针对微小RNA-21种子序列的反义寡聚核苷酸及应用

摘要

本发明公开了一种针对微小RNA-21种子序列的反义寡聚核苷酸及应用，属于药物制备领域。本研究针对miR-21的种子序列设计并合成8个碱基的微小反义核酸t-antimiR-21。通过t-antimiR-21转染细胞实验显示，t-antimiR-21靶向作用于K562细胞以及RPMI-8266细胞株的miR-21，细胞生长受到抑制，细胞凋亡明显增加。表明t-antimiR-21通过干扰miRNA-21表达可有效抑制淋巴瘤细胞生长，同时表明miRNA-21可能作为淋巴瘤基因治疗的潜在靶点。t-antimiR-21可用于制备抗肿瘤的药物，尤其是用于制备抗慢性粒细胞白血病以及多发性骨髓瘤的药物。

说明书

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种针对微小RNA-21种子序列的反 义寡聚核苷酸及应用。

背景技术

microRNA（miRNA）是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码单链小分子 RNA，参与细胞的分化、增殖和调亡、个体发育、机体代谢等生理过程。miRNA 5'端的“种子序列”（miRNA5'端7-8个核苷酸序列）与其靶基因mRNA的3'非翻 译区（3'untranslated region，3'UTR）进行碱基完全互补配对，促进靶基因mRNA 降解或抑制mRNA翻译，从而对靶基因的表达水平进行转录后调控。

至2012年8月，已有21264条目miRNA序列记载于人类基因组中（Sanger  miRBasel9.0数据库）。有研究发现属于ncRNA范畴的miRNA不仅在胚胎发育和细 胞分化上发挥关键作用，也与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。约有50％的 miRNA集中于肿瘤基因组的脆性位点区或者与癌症相关的区域，几乎所有的肿 瘤都有异常表达的miRNA，通过miRNA芯片检测发现，在多发性骨髓瘤患者的 骨髓瘤细胞中，miRNA-29b表达水平显著降低，miR-106b-25群（cluster）、 miR-181a/b和miR-19a/b表达则相对升高。通过本课题组的实验发现在慢性粒细 胞株K562中，miR-181a表达下调。一系列研究表明，miRNA在多种肿瘤中既可 作为抑癌基因下调癌基因的表达，也可作为癌基因下调抑癌基因的表达。并且 在不同的肿瘤组织或细胞内，miRNA具有特定的表达模式，明显的组织特异性。 miRNA对靶基因表达的调控为揭示肿瘤的发病机制、指导治疗及判断预后方面 提供了新的机遇。

miR-21是miRNA家族中的一个亚型，位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域 上，是具有自主转录单位的miRNA，并且有高度保守性。Chan等（Chan J A， Krichevsky A M，Kosik K S，et a1．Cancer Res，2005，65(14)：6029）首次发 现miR-21在人恶性胶质瘤中高表达，并通过抑制细胞凋亡促进肿瘤的发生。对 肿瘤样本或细胞株中的miRNAs的表达水平进行转录图谱研究，发现miR-21负性 调节STAT3、PTEN、PDCD4、AP1、TGFβ等多种靶基因，在多种实体瘤（肺 癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、食管癌 等）以及非实体瘤（慢性淋巴细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤等）中高表达，起 着致癌基因的作用。miR-21与肿瘤的转移侵入也有密切关系。通过一系列的实 验方法调节miR-21在肿瘤中的表达，能够减少肿瘤的增殖，抑制肿瘤的转移及 侵入。所以，敲除或抑制miR-21的表达，使其失去癌基因的功能，就可以在一 定程度上治疗相关癌症。研究表明，miR-21可以作为癌症诊断以及治疗的一种 新的生物标志物（Zheng J，Xue H，Wang et a1．J Cell Biochem，2011，112： 872-880．）。因此，miRNA-21可能成为多种癌症治疗新的靶点。

