公开/公告号CN103289938A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-09-11
原文格式PDF
申请/专利权人 河北圣雪大成制药有限责任公司;
申请/专利号CN201310242675.2
申请日2013-06-19
分类号C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/545;
代理机构石家庄国域专利商标事务所有限公司;
代理人白海静
地址 051430 河北省石家庄市栾城县圣雪路50号
入库时间 2024-02-19 20:12:27
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-11-05
授权
授权
2013-10-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/20 申请日:20130619
实质审查的生效
2013-09-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株及其筛选方法,具体地说是一种链霉素高产菌株及其制备方法。
背景技术
链霉素是瓦克斯曼(Waksman S1A1)于1944年发现的第一个氨基糖苷类抗生素,它对结核杆菌有强大的抗菌作用,同时对许多革兰氏阴性菌(G-)如大肠杆菌、肺炎杆菌、肠杆菌属、沙门菌属、布鲁菌属等也具有一定的抗菌作用。目前用于链霉素发酵的菌株主要为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、比基尼链霉菌等。灰色链霉菌,其外表颜色如名所述呈灰色,孢子梗直而短,单菌落生长丰满,呈梅花型或馒头型,直径为3-4 mm,基质菌丝透明,在斜面背后产生淡褐色色素。目前筛选出的、用于链霉素发酵的灰色链霉菌株,其生产能力较低。因此如何提高链霉素菌株的发酵能力,进而提高链霉素产量,降低生产成本,一直本领域科研人员研究的重点课题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉素的高产菌株,同时提供一种该菌株的筛选方法,以期提高链霉素的产量,解决链霉素在生产过程中菌种生产能力较低的问题。
为实现本发明的目的,本发明提供了一种链霉素高产菌株,其名称为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.6219,保藏日期为2012年06月14日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的DC622菌株其微生物学特征如下:
该菌株的菌落为白色,近似梅花状,菌落中心凹陷。
本发明所提供的链霉素高产菌株DC622的筛选方法,包括以下步骤:
a、取链霉素出发菌株接种于斜面培养基中,在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%的条件下培养5-8天,挑选斜面培养基上的孢子,加入生理盐水,制成孢子浓度为107-109个/mL的孢子悬浮液;
b、使用微波对孢子悬浮液进行处理,然后再对其进行紫外光照射120秒,避光培养30 分钟,得到诱变孢子液;
c、将诱变孢子液接种到钒酸钠浓度为0.3-0.7 mg/mL的液体培养基中,在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下,180 rpm震荡培养15-28 h,分离后得到分离菌株,将分离菌株接种到钒酸钠浓度为0.5-1.0 mg/mL的固体双碟培养基上,在温度27.0±1.0℃,相对湿度30%-60%条件下培养2-3天,得到耐高磷菌株,再将耐高磷菌株转接到含硫氨基酸浓度为0.03-0.07 mg/mL的固体双碟培养基上,在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下培养5天,得到成熟的单菌落。
d、将单菌落转接到斜面培养基上,在温度27.0±1.0℃,自然湿度条件下培养5-7天得到成熟的斜面孢子,使用液氮保存成熟孢子;
e、将保存的成熟孢子转接到液体培养基中,在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%~60%的条件下,180 rpm震荡培养8-10天,筛选出发酵产率高的菌株进行保藏即获得灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622。
本发明步骤b中所述微波处理,其频率为300MHz,微波处理时间30-50 s,所述紫外光的波长为257.3nm,紫外灯的功率为15W,紫外处理时间100-140 s。
本发明步骤c步中所述的含硫氨基酸为蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸中的任意一种。
