同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法

摘要

本发明公开了一种同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法，该方法利用专门针对中国番茄曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、中国番木瓜曲叶病毒和中国胜红蓟黄脉病毒等四种病毒的四对特异引物ToL-F/ToL-R、TY-F/TY-R、PaL-F/PaL-R、AY-F/AY-R，并结合PCR检测技术，实现了对四种病毒的同时鉴别。应用本发明，在提取样品总DNA后，仅需一次PCR检测即可实现对四种烟粉虱传双生病毒的检测，为调查鉴定提供了较为简便的方法。与传统PCR一次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经济有效的检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生 病毒的方法，包括中国番茄曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、中国番木瓜曲叶病毒和中 国胜红蓟黄脉病毒。

背景技术

烟粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted Gemini-viruses,WTGs)病是世界番茄生 产上的重要病害之一，最早在以色列被发现，并被冠以番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow  leaf curl virus，TYLCV)的名称。后续研究发现，该病毒并非一种病毒而是一类病毒， 该类病毒具有孪生颗粒形态和单链环状DNA，属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶 病毒属(Begomovirus)，其基因组由双组分DNA（DNA-A和DNA-B）或单组分DNA组成，每 个DNA组分的大小为2.5kb～2.8kb，部分病毒还含有卫星分子DNA-β；该类病毒由烟粉 虱（Bemisia tabaci）以持久方式传播。我国自1982年报道双生病毒以来，云南、广西、 广东、福建、海南、山东、四川、上海、北京等省市的番茄、烟草、番木瓜、南瓜和杂草 等植物上相继发现多种粉虱传双生病毒，给农业生产造成极大损失。

中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV），中国番茄黄化曲叶 病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV），中国番木瓜曲叶病毒(Papaya  leaf curl China virus，PaLCuCNV)和中国胜红蓟黄脉病毒（AgeratμM yellow vein China  virus，AYVCNV）等是侵染番茄的四种烟粉虱传双生病毒，它们分类上同属于双生病毒科 菜豆金色花叶病毒属，传播介体为烟粉虱，病毒基因组也均为单链环状DNA，侵染番茄后 症状均表现为叶片变小，上卷，顶部叶片黄化，植株矮缩。这四种病毒最初均报道于我国 的广西省，且均能侵染番茄，给当地的番茄生产带来了很大的影响。2005年，由这四种病 毒中的一种或多种病毒侵染番茄引起的曲叶病在广西造成大爆发，据调查，百色市田阳县 秋番茄发病率达15%-30%，严重田块发病率超过80%，部分地块绝收。近年来，这些病毒 在我国扩散蔓延迅速，其中中国番木瓜曲叶病毒在河南、安徽、江苏等地陆续报道发生， 中国番茄黄化曲叶病毒在我国的云南、四川、海南等地发生。2007年中国番木瓜曲叶病毒 引起的番茄黄化曲叶病在河南省大面积发生，仅开封县就造成经济损失2000多万元；病 毒的扩散给这些地区的番茄生产带来了极大的损失。因此，尽早确诊，并采取相应防治措 施将有助于减少由此类病毒造成的经济损失。

上述四种病毒属于同科同属病毒，具有相同的粒体形状，相同的传播介体，相近的基 因结构，侵染番茄后表现的症状也相近，因此鉴别起来比较麻烦。传统的鉴别方法如：生 物学接种法，电镜观察法，血清学检测法，分子生物学方法等均由于病毒的特征较为接近 难以区分，目前也尚未见到使用PCR一次即可区分这四种病毒的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、特异、高效的同步检测四种侵染番茄的烟 粉虱传双生病毒的方法，以实现对侵染番茄的中国番茄曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、 中国番木瓜曲叶病毒和中国胜红蓟黄脉病毒等四种病毒的同时鉴别。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传 双生病毒的方法，PCR反应同时采用以下四对引物序列：