慢性粒细胞白血病以及多发性骨髓瘤都是恶性增殖性疾病，传统的化学药 物都存在一定的毒副作用，因此急需寻找新的药物。已有研究结果表明 microRNA-21在包括慢性髓系白血病的多种癌症中高表达，并且对肿瘤细胞的 增殖和迁移起到明显的促进作用，提示拮抗microRNA-21的表达可能成为慢性 髓系白血病等肿瘤治疗的新靶点，针对microRNA-21靶点的药物开发成为一个 亟待解决的应用。

目前研究miR-21的表达调控的方法有RNA干扰技术、反义核酸技术和 miRNA海绵技术等。由于成熟miRNA只有21nt，反义核酸技术表现出明显的优 势，基于miRNA的作用机制，使用seed-targeting tiny LNA（Susanna Obad,Camila  O dos Santos,Andreas Petri etal.Nature genetics,2011,43(4):371-378.）作用于 microRNA取得一定成效。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种针对微小RNA-21 种子序列的反义寡聚核苷酸。

本发明的再一目的在于提供上述针对微小RNA-21种子序列的反义寡聚核 苷酸的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种针对微小RNA-21种子序列的 反义寡聚核苷酸（t-antimiR-21），其核苷酸序列如下：ATAAGCTA。

所述的反义寡核苷酸经过全硫代修饰。

所述的针对微小RNA-21种子序列的反义寡聚核苷酸在制备抗慢性粒细胞 白血病以及抗多发性骨髓瘤的药物方面应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本研究针对miR-21的种子序列合成t-antimiR-21，靶向作用于慢性粒细胞 株K562以及多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8266的miR-21，发现t-antimiR-21对 肿瘤细胞的抑制效应影响，为制备治疗相关肿瘤疾病的药物提供的新的可能。 同时，由于t-antimiR-21只有8nt，与miR-21成熟序列合成的反义寡聚核苷酸 (antimiR-21)（如图1）性比，具有转染效率高和毒副作用小的优势，因此一定 程度上可以克服长序列antimiR-21本身所产生的转染效率低及毒副作用大的不 足。通过研究证实，t-antimiR-21具有直接或间接抑制肿瘤的发生和肿瘤的生长 的作用，所以可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，在临床治疗中具有广阔的前 景。

附图说明

图1是miR-21、antimiR-21和t-antimiR-21的序列示意图。

图2是MTT法测K562细胞和RPMI-8266细胞增殖抑制率结果图，A：MTT 法测K562细胞增殖抑制率结果图；B：MTT法测RPMI-8266细胞增殖抑制率 结果图。

图3是台盼蓝拒染法测K562细胞和RPMI-8266细胞的活细胞数结果图。A： 台盼蓝拒染法测K562细胞的活细胞数结果图；B：台盼蓝拒染法测RPMI-8266 细胞的活细胞数结果图。

图4是Annexin V/PI双染法测K562细胞凋亡率结果图。A：流式细胞仪检 测PI和Annexin V双染色结果图；B：Annexin V/PI双染色法检测的K562细胞 凋亡率结果柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

下述实施例所用试剂的来源：

MTT（四甲基偶氮唑蓝）及DMSO购自Sigma公司，新生牛血清购于杭州四 季青生物工程科技有限公司，胎牛血清及RPMI-1640培养基购自GIBCO公司。 Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司。

K562细胞株购自中科院上海细胞库，RPMI-8266细胞株受赠于南方医科大 学血液科。

实施例1反义寡核苷酸的设计与合成

从microRNA Families数据库中获取人microRNA-21种子序列，根据序列互补 原理设计针对种子序列的反义寡核苷酸序列（t-antimiR-21），并采用BLAST软件 分析确定其反义寡核苷酸序列及随机对照序列（如图1）。反义寡核苷酸序列 (t-antimiR-21)：5’-ATAAGCTA-3’；随机序列(scramble，SCR)：5’-TCATACTA-3’， 均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修饰，HPLC纯化。

实施例2K562细胞培养

将K562细胞接种于含体积分数为10%的新生牛血清、无抗生素的RPMI-1640 培养基中，RPMI-8266细胞接种于含体积分数为10%的胎牛血清，无抗生素的 RPMI-1640培养基中，置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱，饱和湿度下培养。 每2-3天换液传代。实验选用对数生长期、质量分数为0.2%台盼蓝拒染率>95%的 细胞。

