中药黄芩中黄酮类化合物作为DXR抑制剂的用途

摘要

本发明通过对传统中药黄芩提取物进行1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶（DXR）抑制活性检测，发现其乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有较好的DXR酶抑制活性，对这两部分提取物进一步的分离纯化得到两个具有DXR抑制活性的单体化合物。光谱分析显示它们分别为5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇（I）和5,6,7–三羟基黄酮（II），它们对DXR的抑制率分别为62.6%（1μg/μl）和73.6%（1.2μg/μl），从而确立了中药黄芩（Radix scutellariae）中黄酮类化合物作为1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的用途。

说明书

技术领域

本发明属于酶抑制剂筛选领域，具体涉及一种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶 （DXR）抑制剂。

背景技术

抗生素的出现和发展对人类的健康发挥了重要的作用，几乎每个人都使用过抗生素。 然而近年来由于抗生素的不合理使用，甚至是滥用，使得许多细菌对抗生素产生耐药性， 从而导致抗生素的作用效果下降。目前，临床上应用的几乎所有抗生素都出现了相应的耐 药菌株，甚至出现了耐多种抗生素的超级细菌，这些耐药菌株的出现严重威胁了人类的健 康。因此，对抗生素耐药机制的研究和寻找新的抗生素具有迫切的现实意义。

萜类化合物是天然产物中最大的一个家族，已经分离并鉴定出了五万多种化合物，该 类化合物每年以100多种新化合物的速度在增长。尽管它们种类繁多，结构多样，但它们 的骨架都来源于异戊二烯，因此又被称作异戊二烯类化合物。萜类化合物在生物体中发挥 重要的生物功能，许多萜类化合物也是中药中的有效成分并且具有很好的药理作用。

萜类化合物的生物合成有两条不同的途径，即经典的甲羟戊酸途径（mevalonate  pathway，MVA pathway）和上世纪九十年代发现的非甲羟戊酸途径（non-mevalonate  pathway，MEP pathway）。研究发现，大多数人类病原微生物通过MEP途径合成自身必须 的萜类化合物，而包括人在内的动物通过MVA途径合成萜类化合物。因此，MEP途径中 的关键酶可以作为筛选抗生素的靶标，通过该途径筛选的抗生素具有毒性低、副作用小等 特点。DXR是MEP途径中的第二个酶，在NADPH和二价金属离子的作用下催化DXP还 原异构为MEP。由于该反应是MEP途径中碳流的分支点，因此该酶也被认为是MEP途径 中的第一个关键限速酶。所以，DXR抑制剂的研究具有重要的意义。

现有研究表明，DXR抑制剂以从淡紫链霉菌（Streptomyces lavendulae var.fuscus）中 分离得到膦胺霉素（1）及其类似物FR900098（2）最具有代表性。

它们对大肠杆菌（E.coli）DXR的IC₅₀分别为54nM和62nM,同时它们在体内也表现 出很强的抗疟原虫活性，现已经作为抗疟药进入临床试验阶段。该类化合物虽然有良好的 抑制活性，但有如下特性使其不具备良好的成药性：1.极性大，难以穿过小极性生物膜； 2.口服利用度差；3.半衰期短；4.生物利用度低。为了解决这些问题，科学工作者对这两个 化合物进行了一系列的结构修饰工作，以期获得一些具有更好成药性的化合物。解决该问 题的另一条途径就是寻找新的具有DXR抑制活性的化合物。

传统中药的抗病原微生物作用途径主要有两种，其一，中药含有抗菌成分如小檗碱、 大蒜素可以直接于病原微生物；其二，中药通过提高机体免疫力，依赖于人体自身免疫应 答消灭病原微生物。传统中药在中国已经有几千年的使用历史，许多中药，尤其是具有清 热解毒功效的中药，如穿心莲、黄芩、黄连等等，在研究中均被发现有不同范围，不同程 度，且通过不同机制产生的抗菌活性。因此，从传统中药中筛选某些酶抑制剂，进而将其 发展为潜在的抗菌素，已成为一种新的研究方向。但由于中药中化学成分非常复杂，而其 中的有效成分含量又往往较低，因此需要对大量的植物材料进行提取，然后再对所获得的 提取物进行反复的分离纯化，这样才有可能得到活性化合物。目前，尚未见有关黄酮类化 合物作为DXR酶抑制剂的文献报导。

