Chi92蛋白的新用途以及表达Chi92蛋白的菌株

摘要

本发明公开了一种Chi92蛋白的新用途以及表达Chi92蛋白的菌株。本发明提供的巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）pPIC9/Chi92，保藏号为CGMCC No.7634。本发明还保护所述巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92的发酵产物。本发明还保护所述发酵产物在制备几丁质酶中的应用、作为几丁质酶的应用、在降解几丁质类底物中的应用。本发明还保护Chi92蛋白在制备几丁质酶中的应用、作为几丁质酶的应用、在降解几丁质类底物中的应用。本发明对现代几丁质产业发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种Chi92蛋白的新用途以及表达Chi92蛋白的菌株。

背景技术

几丁质(Chitin)又称甲壳素、甲壳质，其基本组成单位是乙酰氨基葡萄糖。乙酰 氨基葡萄糖为一种直链聚合物，其结构类似于纤维素，只是C2羟基被N-乙酰氨基所 取代。几丁质的主要来源是海洋甲壳类动物，如虾、蟹等，是海洋环境最重要的营养 源和能源，同时又是我国近海域主要的有机污染源之一。几丁质广泛的分布在自然界 中，是世界上含量仅次于纤维素的生物高聚物，每年生物合成量达100亿吨。由于几 丁质的分子量大、结构紧密、不容于水和普通溶剂，故其应用受到很大的限制，所以 在生产上需要将几丁质降解为水溶性好的几丁寡糖等甲壳低聚糖。

几丁质酶(EC.3.2.14)是一类特异性水解几丁质的蛋白，能水解几丁质的β-1,4 糖苷键，产生几丁质寡聚糖如Glc(NAG)₂、Glc(NAG)₃、Glc(NAG)₄、Glc(NAG)₅和Glc(NAG)₆， 最终分解为N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）。

发明内容

本发明的目的是提供一种Chi92蛋白的新用途以及表达Chi92蛋白的菌株。

本发明提供的巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）pPIC9/Chi92，已于2013年5 月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7634。

本发明还保护巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92在生产Chi92蛋白中的应用；所述Chi92 蛋白为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b） 将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有几丁质酶活性的由序列1衍生的蛋白质。应用所述巴氏毕赤酵母 pPIC9/Chi92生产所述Chi92蛋白的方法如下：将所述菌株接种至BMMY液体培养基， 30℃、250-280rpm振荡培养48h，每12h补加甲醇，使培养体系中的甲醇浓度达到0.5% （体积比），离心收集上清液。所述方法还可包括如下步骤：将所述上清液采用10kDa 膜包进行浓缩，然后进行透析，最后冷冻干燥，得到干粉。

本发明还保护所述巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92的发酵产物。所述发酵产物的制备 方法如下：将所述菌株接种至BMMY液体培养基，30℃、250-280rpm振荡培养48h，每 12h补加甲醇，使培养体系中的甲醇浓度达到0.5%（体积比），离心收集上清液。所述 方法还可包括如下步骤：将所述上清液采用10kDa膜包进行浓缩，然后进行透析，最 后冷冻干燥，得到干粉。

本发明还保护所述发酵产物在制备几丁质酶中的应用。所述应用中，反应的条件 为：30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9（如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明还保护所述发酵产物作为几丁质酶的应用。所述应用中，反应的条件为： 30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9（如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明还保护所述发酵产物在降解几丁质类底物中的应用；所述几丁质类底物为 胶体几丁质、β-葡聚糖、羧甲基纤维素、壳聚糖、虾壳粉、几丁质和乙二醇几丁质中 的至少一种。所述应用中，反应的条件为：30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9 （如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明还保护所述Chi92蛋白在制备几丁质酶中的应用。所述应用中，反应的条 件为：30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9（如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明还保护所述Chi92蛋白作为几丁质酶的应用。所述应用中，反应的条件为： 30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9（如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明还保护所述Chi92蛋白在降解几丁质类底物中的应用；所述几丁质类底物 为胶体几丁质、β-葡聚糖、羧甲基纤维素、壳聚糖、虾壳粉、几丁质和乙二醇几丁质 中的至少一种。所述应用中，反应的条件为：30℃-45℃（如30-40℃或40-45℃），pH6-9 （如pH6-7、pH7-8、pH8-9）。

