采用同源重组技术构建PrA低表达且能分泌LTP1的酿酒酵母菌株及其性能研究

摘要

酿酒酵母蛋白酶A(PrA)〔EC3.4.23.25〕为酿酒酵母产生的一种酸性蛋白水解酶。纯生啤酒采用低温膜过滤除菌达到生物稳定性，因而蛋白酶A的活性不被破坏。由于啤酒的pH值在4.3—4.4的酸性范围内，因此啤酒被消费者消费之前，蛋白酶A都会降解啤酒中的蛋白和多肽，尤其是当啤酒中的泡沫阳性蛋白被蛋白酶A降解后会导致啤酒的泡沫衰减、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用来衡量啤酒质量的一个重要指标。前人的研究结果证实啤酒中的大麦脂转移蛋白1(LTP1)是对啤酒泡沫稳定性最为关键的蛋白，这种蛋白是底物特异性较小的酵母蛋白酶A的作用底物，这使得纯生啤酒的泡沫衰减问题更加突出。
　　 为从根本上解决纯生啤酒的泡沫衰减问题，本研究论文中从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中通过PCR分别扩增得到了酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1 promoter)、MFα1信号肽序列(MFα1s)、细胞色素C终止子序列(CYC1 terminator)等表达调控DNA序列；从二棱大麦(Hordeum vulgare)基因组中扩增得到了大麦脂转移蛋白1(LTP1)的编码序列，并构建了酿酒酵母的大麦脂转移蛋白1的表达盒。将遗传霉素G418的抗性序列KanMX作为筛选标记与大麦Ltp1表达盒共同克隆到质粒YEplac181的多克隆位点中，得到酿酒酵母大麦LTP1分泌表达型质粒YEp181—KAMLC。使用质粒YEp181—KAMLC对酿酒酵母WZ65进行转化并使用酿酒酵母转化子菌株进行发酵实验，采用HPLC对大麦Ltp1表达盒的下游产物进行检测。检测结果表明，大麦脂转移蛋白1在酿酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表达，在发酵开始的24小时内大麦脂转移蛋白1的产量增加较为缓慢，之后有较大的提高，72小时后大麦脂转移蛋白1分泌量的增加速度变慢。随着发酵时间的延长，大麦LTP1的产量一直呈现上升趋势。到发酵的132小时，发酵液中大麦脂转移蛋白1的分泌量达到29.45mg/L。
　　 使用含有大麦Ltp1表达盒和KanMX标记序列的转化DNA片段同源重组到酿酒酵母基因组上PEP4基因位点，使一个PEP4等位基因的编码序列被外源基因序列所替换。这样将会使酿酒酵母在表达啤酒泡沫阳性蛋白—大麦LTP1的同时，由于PEP4一个等位基因的缺失而造成其编码产物—蛋白酶A表达的降低，从而达到既增加泡沫阳性蛋白LTP1的含量，又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通过对转化子的筛选和鉴定，得到了基因型为PEP4/pep4：：KanMX—Ltp1的酿酒酵母重组子菌株。对得到的重组菌株进行发酵培养，通过采用变性不连续SDS—PAGE和Tricine—SDS—PAGE方法对经过处理的发酵液进行分析发现，本实验中所用到的对酿酒酵母重组菌分泌到培养液的大麦LTP1两种电泳分析方法中，Tricine—SDS—PAGE方法要比普通的SDS—PAGE方法优越。酵母表达的分子量大小约10KDa的蛋白条带能够得到很好的分离。进一步免疫印迹实验证实，重组菌株分泌的分子量对应于10KDa左右的表达产物为大麦LTP1。
　　 为了确保重组菌株在工业生产中的安全性，需要对抗性选择标记KanMX进行删除。TEF1启动子不能被本实验中所用的酿酒酵母表达系统所识别，因此使用TEF promoter更换了Sh ble表达盒中的TEF1 promoter，并构建了质粒pSH47/ZEO，利用Cre/loxP系统对重组子染色体上的KanMX进行了删除，并成功的使酵母细胞丢掉了质粒pSH47/ZEO。最终获得了大麦Ltp1表达盒结构完整、整合位点精确的酿酒酵母重组菌株。
　　 对不同发酵时期LXP1的浓度检测结果表明，在12°P未加酒花的麦汁中重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在发酵第108小时分泌大麦LXP1的浓度分别达到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麦汁中重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到12.07和12.13mg/L。对获得的重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β进行继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、絮凝性和蛋白酶A活性等生理生化指标进行了测试。重组菌株经过继代培养30代后遗传性能稳定。重组菌株与出发菌株相比，蛋白酶A活性降低了30％左右，对数生长期变慢，但稳定期的细胞浓度与对照菌基本相当，其他生理指标与对照菌株无明显差异。
　　 通过酿酒试验对多项指标的测试结果表明，重组菌株酿造的啤酒口味与现行其他干啤相近，各项理化指标均达到国家标准优级，泡持时间从原来的202s提高到326s。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1 前言