ToL-F:AGGCAACGGTGACTGGTGGAC，ToL-R:CCGGATATGGACGAACTCACACC；

TY-F:CCACTGTCCGCGTCACCAGAAG，TY-R:CTTCCTCTGCAATCCAGGACCCA；

PaL-F:AAAGCCCTGATGTTCCTCGTGG，PaL-R:GAGACCATTCAACACCAACCACGAC；

AY-F:TCACGGTTTTAGGTGTATGCTTGCC，AY-R:AAATCCATAGCAGAACCATAGGGCC。

这些引物序列是根据NCBI上已报道的中国番茄曲叶病毒（AJ704603，AJ558118）、中 国番茄黄化曲叶病毒（AM261326，AF311734，FN985163，JX679252）、中国番木瓜曲叶病 毒（AY650283，AM691554，FN297834，NC005321）、中国胜红蓟黄脉病毒（AJ849916， AJ558120，AJ564744）来设计并优选而得，具体配对如下：

上述同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法，包括以下步骤：

<1>提取样品总DNA

称取0.1g待测样本（如番茄病叶）于研钵中，加入1ml0.5mol/L NaOH溶液，研磨 后转移至1.5mL离心管中，5000rpm离心5min，上清液用pH8.00.1mol/L的Tris-HCl 稀释50倍，作为PCR扩增的模板；

<2>PCR反应

反应体系：PCR混合液25μL，其中2×Es Taq MasterMix12.5μL，引物ToL-F、 ToL-R、TY-F、TY-R、PaL-F、PaL-R、AY-F、AY-R各1μL，各引物的使用浓度为10μM， 模板DNA2μL及ddH₂O2.5μL；

扩增程序：95℃3min；随后进行30-35个循环，每个循环包括95℃30s，58-62℃ 45s，72℃90s；最后72℃10min；

<3>电泳检测

取5μL PCR产物经加入1.2‰的gel-red荧光染料的1.2%琼脂糖凝胶在0.5×TAE电 泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。结 果分析：在仅感染中国番茄曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条419bp核酸条带，在仅 感染中国番茄黄化曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条1306bp核酸条带，在仅感染中 国番木瓜曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条887bp核酸条带，在仅感染中国胜红蓟黄 脉病毒的番茄样品中可以观察到一条580bp核酸条带，同时感染以上任意两种病毒的样品 中可以观察到两条对应大小的核酸条带，同时感染以上任意三种病毒的样品中可以观察到 三条对应大小的核酸条带，同时感染这四种病毒的样品中可以观察到四条对应大小的核酸 条带。

四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒是中国番茄曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、中 国番木瓜曲叶病毒和中国胜红蓟黄脉病毒。

上述同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法可应用在番茄、烟草、番木瓜 或杂草等植物的双生病毒检测上。

针对目前四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒（ToLCCNV、TYLCCNV、PaLCuCNV和AYVCNV） 危害严重却又缺乏快速有效鉴别手段的问题，发明人根据四种病毒的基因序列分别优化设 计了对应的四对特异引物ToL-F/ToL-R、TY-F/TY-R、PaL-F/PaL-R、AY-F/AY-R，并结合 PCR检测技术建立了本发明同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法。应用本发 明，在提取样品总DNA后，仅需一次PCR检测即可实现对四种烟粉虱传双生病毒的检测， 为调查鉴定提供了较为简便的方法。与传统PCR一次仅能检测一种病毒相比，该法既减少 了成本又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、 方便且经济有效的检测方法。

附图说明

图1是应用本发明检测方法的实施例1的电泳结果图，图中：M是DM2000标准分子量； 1健康番茄植株，2已知感染中国番茄曲叶病毒样品，3已知感染中国胜红蓟黄脉病毒样品， 4已知感染中国番木瓜曲叶病毒样品，5已知感染中国番茄黄化曲叶病毒样品，6已知同时 感染中国番茄曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、中国番木瓜曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶 病毒样品。