本发明提供的巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92，具有高效生产Chi92蛋白的能力。巴 氏毕赤酵母pPIC9/Chi92的发酵产物（Chi92蛋白），具有几丁质酶活性，其比活力为 809.207U/mg，对胶体几丁质的K_m值和V_max值分别为3.967mg/mL和1610μmol/(mg·h)。 所述发酵产物（Chi92蛋白）作为几丁质酶具有如下优点：最适反应温度为40℃，并 且在30-45℃间保持60.0%以上的活性；具有良好的热稳定性，40℃处理60min后，Chi92 蛋白仍然保留80%以上的相对酶活；最适反应pH为8.0，在pH6-9范围内酶活性可以 维持在80%以上；具有良好的pH稳定性；具有较高的比活力。本发明对现代几丁质产 业发展具有重要意义。

附图说明

图1为标准曲线以及标准曲线方程。

图2为SDS-PAGE电泳图。

图3为以1/v对1/[S]作图的结果。

图4为薄层层析的结果。

图5为ESI-MS分析的结果。

图6为最适pH的结果。

图7为pH稳定性的结果。

图8为最适温度的结果。

图9为温度稳定性的结果。

图10为底物特异性的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。酶活力单位定义：每小时分解胶体几丁质释放出1μmol/L GlcNAc 所需的酶量定义为一个酶活力单位（1U）。比活力单位定义：每毫克酶蛋白所含的酶活 力单位（U/mg）。Chi92蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。

气单胞菌（Aeromonas sp.）B565，已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号），保藏号为CGMCC No.4403。

毕赤酵母表达载体pPIC9：Invitrogen公司。毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115： Invitrogen公司。几丁质：Sigma公司，货号为C9752。羧甲基纤维素：北京鼎国生 物技术公司，货号为DH053。大麦β-葡聚糖：北京拜耳迪生物公司。壳聚糖（粉末）： sigma公司，货号为417963。乙二醇几丁质（粉末）：sigma公司,货号为G7753。N- 乙酰氨基葡萄糖：Sigmah公司，货号N8759。

MD固体培养基的溶剂为水，含有如下溶质：YNB13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素 4×10^-4g/L、琼脂粉20g/L。

BMGY液体培养基的溶剂为水，含有如下溶质：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、 酵母氮源(YNB)13.4g/L、生物素4×10^-4g/L、甘油10mL/L。

BMMY液体培养基的溶剂为水，含有如下溶质：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、 酵母氮源(YNB)13.4g/L、生物素4×10^-4g/L、甲醇5mL/L。

实施例1、工程菌的构建和保藏

一、重组质粒的构建

1、提取气单胞菌B565的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。

F1：5’-GGAGAATTCGCGGCGCCCGGCAAGCC-3’

R1：5’-GGAGCGGCCGCTTATTTACAACTGGCGGCTCCCACATCCTG-3’

3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切毕赤酵母表达载体pPIC9，回收约9.3kb 的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果， 对重组质粒进行结构描述如下：在毕赤酵母表达载体pPIC9的EcoRI和NotI酶切位点 之间插入了序列表的序列2自5’末端第70-2595位核苷酸所示的双链DNA分子。

二、重组菌的构建

1、将步骤一构建的重组质粒导入毕赤酵母GS115的感受态细胞，然后涂布MD固 体培养基平板，用灭过菌的牙签挑取单菌落，按照编号接种到新的MD固体培养基平板。 共得到96个单克隆。

2、按编号挑取单克隆接种于3mL BMGY液体培养基，30℃、250-280rpm振荡培养 2-3天，然后4500rpm离心5min，取沉淀（尽量将上清除尽）；向沉淀中加入1mL BMMY 液体培养基，30℃、250-280rpm振荡培养48h，离心收集上清液。

