传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗

摘要

本发明涉及传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗，属于生物制药领域。运用基因工程技术，构建含传染性法氏囊病病毒强毒株VP2基因的重组杆状病毒，用昆虫细胞培养方法高效表达病毒样颗粒重组VP2蛋白；应用淋巴细胞杂交瘤技术，建立分泌高中和效价的抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，用细胞培养或诱生BALB/c腹水的方法制备单克隆抗体。将病毒样颗粒重组VP2蛋白与单克隆抗体采用特定的方法制成传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗，这种新型疫苗对传染性法氏囊病具有预防和治疗双重功能，比单独使用疫苗和/或抗体效果更好，使用方便，具有巨大的生产及应用价值。

说明书

 

一、技术领域

本发明涉及传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗，属于生物制药领域。

二、背景技术

传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的传染病。该病不但引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和多种疫苗免疫接种失败。目前，IBD仍是危害养鸡业的主要疫病之一，并且由于该病的免疫预防失败而造成的经济损失巨大，有效防治该病对保障养鸡业健康发展十分重要。

IBDV是双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员，基因组由大（A）小（B）两个节段组成，编码五种病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1是病毒的非结构蛋白，是由B节段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶，与病毒RNA的复制和毒力有关。A节段含有两个部分重叠的开放阅读框（ORF），其中较大的ORF编码多聚蛋白VP2-4-3，然后被加工成三个成熟蛋白VP2、VP4和VP3。VP2和VP3是病毒的结构蛋白，构成病毒衣壳，VP2既是病毒的的主要结构蛋白又是病毒的主要保护性抗原。VP4为病毒自身蛋白酶。另一个小ORF编码VP5，是病毒的非结构蛋白，与病毒的毒力和复制效率有关。

由于IBDV的生物学性质稳定、基因组易变异以及多种禽鸟类可带毒传播，致该病毒难以根除，自然感染IBDV的鸭、鹅等水禽以及麻雀等野生鸟类，不仅是IBDV的携带者，而且为IBDV在疫区长期滞留提供了条件也是产生IBDV变异毒株的“混合器”。近年来，由于IBDV变异毒株、超强毒株以及自然重配超强病毒株的出现，使IBD呈现出新的变化：发病季节全年化、发病日龄区间增大、宿主范围扩大、病变不典型、疫苗免疫失败等，造成了巨大的经济损失。

对易感鸡群实施疫苗接种是预防IBD的首选方法。目前，有IBD弱毒疫苗和灭活疫苗。在使用IBD弱毒疫苗免疫时，由于不同鸡群甚至同一鸡群不同个体的母源抗体水平差异很大，最佳免疫时间很难确定，往往需要进行多次加强免疫来弥补初次免疫的不足，在此期间，如果野毒侵入，将造成IBD的发生。灭活疫苗存在着价格较高和使用不便的缺点，临床使用较少。

受疫苗质量、使用方法、病毒变异以及易感鸡群的母源抗体水平等多种因素的影响，在生产实际中，IBD的免疫预防失败或疫情会时有发生。在一些中小型养鸡场，对发病鸡采用注射IBDV卵黄抗体或免疫血清进行被动免疫治疗的方法，可降低发病群体的死亡率，减少经济损失。虽然这种方法不是尽快消灭传染源的措施，但在现阶段IBDV广泛存在的生态环境下，不失为一种采用抗体进行被动免疫防治IBD的应急手段。目前，使用的IBDV卵黄抗体或免疫血清是采用免疫动物方法制备的，不仅质量不稳定，而且也难以进行规范化生产，此外，因多种病原可以经卵垂直传播或血液水平传播，存在着严重的生物安全风险。

鉴于当前IBD免疫预防和治疗中存在着的主要问题，急需采用新的研究思路和技术手段，研制IBD新型预防与治疗双功能疫苗，以满足养鸡业对IBD的防治需求。

 

三、发明内容

技术问题  

当前IBD免疫预防和治疗中存在着的主要问题：

① IBD是由IBDV引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的传染病。该病不但引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和多种疫苗免疫接种失败。目前，IBD仍是危害养鸡业的主要疫病之一，造成的经济损失巨大，有效防治该病对保障养鸡业健康发展十分重要。由于IBDV变异毒株、超强毒株以及自然重配超强病毒株的出现，使IBD呈现出新的变化：发病季节全年化、发病日龄区间增大、宿主范围扩大、病变不典型、疫苗免疫失败等，因此，迫切需要研究新的技术手段防治该病。

②在使用IBD弱毒疫苗免疫时，由于不同鸡群甚至同一鸡群不同个体的母源抗体水平差异很大，最佳免疫时间很难确定，往往需要进行多次加强免疫来弥补初次免疫的不足，在此期间，如果野毒侵入，将造成IBD的发生。灭活疫苗存在着价格较高和使用不便的缺点，临床使用较少。

