黑木耳黑29单核菌株交配型基因片段29-611

摘要

黑木耳黑29单核菌株交配型基因片段29-611，涉及一种黑木耳单核菌株交配型基因片段。其目的是提供一种黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611。该基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的交配型基因片段“29-611”为黑木耳“黑29”单核菌株A1交配型所特有，可以为“黑29”单核菌株交配型的鉴定提供一个良好的参考指标，用于单核菌株鉴别;还可为黑木耳单核体育种提供理论基础，加快育种进程，缩短育种周期。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑木耳单核菌株交配型基因片段。 

背景技术

黑木耳子实体胶质，成圆盘形，耳形不规则形，直径3～12厘米。新鲜时软，干后成角质。口感细嫩，风味特殊，是一种营养丰富的著名食用菌。干黑木耳含糖类、蛋白质10.6克、脂肪0.2克、热量306焦、氨基酸、维生素和矿物质。有益气、充饥、轻身强智、止血止痛、补血活血等功效。富含多糖胶体，有良好的清滑作用，是矿山工人、纺织工人的重要保健食品。还具有一定的抗癌和治疗心血管疾病功能。 

黑木耳是异宗结合担子菌，交配型是异宗结合担子菌单核体天然的遗传标记，交配型基因控制着单核体之间营养体亲和性、核配和子实体正常发育，研究交配型因子的结构和作用机制是异宗结合担子菌遗传研究的重要内容。黑木耳作为我国特色而广泛栽培的食用菌，对其交配型因子的结构与功能研究少。 

发明内容

本发明提供一种黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611。 

本发明黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

黑木耳是单因子控制的二极性异宗结合的担子菌，单核菌株有两种不同的交配型A1和A2，具有相同交配型的单核个体相互排斥，而具有不同交配型的单核个体相互亲和，形成双核体。本发明的交配型基因片段“29-611”为黑木耳“黑29”单核菌株A1交配型所特有，可以为“黑29”单核菌株交配型的鉴定提供一个良好的参考指标，用于单核菌株鉴别；还可为黑木耳单核体育种提供理论基础，加快育种进程，缩短育种周期。 

附图说明

图1为具体实施方式一中“黑29”单核菌株荧光显微检测照片；图2为“黑29”双核菌株荧光显微检测照片；图3为另一张“黑29”双核菌株荧光显微检测照片；图4为“黑29”单核菌株酯酶同工酶检测结果；图5为采用ISSR-PCR扩增“黑29”双核菌株和单核菌株图谱。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 

具体实施方式一：本实施方式黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

本实施方式黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611的获得方法如下： 

一、确认“黑29”单核菌株交配型： 

1、原生质体制备及其再生获得单核菌株 

(1)将母种(为“黑29”双核菌株，由黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心提供)转接于洋葱培养基(OGF)，静止2天后，25℃，130r/min摇床培养3天。取新鲜5ml幼龄菌丝悬液，用无菌水冲洗2次，再用渗透压稳定剂冲洗2次。所述洋葱培养基(OGF)由200g/L洋葱、0.15g/L阿魏酸、20g/L葡萄糖、3g/L磷酸二氢钾、1.5g/L硫酸镁和蒸馏水组成。 

(2)4000r/min离心20min，倒掉上清液，用无菌滤纸吸干沉淀菌丝表面水分，加入1ml配制好的纤维素酶液，轻微振荡使菌丝全部散开，于30℃水浴保持4.5h。 

(3)酶解后的原生质体悬液用无菌的250目尼龙网过滤，收集滤液。 

(4)过滤后的滤液4000r/min离心20min，收集沉淀。 

(5)沉淀用稳渗剂悬浮并再次离心，所得沉淀便是黑木耳原生质体。 

(6)将制备的原生质体用无菌水分别稀释成10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍溶液，取0.1ml各稀释度的原生质体均匀涂布于再生平板，25℃培养5～7天，将萌发的异常弱菌落转接于cPDA试管进行培养，观察菌丝生长情况，挑选出与“黑29”双核菌株生长状态有差异的个体，作为疑似单核菌株，并转接于cPDA 20mm×200mm试管培养备用。 

2、显微荧光检测单核菌株的真实性 

将获得的疑似单核菌株取2×2mm²，接种于cPDA平板中央，距接种块0.2～0.5cm处斜插一无菌的盖玻片，置25℃培养，待菌丝爬至盖玻片的2/5处，取下盖玻片，用荧光染料染色显微镜检。 

