一种奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法

摘要

本发明公开了一种奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，奶粉富含蛋白、脂肪、糖类等成分，直接用乙酸乙酯提取测定具有亲脂性氯霉素会产生有严重的乳化现象，造成无法提取，本方法采用氯化钠溶液溶解样品，加入乙腈沉淀蛋白质，再用乙酸乙酯提取，提取液氮气吹干后，用乙腈水溶液复溶，加正己烷净化去脂，LC-MS/MS测定，内标法定量。本方法操作步骤简单，提取效率高，净化技术合理、成本低、效果好，方法检出限为0.1μg/kg，达到国际国内其它样品氯霉素残留量检测方法先进水平。

说明书

技术领域

本发明属于超痕量化学分析领域，尤其涉及复杂成分的奶粉样品中氯霉素 残留量的液相色谱-串联质谱技术的测定方法。

背景技术

氯霉素是广谱型抗生素之一，过去常用于动物各种传染性疾病的治疗。氯 霉素具有严重的毒副作用，在动物组织中的残留不仅对动物和人体有直接危害， 而且会诱发致病菌的耐药性，对人类的健康构成巨大的威胁。

目前氯霉素残留量检测标准较多，主要集中在水产品等动物源性食品方面， 经检索暂未查到奶粉中氯霉素的检测标准，只有少量报道牛奶中氯霉素残留检 测方法，如Chloramphenicol-Confirmation of Chloramphenicol in Meat，Milk，Eggs  and Urine by Gas Chromatography-Mass Spectrametry(EEC Cy3.5 Confirming  Method)，适用于牛奶的检测，方法需复杂衍生化过程，方法存在操作困难且 检出限高等缺点。目前对于富含蛋白、脂肪、糖类等成分的奶粉样品氯霉素检 测无适用的标准方法，而现行常用氯霉素残留检测技术用亲脂性溶剂乙酸乙酯 提取奶粉样品会出现严重的乳化现象，无法提取分离；而用乙腈提取时渗透性 不强，提取时奶粉样品结块，提取溶剂无法渗透样品；奶粉样品的复杂成分同 时也会造成严重的离子抑制和基质效应。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联 质谱测定方法，旨在解决存在目前奶粉样品中氯霉素残留量无适用检测方法和 成分复杂的奶粉样品提取和净化技术的问题，提供了一种适合奶粉中氯霉素残 留量的简单易操作的提取、净化、仪器测定步骤，且仪器条件充分的检测方法。

本发明实施例是这样实现的，一种奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质 谱测定方法，该方法包括：

在奶粉中添加氯霉素同位素内标物氘代氯霉素溶液后，10％氯化钠溶液溶解 样品，加入乙腈沉淀蛋白质，再用4.5％氨化乙酸乙酯萃取，萃取液氮气流吹干 后，用乙腈水溶液复溶，正己烷净化两次，定溶液过滤膜得上样液，上样液进 行LC-MS/MS测定。

进一步，LC-MS/MS测定液相色谱分离条件：采用WatersC₁₈ 150mm×2.0 mm(i.d.)3μm色谱柱，甲醇+水(60+40)流动相等度洗脱。

进一步，所述上样液的具体制备方法包括以下步骤：

加入氯化钠溶液涡旋混匀，加入乙腈涡旋混匀，加入氨化乙酸乙酯振荡提 取，离心分离，萃取液氮气吹干，定容液复，正己烷净化，得到上样液。

进一步，LC-MS/MS测定液相质谱测定条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)； 采用负离子扫描方式，多级反应监测方式(MRM)；雾化气为氮气，55psi；气帘 气为氮气，20psi；辅助加热气为氮气，60psi；温度为550℃；电离电压为-4500V； 氯霉素监测母离子为321.0，子离子为152.1(定量)，去簇电压：-70V；碰撞 电压：-25V；257.1(定性)去簇电压：-70V；碰撞电压：-25V；氯霉素同位素 内标监测母离子326.2，子离子157.2去簇电压：-70V；碰撞电压：-26V。