三、对照菌的构建

1、用毕赤酵母表达载体pPIC9代替重组质粒进行步骤二的1，得到30个单克隆。

2、同步骤二的2。

四、检测上清液的几丁质酶酶活

1、1%胶体几丁质的制备

在4℃下，取10g几丁质放入研钵中，加丙酮40mL研磨10min，边研磨边缓缓加 入冷浓HCl400mL，充分研磨，使呈糊状，然后4℃放置24h，之后用玻璃棉过滤，收 集滤液；将滤液缓缓加入到盛有2000ml50%（体积分数）乙醇水溶液的烧杯中，边加 边剧烈搅拌，然后静置，待胶态几丁质析出后去除清液，收集胶体几丁质；用蒸馏水 冲洗胶体几丁质至pH7.0，以蒸馏水定容至1000ml，冷藏备用。

2、绘制标准曲线

用pH7.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将N-乙酰氨基葡萄糖配成不同 浓度的溶液，将0.5mL各个溶液（N-乙酰氨基葡萄糖的含量分别为5.5μmol、7.1μ mol、8.3μmol、10.0μmol、12.5μmol或16.7μmol）分别与1mL DNS溶液混合后沸 水浴5min显色，然后用蒸馏水补齐至2.5mL，冷却至室温后在540nm测定OD值，绘制 标准曲线，标准曲线以及标准曲线方程见图1。

3、分别检测步骤二得到的各个上清液、步骤三得到的各个上清液的几丁质酶酶活

（1）取4支试管，分别加入0.25mL待测溶液和0.25mL1%胶体几丁质，其中三 支试管于40℃水浴1h，另外一支于4℃放置，作为对照；

（2）取完成步骤（1）的试管，每管加入1mL DNS溶液，沸水浴5min，然后用蒸 馏水补齐至2.5ml，离心取上清液，在540nm测定OD值，对照标准曲线方程并计算酶 活。

步骤二得到的96个单克隆中，24个单克隆得到的上清液具有几丁质酶酶活，依 次为7.584、8.873、9.609、16.788、32.251、32.803、33.907、33.907、34.460、 35.288、37.497、37.681、37.865、37.957、38.509、38.601、38.693、38.970、39.154、 39.890、41.087、41.179、41.731和66.398U/ml。将几丁质酶酶活最高的上清液对应 的菌株作为工程菌，命名为巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92。

步骤三得到的30个单克隆中，上清液的几丁质酶酶活均为0U/mL。

五、工程菌的保藏

巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）pPIC9/Chi92，已于2013年5月23日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7634。

实施例2、Chi92蛋白的制备、纯化以及酶活测定

一、Chi92蛋白的制备及纯化

1、将巴氏毕赤酵母pPIC9/Chi92接种于装有200mL BMGY液体培养基的1000mL 三角瓶，30℃、250-280rpm振荡培养2天，4500rpm离心5min，取沉淀（尽量将上清 除尽）；向沉淀中加入100mL BMMY液体培养基，30℃、250-280rpm振荡培养48h，每 12h补加甲醇，使培养体系中的甲醇浓度达到0.5%（体积比），离心收集上清液。

2、在0℃下，将步骤1得到的上清液采用10kDa膜包进行浓缩，然后以去离子水 作为透析液进行透析，最后冷冻干燥，得到干粉。

3、取步骤2得到的干粉，溶于去离子水后进行SDS-PAGE，见图2，显示分子量约 为92kDa的单一条带，与预测分子量相近。切取目标条带，送天津生物芯片技术有限 公司进行二级质谱鉴定，鉴定结果表明该目标条带为Chi92蛋白。

二、Chi92蛋白作为几丁质酶的比活，Km,Vmax

1、将50mg步骤一的2得到的干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液，得到待测溶液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、通过考马斯亮蓝法检测步骤1得到的待测溶液中的蛋白含量。

4、检测步骤1得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法同实施例1的步骤四的3。

待测溶液的几丁质酶酶活为69.423U/mL，Chi92蛋白的比活力为809.207U/mg。

测定Chi92蛋白的一级反应时间为60min，分别用不同浓度的胶体几丁质（1%、 0.8%、0.7%、0.6%、0.4%、0.3%和0.1%）为底物，其它同实施例1的步骤四的3，计 算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数法求得Km值及Vmax。按双倒数作图法 （Lineweaver-Burk法）将米氏方程改写为：