③受疫苗质量、使用方法、病毒变异以及易感鸡群的母源抗体水平等多种因素的影响，在生产实际中，IBD的免疫预防失败或疫情会时有发生。在一些中小型养鸡场，对发病鸡采用注射IBDV卵黄抗体或免疫血清进行被动免疫治疗的方法。目前，使用的IBDV卵黄抗体或免疫血清是采用免疫动物方法制备的，不仅质量不稳定，而且也难以进行规范化生产，此外，因多种病原可以经卵垂直传播或血液水平传播，存在着严重的生物安全风险。

鉴于当前IBD免疫预防和治疗中存在着的主要问题，急需采用新的研究思路和技术手段，研制IBD新型预防与治疗双功能疫苗，以满足养鸡业对IBD的防治需求。 

 

技术方案

1、 传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗，是由特异性的传染性法氏囊病病毒样颗粒重组VP2蛋白与高效价中和活性单克隆抗体组成的。 

2、根据权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗，其制备方法为：

1）传染性法氏囊病病毒样颗粒重组VP2蛋白的制备

用RT-PCR方法扩增IBDV强毒株VP2基因，定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中，构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2，转化Escherichia coli DH10Bac感受态，筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2；用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac-VP2； 

2）传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗的制备

将2体积的质量体积比10%硫酸铝钾溶液与1体积1mol/L的碳酸氢钠溶液震荡混合，取沉淀物，加入1体积含ELISA效价≧1600的IBDV病毒样颗粒重组VP2蛋白饱和PBS缓冲液，4℃感作12 h，再加入1体积中和效价≧2¹¹的IBDV单克隆抗体mAb，4℃感作12 h，获得氢氧化铝胶-VP2-mAb组合物，用SDS-PAGE分析该组合物的质量合格后，再加入抗体稳定剂，制成传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗，4℃存放，备用。

所述的传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗，其特征在于，IBDV单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C201322的杂交瘤细胞C128株（申请号 201310085194.5；分泌高中和活性传染性法氏囊病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞公开号CN103232974A；公开日： 2013.08.07）制备而成的。

所述传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗可以在预防和治疗传染性法氏囊病中得到应用。

 

有益效果  本发明的特点和优点如下：

本发明针对IBD流行现状和防治中存在的主要问题，采用了新的技术路线和生产工艺：

①选择当前流行的IBDV强毒株VP2基因。

②病毒样颗粒不含病毒DNA，无感染性，免疫原性强，可刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫；稳定性好，不易失活。利用杆状病毒表达系统具有与高等细胞类似的翻译后修饰系统，可使外源基因表达产物具有天然的活性形式以及表达产物可自组装成病毒样颗粒（VLP）的优点，制备病毒样颗粒重组VP2蛋白。

③卵黄抗体或免疫血清是采用免疫动物方法制备的，不仅质量不稳定，而且也难以进行规范化生产，此外，因多种病原可以经卵垂直传播或血液水平传播，存在着严重的生物安全风险。利用单克隆抗体具有特异性强、效价高、易于工业化生产、便于质量控制等优点，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备高中和活性的抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体。

④将特异性的传染性法氏囊病病毒样颗粒重组VP2蛋白与高效价中和活性单克隆抗体采用特定的工艺制成传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗，这种新型疫苗具有通过Fc受体与抗原提呈细胞（APC）结合、增强APC的提呈能力、促进APC细胞分泌细胞因子、抗原-抗体复合物的交叉递呈能力以及激活补体的能力，这些功能的协同作用，使得组合疫苗能够更快地激发机体产生对IBDV的免疫应答（包括细胞免疫应答和体液免疫应答），因此，组合疫苗比单独使用疫苗和/或抗体效果更好，对传染性法氏囊病具有预防和治疗双重功效，使用方便，具有巨大的生产及应用价值。

本发明试验结果表明：

治疗试验：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗对IBDV感染鸡具有良好的治疗效果（治愈率100%）优于单独使用mAb的治疗效果（治愈率65%），而氢氧化铝胶-VP2则没有治疗效果（感染鸡存活率15%）。

预防试验：在7d内，氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗在鸡体内已经对IBD产生了良好的免疫保护效果（攻毒存活率100%），而常规弱毒疫苗组和氢氧化铝胶-VP2组还没有产生免疫保护效果（攻毒存活率15%），mAb组由于体内含有单克隆抗体对IBDV还保持有一定的抵抗力（攻毒存活率40%）。

综合分析以上实验结果，组合疫苗对IBD具有预防和治疗双重功能，比单独使用疫苗和/或抗体效果更好，使用方便。

 