本发明提供的奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，首先解 决了提取奶粉中氯霉素时发生严重乳化的问题，用氯化钠溶液溶解样品，氯霉 素能有效从样品中释放至溶液体系中，加入乙腈沉淀蛋白质后，再用乙酸乙酯 萃取能避免乳化现象的发生，萃取溶剂采用碱性乙酸乙酯，能有效提高提取效 率，萃取液经氮气流吹干后，用乙腈水溶液复溶，再加入正己烷净化，能有效 将共萃取物中油脂和亲脂组分去除。本方法采用LC-MS/MS测定，同位素内标 法定量，能有效降低基质效应的影响，氯霉素测定为0.1μg/kg。本方法针对富 含蛋白、脂肪、糖类等复杂成分的奶粉样品中氯霉素检测方法技术路线设计科 学合理，方法操作步骤简单，仪器条件充分合理，方法测定低限达到超过氯霉 素同类方法的水平，方法的特异性、灵敏度、准确度和重现性都符合相关质量 控制规范的要求。

附图说明

图1是本发明实施例提供的奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测 定方法流程图；

图2是本发明实施例提供的上样液制备流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1示出了本发明实施案例提供的一种奶粉中氯霉素残留量的液相色谱- 串联质谱测定方法，该方法包括：

在步骤S101中，对样品提取、浓缩、净化得到上样液；

在步骤S102中，取上样液进行LC-MS/MS测定，选择合适的液相和质谱条 件：

LC-MS/MS测定液相色谱分离条件：采用WatersC₁₈ 150mm×2.0mm(i.d.)3 μm色谱柱，甲醇+水(60+40)流动相等度洗脱。

LC-MS/MS测定液相质谱测定条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；采用负 离子扫描方式，多级反应监测方式(MRM)；雾化气为氮气，55psi；气帘气为氮 气，20psi；辅助加热气为氮气，60psi；温度为550℃；电离电压为-4500V； 氯霉素监测母离子为321.0，子离子为152.1(定量)，去簇电压：-70V；碰撞 电压：-25V；257.1(定性)去簇电压：-70V；碰撞电压：-25V；氯霉素同位素 内标监测母离子326.2，子离子157.2去簇电压：-70V；碰撞电压：-26V。

图2示出了本发明实施案例提供的上样液制取方法，该方法包括：

在步骤S1011中，提取样品；

称取1.0g奶粉样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入氘代氯霉素内标 物，加入5mL氯化钠溶液涡动30s，再加5mL乙腈涡动30s，加入10mL4.5％ 氨化乙酸乙酯，剧烈振荡提取10min，以4500r/min离心5min，上层清液 转移至50mL离心管中。残渣再加入5mL乙腈和10mL4.5％氨化乙酸乙酯现提 提取一次。

在步骤S1012中，提取液浓缩；

合并两次萃取液上层清液于同一离心管中，于45℃下氮气流吹至干。

在步骤S1013中，净化；

用1mL乙腈水溶液(3∶7，V/V)超声溶解残渣，加入3mL正己烷涡旋混 合30s，以4500r/min离心5min，弃掉上层的正己烷，加入3mL正己烷重 复净化一次。下层溶液过0.22μm滤膜后得上样液。

上样液的具体制备方法可以概括为以下步骤：加入氯化钠溶液涡旋混匀， 加入乙腈涡旋混匀，加入氨化乙酸乙酯振荡提取，离心分离，萃取液氮气吹干， 定容液复，正己烷净化，得到上样液。

本发明实施例提供的奶粉中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法， 首先在奶粉中添加氘代氯霉素溶液后，氯化钠溶液溶解样品，加入乙腈沉淀蛋 白质，再用氨化乙酸乙酯萃取，萃取液经氮气流吹干后，用乙腈水溶液复溶， 加正己烷振荡混合，离心分层，弃去正己烷，下层溶液用滤膜过滤得到上样液； 取上样液进行LC-MS/MS测定，采用WatersC18 150mm×2.0mm(i.d.)3μm 色谱柱，甲醇水(60+40)作流动相等度洗脱；质谱条件的选取——扫描方式： 负离子扫描方式；离子源：电喷雾离子源；雾化气：氮气，55psi；气帘气：氮 气，20psi；辅助加热气：氮气，60psi，温度550℃；电离电压：-4500V；监 测方式：多级反应监测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。