图2是应用本发明检测方法的实施例2的电泳结果图，图中：M是DM2000标准分子量， 1健康番茄植株，2已知感染中国番茄曲叶病毒样品，3已知感染中国胜红蓟黄脉病毒样品， 4已知感染中国番木瓜曲叶病毒样品，5已知感染中国番茄黄化曲叶病毒样品，6已知同时 感染中国胜红蓟黄脉病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品，7已知同时感染中国番茄曲叶病 毒和中国番木瓜曲叶病毒样品，8已知同时感染中国番茄曲叶病毒、中国番木瓜曲叶病毒 和中国番茄黄化曲叶病毒样品，9已知同时感染中国胜红蓟黄脉病毒、中国番木瓜曲叶病 毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品，10已知同时感染中国番茄曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病 毒、中国番木瓜曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品。。

具体实施方式

实施例1

待测样本包括：

1健康番茄植株，2已知感染中国番茄曲叶病毒样品，3已知感染中国胜红蓟黄脉病毒 样品，4已知感染中国番木瓜曲叶病毒样品，5已知感染中国番茄黄化曲叶病毒样品，6已 知同时感染中国番茄曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、中国番木瓜曲叶病毒和中国番茄黄 化曲叶病毒样品。

按下列步骤对各样品分别进行PCR检测。

<1>提取样品总DNA

称取0.1g待测样本于研钵中，加入1ml0.5mol/L NaOH溶液，研磨后转移至1.5mL 离心管中，5000rpm离心5min，上清液用pH8.00.1mol/L的Tris-HCl稀释50倍，作为 PCR扩增的模板；

<2>PCR反应

反应体系：PCR混合液25μL，其中2×Es Taq MasterMix12.5μL，引物ToL-F、 ToL-R、TY-F、TY-R、PaL-F、PaL-R、AY-F、AY-R各1μL，各引物的使用浓度为10μM， 模板DNA2μL及ddH₂O2.5μL；

引物序列如下：

ToL-F:AGGCAACGGTGACTGGTGGAC，见SEQ.ID.No.1；

ToL-R:CCGGATATGGACGAACTCACACC，见SEQ.ID.No.2；

TY-F:CCACTGTCCGCGTCACCAGAAG，见SEQ.ID.No.3；

TY-R:CTTCCTCTGCAATCCAGGACCCA，见SEQ.ID.No.4；

PaL-F:AAAGCCCTGATGTTCCTCGTGG，见SEQ.ID.No.5；

PaL-R:GAGACCATTCAACACCAACCACGAC，见SEQ.ID.No.6；

AY-F:TCACGGTTTTAGGTGTATGCTTGCC，见SEQ.ID.No.7；

AY-R:AAATCCATAGCAGAACCATAGGGCC，见SEQ.ID.No.8；

扩增程序：95℃3min；随后进行30-35个循环，每个循环包括95℃30s，58-62℃ 45s，72℃90s；最后72℃10min；

<3>电泳检测

取5μL PCR产物经加入1.2‰的gel-red荧光染料的1.2%琼脂糖凝胶在0.5×TAE电 泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。

<4>检测结果

见图1。

实施例2

待测样本包括：

1健康番茄植株，2已知感染中国番茄曲叶病毒样品，3已知感染中国胜红蓟黄脉病毒 样品，4已知感染中国番木瓜曲叶病毒样品，5已知感染中国番茄黄化曲叶病毒样品，6已 知同时感染中国胜红蓟黄脉病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品，7已知同时感染中国番茄 曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒样品，8已知同时感染中国番茄曲叶病毒、中国番木瓜曲 叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品，9已知同时感染中国胜红蓟黄脉病毒、中国番木瓜 曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品，10已知同时感染中国番茄曲叶病毒、中国胜红蓟 黄脉病毒、中国番木瓜曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒样品。

参照实施例1检测步骤对各样品分别进行PCR检测。

检测结果见图2。