染色方法为：先滴一滴荧光染料于一载玻片中央，从培养皿里取出附有菌丝体的盖玻片，用擦镜纸擦净盖玻片附有菌丝的另一面，然后用镊子将盖玻片附有菌丝的一面贴染色液轻轻盖上，染色3min，置荧光显微镜下观察菌丝内部核的分布情况，将核分布单一(未 两两一组分布的)、不规律、菌丝表面光滑的菌丝初步确定为单核菌株。“黑29”单核菌株荧光显微检测结果如图1所示，“黑29”双核菌株荧光显微检测结果如图2和图3所示，菌丝内细胞核两两成对分布，菌丝表面有凸起的索状联合即为双核菌丝。 

3、酯酶同工酶技术检测黑木耳单核菌株交配型 

将荧光检测确认为单核的菌株转接于cPDA培养基上长满作为母种备用。酯酶同工酶检测使用洋葱培养基。将用洋葱培养基静止培养15天的单核菌株样品过滤收集菌丝2～3g，用蒸馏水冲洗2～3次，加入0.1mol/LTBE缓冲液1～2滴，-20℃下冷冻16h。冰浴研磨成糊状，低温12000r/min离心30min，取上清为胞内酯酶同工酶样品，冷冻备用。所述cPDA培养基由200g/L马铃薯、20g/L葡萄糖、3g/L磷酸二氢钾、1.5g/L硫酸镁、0.5g/L蛋白胨、14g/L琼脂和蒸馏水组成。 

用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度7.5％、pH8.9；浓缩胶浓度2.5％、pH6.7；电极缓冲液Tris-Glycine系统，pH8.3；点样35μL，溴酚兰作指示剂，4℃下电泳。浓缩胶电压为120V，分离胶电压为220V，电泳4.0h左右，待指示剂距前沿线1.0cm时取下凝胶。用醋酸-α-萘酯和坚牢兰染色，直至酯酶同工酶谱带出现为止，鉴别不同交配型单核菌株(见图4)。1号泳道为“黑29”双核菌株；2、3、4、5、6泳道的5个单核菌株为一种交配型(A2)单核菌株；7、8泳道的2个单核菌株为另一种交配型(A1)单核菌株。 

二、采用ISSR-PCR技术获得黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611 

1、单核菌丝DNA提取 

使用TIANGEN公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取单核菌丝DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，提取的DNA大小在21kb左右。 

2、ISSR-PCR扩增反应条件及程序： 

ISSR-PCR扩增反应总体积25μL：其中包括1×buffer，0.1mmol/lMgCl₂，0.1mmol/LdNTP_S，15ng引物，15ng模板DNA，0.5U TaqDNA聚合酶。以无菌双蒸水代替模板DNA作阴性对照。 

引物序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGC，由大连宝生物合成。 

反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，52℃复性40s，72℃延伸70s，进行40个循坏，最后72℃延伸7min。PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Biotium公司的GelRed染色，凝胶成像扫描记录结果见图5。其中M为Marker(DL2000)，1、2、3泳道为“黑29”单核菌株交配型A1，4、5、6、7泳道为“黑29”单核菌株交配型A2，“611” 对应的DNA条带为与“黑29”单核菌株交配型A1共分离的DNA片段(29-611)。 

三、体外重组与转化 

将与“黑29”单核菌株交配型A1共分离的DNA片段(29-611)进行胶回收，得到的纯化产物，使用pDM19-T载体试剂盒(购买自大连宝生物公司)，将纯化产物与pDM19-T克隆载体连接。在无菌的0.2ml塑料离心管中加入pMD19-TSimple Vector 1μl，目的DNA片段溶液2μl，无菌双蒸水2μl，再加入等量的(5μl)的高效反应连接液(Ligation Mix)，16℃反应3h。50μl E.coli JM109感受态细胞悬浮液+5μl pDM19-T重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，转入42℃水浴1min，迅速转入冰上冷却2min。加入890μlSOC培养基，混匀，水浴恒温振荡器37℃、200rpm/min孵育1h。取8μl，500mM IPTG，40μl，20mg/ml X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30分钟，待IPTG，X-gal被吸收后，取100μL感受态菌培养液涂于含Amp的LB琼脂培养板上，37℃过夜培养。 