四、附图说明

图1含有VP2基因的重组供体质粒pFastBacHTA-VP2的结构

图2感染vBac-VP2的Sf9细胞电镜检查结果

五、具体实施方式

1 实验材料

1.1 病毒、质粒、菌种与细胞

IBDV强毒株系本实验室分离保藏 [公知公用，登录号GenBank: JX682709.1]。 IBD弱毒疫苗（B87株，购自南京天邦生物科技有限公司）。重组杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA、含有Bacmid和Helper plasmid的E.coli DH10Bac、Sf9昆虫细胞、E.coli TOP10均购自Invitrogen公司。

1.2 主要试剂

鸡抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗（B87）免疫SPF鸡（5次）获得，用DEAE纤维素（DE32）纯化（刘玉斌，苟仕金 主编. 动物免疫学实验技术. 长春：吉林科学技术出版社，1989，8-15）；

兔抗鸡IgG抗体和HRP标记的兔抗鸡IgG抗体参照文献制备（刘玉斌，苟仕金 主编. 动物免疫学实验技术. 长春：吉林科学技术出版社，1989，150-151；王永山，郝崇，侯世宽，刘子，马从林，殷震. 抗鸡IgG单克隆抗体的研究. 兽医大学学报, 1989, 9(2):109-114）。

克隆载体pUCm-T、MiniBEST质粒纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、X-gal、IPTG均购自TaKaRa公司；BAC/PAC DNA Isolation kit购自OMEGA公司；Lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s昆虫细胞培养基购自GIBCO公司。FITC标记的羊抗兔IgG抗体、DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。

2 实验方法

2.1传染性法氏囊病病毒样颗粒重组VP2蛋白的制备

IBDV强毒株VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，是通过构建重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2，用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞获得的重组杆状病毒vBac-VP2表达获得的。

其重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2和重组杆状病毒vBac-VP2，其构建方法为：以IBDV强毒株的基因组RNA为模板，用RT-PCR方法扩增VP2基因（登录号GenBank: JX682709.1）：

VP2基因扩增引物：

正向VP2F(36): 5’-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3’；

反向VP2R(34) : ’-AAGCTTCTATTAAACAGCTATCCTCCTTAGGGCCCGAAT-3’

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火60s（每一个循环增加0.2℃）、72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸10min。反应体系为50μL。

用1%的琼脂糖凝胶电泳回收VP2基因，pUCm-T载体克隆，构建含有VP2基因的克隆质粒pUC-VP2，将pUC-VP2和供体质粒pFastBacHTA分别用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳，分别回收VP2和载体DNA片段，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上（含氨苄青霉素100 μg/mL），37℃培养14 h。挑单菌落接种入LB（含氨苄青霉素100μg/mL），振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得含VP2基因的重组供体质粒pFastBacHTA-VP2（图1）。

转化含有Bacmid和Helper plasmid的E.coli DH10Bac感受态，用VP2基因正向扩增引物VP2F(36)和M13 R(17)引物下游序列PCR鉴定Bacmid DNA（重组杆状病毒表达质粒鉴定引物M13F(17)：上游序列: 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’ ；下游序列: 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’），可得一条大小为2100bp的条带，获得含VP2基因的重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2，用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac-VP2。

用重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9昆虫细胞培养物，冻融三次，用SDS-PAGE、Western-blotting和间接免疫荧光试验分析重组VP2蛋白的特异性，用IBDV抗体夹心ELISA检测重组VP2蛋白的效价（含量），ELISA效价≧1600。用电镜负染技术制片观察，可发现病毒样颗粒，直径约60 nm（图2）。

2.2传染性法氏囊病病毒高效价中和活性单克隆抗体（mAb）的制备

IBDV单克隆抗体（mAb）是由保藏编号为CCTCC NO：C201322的杂交瘤细胞C128株（申请号 201310085194.5；分泌高中和活性传染性法氏囊病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞公开号CN103232974A；公开日： 2013.08.07）制备而成的。细胞培养上清液对IBDV的中和效价分别≧2¹¹，腹水抗体的中和效价≧10⁷。

2.3 传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗的制备

将2体积的10%硫酸铝钾溶液与1体积1mol/L的碳酸氢钠溶液震荡混合（1ml的NaHCO₃加 2ml的Al₂(SO₄)₃.K₂SO₄.24H₂O可以产生约340 mg的湿氢氧化铝胶沉淀物），取沉淀物，加入1体积含IBDV病毒样颗粒重组VP2蛋白（ELISA效价≧1600）饱和PBS缓冲液（100 mg 的湿氢氧化铝胶沉淀物可以吸附约130 ug 的重组VP2蛋白），4℃感作12 h，再加入1体积的IBDV单克隆抗体（mAb）（中和效价≧2¹¹），4℃感作12 h，获得氢氧化铝胶-VP2-mAb组合物。用SDS-PAGE分析该组合物的质量合格后，再加入适宜的抗体稳定剂，制成传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗，4℃存放，备用。