实施例3MTT法筛选反义寡核苷酸的最佳作用浓度

本实验分t-antimiR-21组、随机对照组（SCR)和空白对照组，每组设5个复孔。 t-antimiR-21组中t-antimiR-21的核酸终浓度为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6μmol/l，随 机对照组中随机序列的核酸终浓度为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6μmol/l。取对数生长 期的K562细胞和RPMI-8266细胞，各组细胞以1×10⁵个/mL的密度接种于96孔板， 每孔50μL，转染终体积100μL（转染方法参照Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000 说明书），空白对照组加入50μL的无血清的Opti-MEM培养基。转染6h后，每孔 加入100μL含体积分数为20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，使每孔终体积为 200μL。48小时后每孔加入5mg/ml的MTT液20μL，于培养箱中培养4小时后， 1000rpm离心10min，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），震荡10 分钟，使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A_570nm，以A₅₇₀间接反映 存活细胞量。实验重复三次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-（A_实验组/A_对照组）]×100%。

MTT法测细胞增殖抑制率结果如图2所示，t-antimiR-21在终浓度为 0.3μmol/L和0.4μmol/L之间表现出有效抑制K562细胞，RPMI-8266增殖活力的效 应，其最佳作用浓度为0.4μmol/L，与随机对照组相比有显著差异（P<0.05）。 t-antimiR-21在0.5μmol/L以上的终浓度显示出非特异性作用。

实施例4台盼蓝拒染法检测不同时间段细胞的生长状况

实验分组及处理同实施例3，反义寡核苷酸组（t-antimiR-21）和随机对照组 （SCR）的核酸终浓度为0.4μmol/L。于24、48、72小时将每组细胞充分混匀后 用台盼蓝拒染法计数每组活细胞数，重复3次，取均值。

反义寡核苷酸对细胞的生长抑制作用结果如图3所示，终浓度0.4μmol/L的 t-antimiR-21分别作用于K562细胞和RPMI-8266细胞24小时后开始表现出生长抑 制效应，持续至72小时。随机对照组（SCR）、空白对照组细胞的生长基本不受 影响。

实施例5流式细胞仪计量分析K562细胞凋亡情况

实验分组同实施例3，各组细胞以5×10⁴/ml的密度接种于24孔板，每孔400ul， 转染终体积500ul，空白对照组加入与药物同体积的RPMI-1640培养基。6小时后 加入500ul体积分数为20%胎牛血清的RPMI-1640培养基置于培养箱中培养。反义 寡核苷酸组和随机对照组的核酸终浓度为0.4μmol/L。48小时后离心收集细胞， 采用Annexin V/PI双染色，并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

反义寡核苷酸对细胞凋亡的影响结果如图4所示，终浓度0.4μmol/L的反义 寡核苷酸作用于K562细胞48小时后，经AnnexinV/PI双染色，采用流式细胞 仪检测，细胞调亡率为7.52%。与对照组的3.86%相比，其凋亡率明显增加。

以上实施例的结果表明t-antimiR-21作用于K562细胞以及RPMI-8266细胞 后，细胞的增殖和生长受到抑制，细胞凋亡明显增加。终浓度0.4μmol/L为最优 的t-antimiR-21处理条件，达到最有的肿瘤细胞增殖和生长抑制效应和明显的细 胞凋亡效应。

其中，K562细胞作为慢性髓原白血病细胞株和RPMI-8266细胞作为骨髓瘤 细胞株，t-antimiR-21对两种细胞的增殖抑制、生长抑制和细胞凋亡增加的作用， 表明t-antimiR-21通过干扰miRNA-21表达可有效抑制淋巴瘤细胞生长，同时表 明miRNA-21可能作为淋巴瘤基因治疗的潜在靶点。为t-antimiR-21应用于制备 抗肿瘤药物，应用于慢性粒细胞白血病以及多发性骨髓瘤疾病治疗提供实验证 据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。