四、PCR方法鉴定阳性重组子 

挑取白色菌落接种于含60μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm/min水浴恒温振荡培养过夜。沸水煮15min，以其为模板，用引物(序列为AGAGAGAGAGAGAGAGC)进行ISSR-PCR扩增，使用交配型A1单核菌株DNA为模板同时进行扩增，用无菌双蒸水作阴性对照，扩增图谱有611片段的确定为阳性重组子。然后委托上海生工进行核苷酸序列测定，测序结果表明黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611具有序列表中SEQ IDNO：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：1由611个碱基组成。 

本实施方式的黑木耳“黑29”单核菌株交配型基因片段29-611为黑木耳“黑29”单核菌株A1基因池所特有，可以为“黑29”单核菌株交配型的鉴定提供一个良好的参考指标，用于菌株鉴别。在“黑29”单核菌株鉴别时，凡是有29-611序列的单核菌株为“黑29”单核菌株交配型A1，没有29-611序列的为单核菌株交配型A2。 

还可为黑木耳单核菌株育种提供理论基础，使用29-611序列快速确认“黑29”单核菌株交配型，选择不同交配型单核菌株进行组合交配，加快育种进程，缩短育种周期。 

序列表 

<110>黑龙江省科学院微生物研究所 

<120>黑木耳“黑29”菌株交配型基因片段29-611 

<160>2 

<210>1 

<211>611 

<212>DNA 

<213>黑木耳(Auricularia auricula) 

<400>1 

acaagtccaa ccgctttcaa tgtccgaccc aaccacgtcc tgatgcgtcc cggccccgat 60 

gatctgatgt cattgtgatg gctctgtcta gtctctgcat cgagtcgttg acgtagttga 120 

ctcaagggag aaattttgtc gtgctacttc cggtactgta cccctgaact gattacctga 180 

gtacggaagt aacactcaac gggccctgga taacaaccat ttcatttcga atcatcagtt 240 

catacaagtg tataggtgta ggagggctgc ttcctctttg gaagctccaa tggctgcctc 300 

tcattctgtc aatcgtgttc gaacaaaccg gctgacgaca gcccgtggtg ggggcacaat 360 

tcgcggttgg atatagcgtt ccggaaacgc aacagcaacg gttctgacgc cattatagtg 420 

gcctacaatc ctgtttatga ttttgcaatt cattatacac cgactataag aattggaggt 480 

cttaaaaacc gaacataagt ctggcgggaa tcttgtgacg gctggcaatg cactgcaagg 540 

tgtcgcaagc cttgccggaa tcttatcaac tccgcaacgc tgtaccatat ccggccggat 600 

ttcgtgatga t 611 

<210>2 

<211>17 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>ISSR引物 

<400>2 

agagagagagagagagc 17 

 

<110> 黑龙江省科学院微生物研究所

 

<120> 黑木耳“黑29”菌株交配型基因片段29-611

 

<160> 2

 

<210> 1

<211> 611

<212> DNA

<213> 黑木耳（Auriculariaauricula）

<400> 1

acaagtccaa ccgctttcaa tgtccgaccc aaccacgtcc tgatgcgtcc cggccccgat 60

gatctgatgt cattgtgatg gctctgtcta gtctctgcat cgagtcgttg acgtagttga 120

ctcaagggag aaattttgtc gtgctacttc cggtactgta cccctgaact gattacctga 180

gtacggaagt aacactcaac gggccctgga taacaaccat ttcatttcga atcatcagtt 240

catacaagtg tataggtgta ggagggctgc ttcctctttg gaagctccaa tggctgcctc 300

tcattctgtc aatcgtgttc gaacaaaccg gctgacgaca gcccgtggtg ggggcacaat 360

tcgcggttgg atatagcgtt ccggaaacgc aacagcaacg gttctgacgc cattatagtg 420

gcctacaatc ctgtttatga ttttgcaatt cattatacac cgactataag aattggaggt 480

cttaaaaacc gaacataagt ctggcgggaa tcttgtgacg gctggcaatg cactgcaagg 540

tgtcgcaagc cttgccggaa tcttatcaac tccgcaacgc tgtaccatat ccggccggat 600

ttcgtgatga t 611

 

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> ISSR引物

 

<400> 2

agagagagagagagagc 17