2.4 传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合疫苗的预防治疗试验

IBD治疗试验（IBDV感染治疗试验）：

将80只30日龄SPF鸡随机分成四组，20只/组：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗组【IBDV感染鸡，肌肉注射氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗，剂量为1ml/kg】、氢氧化铝胶-VP2组【IBDV感染鸡，肌肉注射氢氧化铝胶-VP2，剂量为1ml/kg】、mAb组【IBDV感染鸡，肌肉注射mAb，剂量为1ml/kg，中和效价≧2¹¹】、对照组【IBDV感染鸡，肌肉注射氢氧化铝胶，剂量为1ml/kg】。试验在隔离器中进行。

先用感染发病剂量的IBDV强毒株经粘膜途径感染试验鸡，12h后，按照以上试验分组对感染鸡分别进行治疗。每日观察试验鸡的临床表现，对病死鸡及时进行病理组织学检查，分析氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗对IBDV感染鸡的治疗效果。

IBDV感染治疗试验的结果为：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗组的治愈率为100%（20/20）； mAb组的治愈率为65%（13/20）；氢氧化铝胶-VP2没有治疗效果，存活率15%（3/20）；对照组的存活率15%（3/20）。

病死鸡的病理学与组织学检查呈现典型IBD的病理特征，法氏囊水肿出血，胸、腿肌肉可见条带状出血，法氏囊间质充血水肿，淋巴滤泡皮质与髓质淋巴细胞严重坏死，有的髓质坏死溶解，髓质与皮质交界处未分化的上皮细胞增生，密集排列成层（坏死性法氏囊炎）。

本试验结果表明：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗对IBDV感染鸡具有良好的治疗效果（治愈率100%）优于单独使用mAb的治疗效果（治愈率65%），而氢氧化铝胶-VP2则没有治疗效果（感染鸡存活率15%）。

IBD预防试验（免疫攻毒试验）：

将100只30日龄SPF鸡随机分成五组，20只/组：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗组【肌肉注射氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗，剂量为1ml/kg】、氢氧化铝胶-VP2组【肌肉注射氢氧化铝胶-VP2，剂量为1ml/kg】、mAb组【肌肉注射mAb，剂量为1ml/kg，中和效价≧2¹¹】、常规弱毒疫苗组【IBD弱毒疫苗，按照说明书使用】、对照组【肌肉注射氢氧化铝胶，剂量为1ml/kg】。试验在隔离器中进行。

先按照以上试验分组对实验鸡分别进行免疫/注射，7 d后，用感染发病剂量的IBDV强毒株经粘膜途径感染试验鸡。再每日观察试验鸡的临床表现，对病死鸡及时进行病理组织学检查，分析氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗对IBD的预防效果。

免疫攻毒试验的结果为：氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗组的攻毒存活率为100%（20/20）；氢氧化铝胶-VP2组的攻毒存活率15%（3/20）；mAb组的攻毒存活率为40%（8/20）；常规弱毒疫苗组的攻毒存活率15%（3/20）；对照组的攻毒存活率15%（3/20）。

病死鸡的病理学与组织学检查呈现典型IBD的病理特征，法氏囊水肿出血，胸、腿肌肉可见条带状出血，法氏囊间质充血水肿，淋巴滤泡皮质与髓质淋巴细胞严重坏死，有的髓质坏死溶解，髓质与皮质交界处未分化的上皮细胞增生，密集排列成层（坏死性法氏囊炎）。

本试验结果表明：在7d内，氢氧化铝胶-VP2-mAb组合疫苗在鸡体内已经对IBD产生了良好的免疫保护效果（攻毒存活率100%），而常规弱毒疫苗组和氢氧化铝胶-VP2组还没有产生免疫保护效果（攻毒存活率15%），mAb组由于体内含有单克隆抗体对IBDV还保持有一定的抵抗力（攻毒存活率40%）。

综合分析以上实验结果，组合疫苗对IBD具有预防和治疗双重功能，比单独使用疫苗和/或抗体效果更好，使用方便。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  传染性法氏囊病病毒样颗粒与单克隆抗体组合双功能疫苗

 

 

<130>  0

 

 

<160>  4    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向VP2F(36)

<222>  (1)..(32)

<223> 

 

 

 

<400>  1

cggaattcat gacaaacctg caagatcaaa cc                                   32

 

 

<210>  2

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向VP2F(36)

<222>  (1)..(39)

<223> 

 

 

 

<400>  2

aagcttctat taaacagcta tcctccttag ggcccgaat                            39

 

 

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  M13F(17)上游序列

<222>  (1)..(17)

<223> 

 

 

 

<400>  3

gttttcccag tcacgac                                                    17

 

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  M13F(17)下游序列

<222>  (1)..(17)

<223> 

 

 

 

<400>  4

caggaaacag ctatgac                                                    17