发现内容

本发明通过实验从已被临床证明具有较强抗病原微生物活性的中药黄芩中寻找具有 DXR酶抑制作用的化合物，作为潜在的抗生素、除草剂、免疫调节剂等。

本发明主要基于以下理论以及实验分析研究：

1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶（DXR）催化DXP还原异构化为MEP的过程如 下反应式所示：

具体而言，若加入的黄芩提取物使DXR活性受到抑制，则DXP的转化将会降低，因 此通过比较不加黄芩提取物和加入黄芩提取物两种情况下DXP的转化率就可以判断黄芩 提取物是否对DXR具有抑制作用。DXP为羰基类化合物，可在酸性条件下与2,4-二硝基 苯肼（2,4-DNPH）反应生成相应的苯腙类化合物，该类化合物可用高效液相色谱法（HPLC） 在360nm处进行定量分析。而DXR反应产物MEP中不含有羰基，不能与2,4-DNPH进行 衍生化反应，因而不会对测定产生干扰。因此，通过比较加与不加黄芩提取物时DXP-苯 腙的峰面积就可以判断所加入的黄芩提取物对DXR的活性影响。由于DXP中含有磷酸基 团，该基团的存在会影响其与2,4-DNPH发生衍生化反应的效率，因此在进行衍生化反应 前用碱性磷酸酶（CIAP）先将DXP中磷酸基团水解后再进行衍生化反应。反应过程如下 式所示：

最终，本发明确立了：中药黄芩（Radix scutellariae）中黄酮类化合物作为1-脱氧-D- 木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂的用途。尤其可以用于制备抗生素、除草剂或免疫调节 剂产品。

对DXR酶抑制作用最为明显的两种黄酮类化合物分别为5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇 （I）和5,6,7–三羟基黄酮（II）；

制备上述两种黄酮类化合物的方法，可以按照以下主要步骤进行：

1）黄芩干燥根制成细粉，用分析纯乙醇溶液提取，过滤，滤渣再以乙醇重复提取； 合并提取液，减压浓缩至浓稠状液体；

2）获得的浓缩物以蒸馏水分散，用分析纯石油醚萃取；

3）石油醚萃取残液以分析纯乙酸乙酯进行萃取，合并萃取液，减压浓缩，所得浓缩 物以硅胶柱层析法进行反复纯化，在不同的流动相条件下分别获得5,7,2’,6’-四羟基二氢黄 酮醇（I）和5,6,7–三羟基黄酮（II）。

上述制备方法可以进一步作如下优化：

步骤1）中所用黄芩干燥根为100-500克，制成细粉为10-40目；所用分析纯乙醇溶液 浓度为50%-90%（V/V），用量为0.5-2L，提取温度为室温到50℃，提取时间每次12-24 小时，重复提取次数为二至五次；减压浓缩时水浴温度为30-40℃，压力为30-60mmHg；

步骤2）中获得的浓缩物以25-60ml蒸馏水分散，萃取用石油醚沸程为30-60℃或60-90 ℃，每次用量30-60ml，重复萃取2-4次；

步骤3）中乙酸乙酯进行萃取时，每次用量30-60ml，重复萃取2-4次；减压浓缩时水 浴温度为30-40℃，压力为30-60mmHg；

步骤3）中硅胶柱层析法进行反复纯化时，所用柱子为4.0cm×45cm（直径×高） 至2.0cm×25cm普通玻璃柱，硅胶为100-300目层析硅胶，流动相为石油醚-乙酸乙酯= 5:1至1:1（V/V）；其中化合物II在石油醚-乙酸乙酯=3:1部分获得，化合物I在石油醚- 乙酸乙酯=1:1部分获得。

本发明具有以下优点：

本发明确立了黄芩中的黄酮化合物5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇和5,6,7–三羟基黄酮（黄 芩素）是其中的抗菌活性成分，它们可以通过抑制细菌中的DXR酶活性来抑制细菌的生长。 在此基础上，进一步合成了这两个黄酮化合物的全甲基化及全乙酰化衍生物，并测定这些 衍生物的DXR酶抑制活性弱于它们的母体化合物。

具体实施方式

一、5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇和黄芩素提取分离及结构鉴定：

1、黄芩干燥根400克制成20目细粉，室温下用70%分析纯乙醇溶液提取（1L×3， 每次12小时）；过滤，滤渣再以乙醇重复提取。合并提取液，在水浴温度为35℃，压力为 60mmHg下减压浓缩至浓稠状液体；

