Incarviatone A在抗幽门螺杆菌药物中的应用

摘要

体外活性实验表明Incarviatone A具有很强的抗幽门螺旋杆菌(

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及Incarviatone A在制备抗幽门螺杆菌药物中的 应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌。研究显示，幽门 螺杆菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指肠溃疡的主要致病原因,并可能与胃癌和胃粘膜相关 性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤发病有关。最近，世界卫生组织将Hp归为I类致癌物， 它在胃癌发展中起主导作用。目前流行的治疗Hp感染的方案是同时服用质子泵抑制剂（PPI） 加两种抗生素（克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种）的三联疗法。影响三联 疗法的最主要因素被认为是Hp对抗菌剂的耐药性；另一严重问题是质子泵抑制剂会诱发消 化不良，大量抗菌剂则导致消化道内菌群的严重毁灭。因此，寻找高效、安全的抗Hp活性 一类新药物成为一个重要和迫切的任务。

本发明涉及的化合物Incarviatone A是一个2012年发表（Shen,Y.H.et al.,2012. Incarviatone A,a structurally unique natural product hybrid with a new carbon  skeleton from Incarvillea delavayi,and its absolute configuration via calculated  electronic circular dichroic spectra.RSC Advances2,4175–4180.）的新骨架化合 物，该化合物拥有全新的骨架类型，目前没有关于该化合物活性方面的报道，对于本发明 涉及的Incarviatone A在制备治疗抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，由于骨架类 型属于全新的骨架类型，而且其对于幽门螺杆菌抑制活性强得意想不到，不存在由其他化 合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于幽门螺杆菌感染的防治显然 具有显著的进步。

发明内容

本发明的目的是研究Incarviatone A在抗幽门螺杆菌药物中的应用。

所述化合物Incarviatone A结构如式（Ⅰ）所示：

Incarviatone A的体外实验表明，Incarviatone A具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，纸片 法显示其抑菌圈直径为26mm(ATCC43504)。用琼脂稀释法显示它能完全抑制5个随机的 临床菌株（Hp001、Hp003、Hp004、Hp018和Hp036）和1个标准菌株(ATCC43504)的生 长，最小抑菌浓度（MIC）均为0.5μg/ml。用氨苄西林作阳性对照，其对6株测试菌完全 抑制的最小浓度（MIC）为2.0μg/ml。

本研究结果显示，Incarviatone A的抑制幽门螺旋杆菌活性的能力比氨苄西林强，说明 对于与幽门螺旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，Incarviatone  A是一个极具开发潜力的化合物。它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。

本发明涉及的Incarviatone A在制备治疗抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，由 于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于幽门螺杆菌抑制活性强得意想不到，不存在 由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于幽门螺杆菌感染的 防治显然具有显著的进步。

具体实施方式

本发明所涉及化合物Incarviatone A的制备方法参见文献（Shen,Y.H.et al.,2012. Incarviatone A,a structurally unique natural product hybrid with a new carbon skeleton from Incarvillea  delavayi,and its absolute configuration via calculated electronic circular dichroic spectra.RSC Advances2, 4175–4180.）。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例 的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：本发明所涉及化合物Incarviatone A片剂的制备：

取20克化合物Incarviatone A，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例2：本发明所涉及化合物Incarviatone A胶囊剂的制备：

取20克化合物Incarviatone A，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000 片。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

Incarviatone A的药理实验

1）供试菌株

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)标准菌株ATCC43504购于美国菌种保存中心 (American Type Culture Collection，ATCC)。15株Hp临床菌株采自江苏省人民医院消化科、 江苏省中医院检验科和南京市儿童医院胃镜室接受胃镜检查的患者；在连续胃镜检查中对 消化性溃疡、十二指肠球炎或疣状胃炎的患者，先经快速尿素酶实验确定为Hp阳性者，再 取胃窦黏膜1-2块，切碎后接种于含8%马血清、三甲氧苄氨嘧啶（trimethropin,TMP）1.25 g/L、多粘菌素（polymyxin）B2500U/L、万古霉素(vancomycin)10mg/L的Columbia选择性 琼脂培养基中，于37℃在微氧环境下(5%O₂,10%CO₂和85%N₂)培养72小时。收集细 菌，经涂片革兰氏染色，氧化酶、触酶和尿素酶鉴定为阳性后，传代纯培养，所得菌株作 为实验菌株。

2）菌株培养

我们采用微需氧袋（购自上海医科大学）进行HP的菌株培养，它可通过化学反应产生 Hp所需要的微需氧环境。

3）生物活性测定

采用纸片法（Microbiological paper method）测定化合物对幽门螺杆菌的抑制作用，用 琼脂稀释法来测定供试样品的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。

I.纸片法实验

(A)准备培养基将配制好的Columbia培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至50-60℃，加8% 马血清或绵羊血，混匀倾注于已经灭菌的培养皿中，每皿7-10ml，培养基厚度为1.5mm(无 菌操作)。

(B)转接实验菌（涂菌）用微量取样器取稀释好的10⁸CFU/ml(1OD₆₆₀=10⁸CFU/ml)Hp 的菌悬液0.1ml均匀地涂抹在适宜的培养皿表面。倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目 的使琼脂表面干燥，备用。

(C)贴样品纸片用微量取样器取6μl待测样品(质量浓度2mg/ml)注入已经灭菌的圆滤 纸片上。用无菌镊子镊取含样品的纸片和对照空白纸片，按无菌操作分别纸片紧贴于含菌 琼脂表面，每隔一定距离贴一张纸片。每种菌做3皿，所得结果求其平均值。

(D)培养将各平皿置于微需氧袋中，封口，打开气体发生器，再置于37℃培养箱中培养 72h。

(E)测抑菌圈直径取出平板后，分别测量各纸片周围抑菌圈直径的大小。参照对照组的 结果，可得出待测样品敏感实验的结果。重复三次。

II.琼脂稀释法测定MIC

(A)药物平板的制备首先将测试的化合物用二甲基亚砜（DMSO）溶液配制成0.5mg/ml 的母液，再用无菌水稀释，最终配成10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5， 1.0，0.5和0.25μg/ml的浓度系列，DMSO在介质中的浓度小于1%。将1ml配制好的测试 化合物溶液与保温于50℃的9ml哥伦比亚培养基另加1ml保温于50℃的马血清充分混 匀，浇制入培养皿中冷却即成。

(B)转接实验菌（涂菌）用微量取样器吸取稀释好的1×10⁸CFU/ml Hp的菌悬液0.1ml 均匀地涂抹在培养皿表面，倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，备 用。

(C)确定MIC将待测培养皿在微需氧袋(含：85%N₂,10%CO₂和5%O₂)中，保温37℃ 培养72小时，观察Hp生长情况，与空白组相对照，以完全没有菌生长的样品最低浓度为最 低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。阳性对照为氨苄西林(Ampicillin)。

3、Incarviatone A的药理实验结果

体外实验表明，Incarviatone A具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，纸片法显示其抑菌圈 直径为26mm(ATCC43504)。用琼脂稀释法显示它能完全抑制5个随机的临床菌株（Hp001、 Hp003、Hp004、Hp018和Hp036）和1个标准菌株(ATCC43504)的生长，最小抑菌浓度（MIC） 均为1.5μg/ml。用氨苄西林作阳性对照，其对6株测试菌完全抑制的最小浓度（MIC）为 2.0μg/ml。

结论：Incarviatone A抑制幽门螺旋杆菌活性的能力比氨苄西林强，说明对于与幽门螺 旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，Incarviatone A是一个极 具开发潜力的化合物。它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。