一种应用于第二代测序的简捷廉价的基因组样品破碎方法

摘要

本发明提供了一种高效、快速、廉价、简捷的样品破碎方法，成功的建立了运用该方法进行高通量测序文库的建库流程，并应用于Hiseq2000测序，可以应用于denovo测序、重测序、外显子捕获或其他任何高通量测序文库构建。

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序建库领域，尤其基因组DNA样品破碎的方法及其运用。

背景技术

高通量测序技术中的数据质量控制是测序过程中的重要环节，样本文库的质量则是获取 高质量的测序数据的前提和基础。获得适当大小的DNA片段是测序前样本文库制备的必要 步骤。如果片段太长，会导致数据整理分析时拼接的困难；如果片段太短，会导致数据量的 降低、浪费以及增加测序成本。核酸片段化的技术主要分为3大类：一类是化学法，主要应用 于mRNA的样本制备过程；一类是酶切法，主要应用于数字基因表达谱的样本制备过程；一 类是物理法，主要应用于DNA的样本制备过程，物理法中应用最多是使用超声波破碎仪破 碎样本。

超声波破碎仪的种类和型号都很多，为满足高通量测序样本文库构建的基本要求，选择 仪器时要关注：(1)样本之间不能有任何交叉污染的可能，高通测序是灵敏的测试，只要有 任何其他DNA在其中都会被当作测序对象进行测序，会造成测序数据的污染和不可信；(2) 需要的样本量较少，一些临床样本，稀有动植物的样本，或残存物质中不可再获得的样本都 是十分珍贵的，基因组DNA的提取量都不是很高，基本是微克级别，所以有些需要大量样本 才能操作的仪器，在高通量测序文库构建中是不建议使用的；(3)可重复性要高，高通量测 序的一个特点就是平行处理多个样本，如果破碎条件不稳定，那么意味着各个样本的可比性、 重复性和稳定性很差，会造成实验不可重复。基于以上3条基本原则，目前用于高通量测序样 本破碎的超声波破碎仪主要有：非接触式全自动超声破碎仪Bioruptor和和自动聚焦声波样本 处理仪CovarisS220。CovarisS220可以在较短的时间里获得比较理想的片段，重复性很好，操 作简单，就高通量测序方向上的应用来说，CovarisS220有很大优势。但是仪器和耗材比较昂 贵，而且这台仪器占实验台的面积比较大，还需另配电脑配合操作；Bioruptor仪器价格相对 低廉，没有特殊耗材，所占面积有限，不需电脑操作，在摸索好仪器的使用规律的前提下， 可以得到理想片段，但是操作相对繁琐。

因此，本发明将提供应用另外一种超声破碎仪对基因组DNA样品进行破碎的方法，即满 足廉价要求，又可以操作简捷。大大节省样品破碎的时间和操作复杂度，还可以满足不同长 度插入片段大小的文库样本需求。

发明内容

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种简捷廉价的可以应用于第二代测序建库的样 品破碎方法及其运用流程。

本发明一个目的是提供一种简捷廉价的可以用于第二代测序样品破碎的方法。

本发明提供的可以用于基因组DNA样品破碎的超声设备为普通超声波清洗器，型号为 KQ-50E，制造商为江苏昆山舒美，价格为800元人民币。使用该设备可以实现快速简捷的进 行DNA样品破碎，不需要其他任何昂贵的仪器和耗材。

本发明提供的可以用于第二代测序样品破碎的方法为利用所述的超声波清洗器进行 DNA样品破碎。

所述的DNA样品可以是来自于动物的DNA、或是植物的、或是其他任何微生物或非生 物来源的DNA样品。

所述的样品包括DNA样品，但是不仅限于DNA样品，也可以使RNA样品或其他任何 核酸样品。

所述的快速简捷的进行DNA样品破碎的方法主要包括以下步骤：

1)打开该超声破碎仪的盖子；

2)添加冰水混合物至水深为4.5cm；

3)在1.5ml离心管中加入需要破碎的样品；

4)加入的样品的体积范围为20～200ul；

5)加入的样品的质量范围为10～10000ng；

6)将含有待破碎样本的离心管使用一个浮漂将其置于超声波清洗器的中央位置；

7)打开仪器开关，根据所需要样品破碎的大小，将时间设定为90s(500bp的插入片 段)，或120s(300bp的插入片段)或360s(180bp的插入片段)；

8)将温度设定调至0；

9)盖上盖子运行超声清洗仪器；

10)运行结束，取出离心管，直接进行下一步建库的操作，不需要进行样品的纯化。

本发明的第二个目的是提供一种运用上述破碎方法对DNA样品进行建库并进行高通量 测序流程，包括如下步骤：

1)将所待测样品基因组DNA用如前所述的超声波清洗器进行破碎；

2)对步骤1)得到的破碎产物进行末端补平，加dATP，并进行接头的连接；

3)对步骤2)得到的连接产物进行纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化后， 在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；

4)对获得的数据进行信息分析。

其中，步骤2)中，所述的末端补平体系为使用NEB公司的Quick Blunting kit进行； 所述的加dATP的体系包括：dATP，10*NEB Buffer2，加dATP的聚合酶，所述的dATP的 浓度为5mM，所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为0.05U/ul；所述的接头的连接体 系包括：接头(来自于Illumina Truseq)，ATP、连接酶，所述的接头的浓度为10uM，所述 的ATP的浓度为1mM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5U/ul；