本发明方法中所述的斜面培养基和固体双碟培养基,按质量份数计,其成分为:酵母膏100-150份,葡萄糖100-120份,磷酸氢二钾5-8份,硫酸镁5-8份,琼脂200-250份;用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至6.7±0.1;
本发明所述液体培养基,按质量体积比计算,其成分为:酵母膏6.0-8.0%,葡萄糖6.0-8.0%,磷酸二氢钾0.8-1.2%,硫酸镁 0.05-0.08%,其余为水;用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至7.0±0.1。
本发明提供的DC622菌株是一种链霉素高产菌株。该菌株的发酵产量比普通菌株的产量高出30%-50%,该菌株发酵水平为:摇瓶培养8天时检测链霉素效价,其平均效价为14908 U/mL。
附图说明:
图1:本发明菌株的固体双碟菌落形态图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。
若未特别说明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:DC622菌株的筛选
1.培养基的准备
(1) 斜面培养基、固体双碟培养基配方、制备方法相同,即按质量份数计,其成分为:酵母膏130g,葡萄糖100g,磷酸氢二钾7g,硫酸镁6g,琼脂230g;用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至6.7±0.1,在0.11±0.01MPa、121℃±1℃下,消毒20 min,冷却到室温待用。
(2) 液体培养基,按质量体积比计算,其成分为:酵母膏70.0g,葡萄糖80.0g,磷酸二氢钾10.0g,硫酸镁 0.6g,加水定容至1000ml;用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至7.0±0.1;在0.11±0.01MPa、121℃±1℃下,消毒20 min,冷却到室温待用。
(3) 含钒酸钠固体双碟培养基配方:在固体双碟培养基中加入钒酸钠,使培养基中钒酸钠的含量达到0.5 mg/mL;
(4) 含钒酸钠的液体培养基配方:在液体培养基中加入钒酸钠,使培养基中钒酸钠的含量达到0.7 mg/mL;
(5) 含蛋氨酸的固体双碟培养基配方:在固体双碟培养基中加入蛋氨酸,使培养基中蛋氨酸的含量达到0.05 mg/mL。
2.原始菌株孢子液获得
出发菌株为灰色链霉菌(编号为4.1095,购自中国科学院微生物研究所)。取出4.1095菌株砂土管,无菌条件下用接种针蘸取少量孢子接种于斜面培养基上,在27.0±1.0℃,相对湿度30%-60%的条件下培养8天,挑选成熟的斜面孢子加入到10 mL生理盐水中,制备孢子悬浮液,悬浮液中孢子浓度约为108个/mL。
3.孢子液诱变
采用微波诱变和紫外诱变交替的方法进行诱变,先使用微波(频率300MHz)对孢子液诱变40 s,然后再使用紫外光(波长257.3nm,紫外灯功率15W)对其诱变120 s,避光培养30 min,得到诱变后的孢子液。
4.高产菌株筛选
将诱变后的孢子液按3%的接种量接入钒酸钠浓度为0.7 mg/mL的液体培养基中,在温度27.0±1.0℃,相对湿度30%-60%的条件下,180 rpm震荡培养20 h,将液体培养基进行分离,得到的菌落接种于钒酸钠浓度为0.5 mg/mL的固体双碟培养基上,在温度27.0±1.0℃,相对湿度30%-60%条件下培养3天,然后将固体双碟上的单菌落转接到蛋氨酸浓度为0.05 mg/mL的固体双碟上,在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下培养5天,得到成熟的单菌落。
挑选上述单菌落(如图1所示,其白色,近似梅花状,中心凹陷。)接种到固体斜面培养基上,在温度27.0±1.0℃,相对湿度30%~60%的条件下培养5天后得到成熟的斜面孢子,使用液氮保存成熟孢子。
将保存的孢子以及出发菌株的孢子,按3%接种量分别接种到数个相同的液体培养基(即分为若干个组,如表1中的A1-A5组及对照组)中,培养条件为温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%,180 rpm震荡培养8天。培养结束后,用高效液相色谱测定各组中(A1-A5)链霉素的效价(检测结果见表1)。选择平均效价的最高(14908 U/ml)组所对应的菌株,命名为DC622菌株,同时进行保藏,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.6219,保藏日期为2012年06月14日。
表1 效价检测结果
从表1可见,本发明所筛选出的DC622菌株,其发酵产率高。
机译: 一种链霉素,链霉素的盐,二氢链霉素的盐和二氢链霉素的盐不可逆脱色的方法
机译: 一种水中schwerloeslichen链霉素的制备方法-与protahierter链霉素的作用有关
机译: 一种制备二氢吡啶脱氧链霉素或二氢链霉素的结晶一元盐的方法