2、获得的浓缩物以50ml蒸馏水分散，以分析纯石油醚（沸程60-90℃）萃取三次， 每次用石油醚55ml；

3、石油醚萃取残液以分析纯乙酸乙酯萃取三次，每次用乙酸乙酯50ml；合并萃取液， 在水浴温度为35℃，压力为40mmHg下减压浓缩至浓稠状液体，所得浓缩物以硅胶柱层 析法进行反复纯化，所用硅胶为200目层析硅胶，所用柱子为4.0cm×45cm（直径×高） 至2.0cm×25cm普通玻璃柱，流动相为石油醚-乙酸乙酯=5:1至1:1（V/V）。化合物 5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇（I，11mg）在石油醚-乙酸乙酯=1:1（V/V）部分获得，化合 物黄芩素（II，17mg）在石油醚-乙酸乙酯=3:1（V/V）部分获得。它们的结构通过质谱 及核磁共振谱解析。光谱数据如下：

5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇（I），¹H-NMRR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.23（1H， s，5-OH），10.42（1H，s，3-OH），7.46（1H，t，J=8Hz，4’-H），6.91（2H，d，J=8Hz， 3’，5’-H），6.41（1H，d，J=1Hz，6-H），6.36（1H，d，J=1Hz，8-H），5.99（1H，d，J=4Hz， 2-H），5.10（1H，d，J=4Hz，8-H）。EI-MS：m/z304[M]⁺。

黄芩素（II），¹H-NMR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.75（1H，s，5-OH），8.07（2H， m，2’，6’-H），7.60（3H，m，3’，4’，5’-H），6.76（1H，s，3-H），6.69（1H，s，8-H）。 EI-MS：m/z270[M]⁺。

二、5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇（I）和黄芩素（II）衍生物的制备：

1、全甲基化衍生物I-a及II-a的制备：

化合物I或II5mg溶于3ml无水乙醇中，加入0.3g氢氧化钠使反应体系呈碱性，然 后取0.2ml硫酸二甲酯加入该溶液中，避光搅拌回流反应8h。停止加热，待反应液冷却 后，向反应瓶中慢慢加入4ml2M盐酸，过滤除去固体物，减压蒸馏除去乙醇，残余物以 乙酸乙酯（3×5ml）萃取。合并乙酸乙酯萃取液，分别以饱和碳酸钠水溶液（2×10ml）及 饱和食盐水洗涤两次（2×10ml），加入1g无水硫酸钠过夜干燥。过滤除去无水硫酸钠， 旋转蒸发回收溶剂乙酸乙酯，得到黄色粉末状固体。硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯（7:1 至5:1），收集洗脱液，合并含有化合物I-a或II-a的部分，回收溶剂即得到全甲基化产物 I-a或II-a。

I-a：¹H-NMRR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.20（1H，s，5-OH），10.46（1H，s， 3-OH），7.41（1H，t，J=8Hz，4’-H），6.94（2H，d，J=8Hz，3’，5’-H），6.41（1H，d， J=1Hz，6-H），6.26（1H，d，J=1Hz，8-H），6.09（1H，d，J=4Hz，2-H），5.15（1H，d， J=4Hz，8-H），3.46-3.88（Me x5）。EI-MS：m/z374[M]⁺。

II-a：¹H-NMR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.71（1H，s，5-OH），8.02（2H，m，2’， 6’-H），7.65（3H，m，3’，4’，5’-H），6.66（1H，s，3-H），6.61（1H，s，8-H），3.59-3.94 （Me x3）。EI-MS：[M]⁺m/z312。

2、全乙酰化衍生物I-b及II-b的制备：

化合物I或II5mg溶于2ml氯仿中，加入0.4g无水乙酸钠使反应体系呈弱碱性，然 后取2ml醋酸酐加入该溶液中，在搅拌下回馏反应12h。停止加热，待反应液冷却后，向 反应瓶中加入10ml蒸馏水，过滤除去固体物，然后以乙酸乙酯（3×10ml）萃取。合并乙 酸乙酯萃取液，分别以饱和碳酸钠水溶液（2×10ml）及饱和食盐水洗涤两次（2×10ml）， 加入2g无水硫酸钠过夜干燥。过滤除去无水硫酸钠，旋转蒸发回收溶剂乙酸乙酯，得到 黄色粉末状固体。硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯（7:1至1:1），收集洗脱液，合并含有化 合物I-b或II-b的部分，回收溶剂得到全乙酰化产物I-a或II-a。