2影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素

2.1啤酒的泡沫性质

2.2啤酒泡沫的物理特性

2.3啤酒泡沫的化学分子特性

2.4啤酒的化学成分及其对泡沫的影响

2.5发酵菌种和生产原料对啤酒泡沫的影响

2.6生产工艺对啤酒泡沫的影响

3与啤酒泡沫相关的主要的蛋白和蛋白酶

3.1 Z-蛋白

3.2脂转移蛋白1(LTP1)

3.3酿酒酵母蛋白酶A

3.4液泡内的其它蛋白酶

4改善纯生啤酒泡沫的主要策略

4.1选用优质的生产菌株和原辅料

4.2优化生产工艺

4.3使用泡沫添加剂

5利用同源重组技术在酿酒酵母中表达外源基因

5.1同源重组

5.2外源基因在酿酒酵母细胞中的表达

5.3基因工程技术对啤酒质量的改善

6前景与展望

7选题背景与研究思路

第二章 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的构建

1前言

2材料和方法

2.1材料、主要试剂和仪器设备

2.2实验方法

3结果与讨论

3.1基因片段的扩增

3.2大麦Ltp1表达盒的构建

4小结

第三章大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的测试

1前言

2材料与方法

2.1材料、主要试剂和仪器

2.2实验方法

3结果与分析

3.1 DNA片段KAMLC的PCR扩增

3.2 DNA片段KAMLC的鉴定

3.3质粒YEp181-KAMLC的构建

3.4质粒YEp181-KAMLC的鉴定

3.5酿酒酵母转化子的鉴定

3.6大麦LTP1的HPLC标准曲线

3.7 YEp181-KAMLC酿酒酵母转化子LTP1的分泌表达

4讨论

5小结

第四章 大麦Ltp1表达盒在酿酒酵母PEP4位点的重组

1前言

2材料与方法

2.1材料、主要试剂和仪器

2.2实验方法

3结果和分析

3.1重组转化DNA片段的PCR扩增

3.2酿酒酵母转化子的筛选与鉴定

3.3表达产物的变性电泳

3.4表达产物的免疫学检测

4讨论

4.1基因重组的位点

4.2酿酒酵母重组子发酵产物的蛋白电泳

5 小结

第五章酿酒酵母重组子抗性标记基因的删除

1前言

2材料与方法

2.1材料、主要试剂和仪器

2.2实验方法

3结果和分析

3.1 ZeoCassette、Gall Promoter和TEF Promoter的PCR扩增

3.2 ZeoCassette与Gall Promoter的连接

3.3 TEF promoter与DNA片段EM7P—Sh ble-CYClT—GallP的连接

3.4质粒pSH47／ZEO的构建

3.5质粒pSH47／ZEO的酿酒酵母转化子的PCR鉴定

3.6 KanMX菌株的鉴定

3.7质粒pSH47／ZEO的丢失

3.8重组菌株S.c-Ltp1中Ltp1表达盒的完整性

4讨论

4.1质粒pSH47的改造

4.2 KanMX标记基因的删除

5小结

第六章 重组酵母菌株的遗传稳定性及其发酵性能

1前言

2材料与方法

2.1材料和主要试剂

2.2主要仪器和设备

2.3实验方法

3结果和分析

4讨论

5小结

第七章 重组菌株的酿酒试验

1前言

2材料与方法

2.1酵母菌种及原料

2.2主要仪器

2.3实验方法

3结果与讨论

3.1各种理化指标的测定结果

3.2酵母菌性能测试

4小结

第八章 主要结论

8.1结论

8.2主要创新成果

8.3展望

参考文献

致谢

攻读博士期间发表学术论文