而提高HBsAg的最终收率近60%。

实施例2：发酵培养基应用于800L发酵罐发酵

本实施例的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基包括以下组分：

酵母粉42g/L、大豆蛋白胨35g/L，葡萄糖17g/L、海藻糖17g/L、腺嘌呤 0.1g/L。

其配制方法如下：

分别称取1个单位体积的酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、海藻 糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L，混合后加入到发酵罐中，搅拌均匀后经 121℃灭菌30分钟；

用注射用水对葡萄糖溶解，得到1个单位体积的葡萄糖溶液12～26g/L采 用无菌操作将所得的葡萄糖溶液经0.2μm滤器除菌过滤后，加入到所述发酵 罐中，并搅拌均匀，即得所述发酵培养基。。

优化后的发酵培养基发酵与现有技术发酵的比较

优化后的发酵培养基发酵步骤如下：

（1）按照现有的重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产工艺制备种子液，具 体的讲取以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌 种经0.25L锥形瓶27-29℃摇瓶培养17-19小时、2L锥形瓶27-29℃摇瓶培养 17-19小时、70L种子罐27-29℃发酵培养16-22小时后作为种子液；

（2）配制发酵培养基，在接种前标定800L发酵罐溶氧电极的溶氧值为 100%；

（3）以10%的接种量将步骤（1）所得的种子液接种于步骤（2）的发酵 培养基中；

（4）发酵，在发酵第12、17、21小时无菌操作分别加入除菌过滤后的 葡萄糖溶液，使其每次加入的葡萄糖终浓度（相对于发酵液）为6g/L；

（5）发酵至第48～52小时，其发酵液在660nm波长下的吸光值不再增 加及溶氧基本维持不变，终止发酵。得到细胞重量0.0812g/ml（湿重），单位 发酵液中HBsAg含量为154μg/ml。

对照实验2

现有技术发酵培养基的主要组分为：

酵母粉42g/L、大豆蛋白胨35g/L，葡萄糖17g/L。

发酵过程

培养基的配制过程及种子液的生产过程如上所述，再以10%的接种量将 种子液接种于该发酵培养基中，然后发酵44～48小时，其发酵液在660nm波 长下的吸光值不再增加及溶氧基本维持不变，终止发酵。得到细胞重量 0.0677g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为104μg/ml。

结果分析2

应用本发明的优化培养基进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，得到细 胞重量0.0812g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为154μg/ml；而现有 的发酵培养基进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，得到细胞重量 0.0677g/ml（湿重），单位发酵液中HBsAg含量为104μg/ml。

以上实验证明，本发明的优化培养基进行生产能够提高重组酵母菌在发 酵阶段的细胞量及抗原表达量，从而提高HBsAg的最终收率近50%，提高了 生产效率，对大规模高密度高表达的重组酵母表达乙肝表面抗原发酵生产工 艺具有极其重要的意义和社会效益。

本发明的有益之处在于与现有技术相比，通过优化发酵培养基的配方， 按照上述发酵过程进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，其发酵细胞产量与 HBsAg表达量均有显著提高，其最终单位发酵液抗原表达量提高45%以上。 本发明改善了重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产时产率低下的现状，同时生产 过程易于控制，具有很好的工业使用价值。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。