I-b：¹H-NMRR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.11（1H，s，5-OH），10.34（1H，s， 3-OH），7.48（1H，t，J=8Hz，4’-H），6.95（2H，d，J=8Hz，3’，5’-H），6.35（1H，d， J=1Hz，6-H），6.31（1H，d，J=1Hz，8-H），6.05（1H，d，J=4Hz，2-H），5.05（1H，d， J=4Hz，8-H），2.01-2.08（MeCO x5）。EI-MS：m/z514[M]⁺。

II-b：¹H-NMR（CD₃COCD₃，400MHz）δ：12.71（1H，s，5-OH），8.05（2H，m，2’， 6’-H），7.55（3H，m，3’，4’，5’-H），6.68（1H，s，3-H），6.56（1H，s，8-H），2.05-2.09 （MeCO x3）。EI-MS：m/z396[M]⁺。

三、DXR酶抑制活性的检测：

在反应体系中分别加入不同待测物，采用柱前衍生-HPLC方法检测。操作过程为：

1、衍生化试剂120mM2,4-二硝基苯肼溶液的配制：称取2,4-二硝基苯肼（2,4-DNPH） 96mg，溶于4mL30%HClO₄溶液中即得。

2、样品的制备：

1）待测化合物检测体系：在500μl离心管中分别加入Tris-HCl缓冲液、底物DXP、 Mg²⁺、NADPH，使它们的浓度分别为100mM（pH8.0）、1.5mM、5mM、1.5mM，再加入 待测物（浓度约1mg/ml），最后加入DXR使其浓度为0.1mg/ml，加ddH₂O补足体积至50μl。 上述反应混合物在37℃孵育50min，1000rpm下离心10min，取出上清液并加入5μl的CIAP 缓冲液和3U的CIAP进行酶切反应。2h后加入137μl的甲醇和5μl衍生化试剂，室温下衍 生45min后1000rpm下离心10min，取上清100μl进行HPLC检测。

2）阳性对照样品：在500μl离心管中分别加入Tris-HCl缓冲液、底物DXP、Mg²⁺、 NADPH，使它们的浓度分别为100mM（pH8.0）、1.5mM、5mM、1.5mM，再加入林胺霉 素（浓度0.1μM），最后加入DXR使其浓度为0.1mg/ml，加ddH₂O补足体积至50μl。上 述反应混合物在37℃孵育50min，1000rpm下离心10min，取出上清液并加入5μl的CIAP 缓冲液和3U的CIAP进行酶切反应。2h后加入137μl的甲醇和5μl衍生化试剂，室温下衍 生45min后1000rpm下离心10min，取上清100μl进行HPLC检测。

3）阴性对照样品：在500μl离心管中分别加入Tris-HCl缓冲液、底物DXP、Mg²⁺、 NADPH，使它们的浓度分别为100mM（pH8.0）、1.5mM、5mM、1.5mM，最后加入DXR 使其浓度为0.1mg/ml，加ddH₂O补足体积至50μl。上述反应混合物在37℃孵育50min， 1000rpm下离心10min，取出上清液并加入5μl的CIAP缓冲液和3U的CIAP进行酶切反 应。2h后加入137μl的甲醇和5μl衍生化试剂，室温下衍生45min后1000rpm下离心10min， 取上清100μl进行HPLC检测。

3、结果：对化合物I和II及它们的全甲基化和全乙酰化衍生物进行了DXR活性抑制 试验，结果表1所示。

表1化合物I和II及它们的衍生物对DXR活性的影响

从上表中可以看出，黄芩乙酸乙酯部分中的化合物5,7,2’,6’-四羟基二氢黄酮醇（I）及 黄芩素（II）对DXR的抑制作用比较强，它们对DXR的抑制率分别为62.6%（1.0μg/μl）和 73.6%（1.2μg/μl）。但它们的全甲基化及全乙酰化衍生物的活性相对于母体化合物有明显的 降低，尤其是全甲基化的衍生物，它们基本上失去了DXR抑制活性。这说明化合物I和II 的酚羟基与这两个化合物的DXR抑制活性可能密切相关。