其中，步骤3)中，所述的PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤3)中得到 的连接产物。所述的引物的浓度为0.2uM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50％ 的体积。

所述的基因组DNA为任何单倍体或多倍体材料的DNA，包括动物、植物、微生物等， 也可以是任何非生物来源的DNA样品。

本发明的实验证明，本发明提供的廉价简捷的样品破碎方法，能够将DNA样品破碎至 所需的大小，运用本发明的样品破碎和建库方法，成功的构建了不同插入片段大小的DNA 文库，并成功的运用在Illumina公司的Hiseq2000的测序平台进行测序。

本发明提供了一种便捷，高效，快速的DNA样品的破碎方法，在高通量测序建库领域 有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为使用超声清洗器进行样品DNA破碎结果的电泳图；

图2为使用2100检测180bp插入片段的文库结果图；

图3为使用2100检测300bp插入片段的文库结果图；

图4为使用2100检测500bp插入片段的文库结果图；

图5为180bp插入片段文库的GC或AT分离度和GC含量信息质控结果图；

图6为300bp插入片段文库的GC或AT分离度和GC含量信息质控结果图；

图7为500bp插入片段文库的GC或AT分离度和GC含量信息质控结果图；

图8为180bp插入片段文库的insertsize的信息质控结果图；

图9为300bp插入片段文库的insertsize的信息质控结果图；

图10为500bp插入片段文库的insertsize的信息质控结果图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用接头序列来自于Illumina  Truseq。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品，所用水均为超纯水。

实施例：利用超声清洗器进行DNA的破碎和文库构建。

1、基因组DNA的破碎

1)样品浓度测定

使用Qubit(美国)对样品DNA浓度测定，进行精准定量，并使用0.8％琼脂糖凝胶， 120v电压，电泳1小时，检测样品质量，确保基因组DNA样品完整无降解。

2)以步骤1)检测的基因组DNA100ng～1ug为模板进行样品破碎。样品的体系和破碎条 件如下：样品DNA(150～250ng/μl)0.1-1μg，补加H₂O至总体积为50μl，将上述混合液在 超声清洗器中破碎分别90s，150s，360s，分别用于构建插入大小为180，300和500bp大小的 文库。取出20ul进行电泳检测，结果表明，破碎充分，得到均匀弥散的条带，如附图1所示。

2、破碎产物的补平，加dATP

1)将步骤1中得到的破碎产物进行末端补平，反应体系和反应条件如下：破碎产物DNA 30μl，10×Blunting Buffer5μl，1mM dNTP10μl，Quick Blunting kit Enzyme Mix，1μl，加 H₂O9μl，总体系50μl；反应条件：30℃孵育30min。

2)对步骤1)的补平产物进行纯化：将上述产物进行磁珠纯化回收。整个回收过程按 照AMPure XP Beads纯化回收操作说明书进行。

3)对步骤2)中的纯化产物进行加dATP，反应体系和条件如下：步骤2)中的补平回收 产物，22μl，100mM dATP1μl，10×NEB Buffer23μl，Klenow exo^-(NEB)(50，000units/ml) 0.3μl，H₂O5.5μl，总体积30μl；反应条件：充分混匀，37℃孵育30min，75℃20min热 失活。

3、接头的连接

1)将步骤2的连接产物，加入接头，反应体系和条件具体如下：连接产物30μl，NEB Buffer 22μl，10uM接头2.5μl，(1000u)T4DNA Ligase0.5μl，加H₂O15μl，总体积50μl，室 温(或16℃)下连接2小时，连接产物65℃20min，连接酶活性失活。

2)将步骤1)中的连接产物等体积AMPure XP Beads纯化1次，纯化过程严格按照使用 说明书进行。

3)将步骤2)中的回收产物进行Qubit定量，用于下一步PCR反应。

4、PCR扩增目的片段

1)将步骤3中回收的产物，精准定量10ng用于PCR反应，得到的PCR产物，即为所 构建的文库。反应体系和条件如下：DNA样品3μl，PCR Primer11μl，PCR Primer21μl， 2×Phusion PCR Master Mix25μl，H₂O20μl，总共50μl，反应条件为：先98℃预变性1min； 然后98℃10s，60℃30s，72℃30s，共10个循环；最后72℃延伸5min。Primer1的序列 为5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’；Primer2的序列为 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。

2)将步骤1)中的PCR产物等体积AMPμre XP Beads纯化两次。纯化过程严格按照使用 说明书进行。

3)将步骤2)中的纯化产物进行Qμbit精准定量。

5、文库库检和上机

1)将步骤4中所得的纯化产物稀释到1ng/ul，取出1ul用于Agilent2100(美国Agilent公司) 检测，检测结果如附图2、3和4所示。另外再取1ul用于QPCR(Biorad公司)检测，根据检测 结果，决定上机浓度。

2)根据步骤1)所得的浓度，将文库稀释到上机要求后，在Illumina公司的Hiseq2000测 序平台进行测序。

6、上机结果质控

1)对所建文库的进行GC分离度和GC含量进行评估，结果显示无GC或AT分离，含量无 偏离；如附图5、6和7所示。

2)对所建文库的插入片段大小进行评估，结果表明在预期的文库插入片段处均有明显的 主峰；如附图8、9和10所示。

3)对所建文库的覆盖度均一性进行评估，结果显示覆盖均一，随机性较好，无偏好性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。