$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max }}\times \frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_{\max }}$

计算v、[S]二者的倒数，以1/v对1/[S]作图，绘出直线，见图3，求得Km值及 Vmax。Km：3.967mg/mL。Vmax：1610μmol/(mg·h)。

三、TLC（薄层层析法）检测Chi92蛋白降解胶体几丁质的产物

1、将50mg步骤一的2得到的干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液，得到待测溶液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、将500μl步骤1得到的待测溶液与500μl步骤2得到的1%胶体几丁质混合并 40℃静置反应1h，然后100℃煮沸10min，12000rpm离心10min并取上清，即为实验 组反应产物。将500μl步骤1得到的待测溶液与500μl步骤2得到的1%胶体几丁质混 合后100℃煮沸10min，然后12000rpm离心10min并取上清，即为对照组反应产物。

DGX9053-B-2鼓风干燥烘箱（上海福玛）；P-1型展层缸(双槽)(100mm*200mm)。 GF254硅胶板(100mm*200mm)。展开剂：正丁醇：异丙醇：乙酸：水=7:5:2:4（体积 比）。显色剂：苯胺4ml，二苯胺4g，85%磷酸30ml，丙酮200ml。105℃烘箱干燥5min 显色。

结果见图4。Chi92蛋白降解胶体几丁质的产物是几丁二糖，点样孔1、2、3、4、 5、6分别为Glc(NAG)₆、Glc(NAG)₅、Glc(NAG)₄、Glc(NAG)₃、Glc(NAG)₂和Glc(NAG)的标 准品，7为实验组反应产物，8为对照组反应产物，9为Glc(NAG)₆、Glc(NAG)₅、Glc(NAG)₄、 Glc(NAG)₃、Glc(NAG)₂和Glc(NAG)的标准品的混合物。结果表明：Chi92蛋白降解胶体 几丁质的产物为几丁二糖。

四、ESI-MS检测几丁质酶Chi92降解胶体几丁质的产物

处理方法同步骤三。

将800μl反应产物与1/3体积的阴阳树脂粒子涡旋混匀，室温静置30min，取上 清500μl即为脱盐反应产物。脱盐反应产物送到中科院化学研究所进行ESI-MS分析， 结果见图5。N-乙酰-D-氨基葡萄糖和几丁二糖的理论分子量分别为221.21和424.4。 由于在ESI-MS过程中采用氯仿作为电喷雾试剂，在糖的结构中引入Cl^-离子，与几丁 寡糖中的OH-形成氢键，利于结合柱子，产生峰图。所以在图中显示的峰图为加Cl^-分 子量。N-乙酰-D-氨基葡萄糖和几丁二糖的加Cl^-分子量分别为256.21和459.4，与峰 图结果一致。在ESI-MS过程中，加入Cl^-有2种形式，分别是³⁵Cl^-和³⁷Cl^-，理论上加 ³⁵Cl^-的峰高为加³⁷Cl^-的峰高的3倍。峰图中255.9与459.2峰后面2个质荷比的位置 分别有一个峰高度为其1/3的峰，进一步证明此峰图为加Cl^-峰图。由图中峰高度可以 看出几丁二糖的浓度明显高于N-乙酰-D-氨基葡萄糖。由于ESI-MS的检测分辨率约为 1ng，TLC检测分辨率约为5ng，因此在TLC方法中没有检测到浓度较低的N-乙酰-D- 氨基葡萄糖。

实施例3、Chi92蛋白作为几丁质酶的最适pH及pH稳定性，最适温度及热稳定性

将实施例2的步骤一的2得到的干粉作为待测干粉（主要组分为Chi92蛋白），进 行本实施例的实验。

一、最适pH

1、1%胶体几丁质的制备

在4℃下，取10g几丁质放入研钵中，加丙酮40mL研磨10min，边研磨边缓缓加 入冷浓HCl400mL，充分研磨，使呈糊状，然后4℃放置24h，之后用玻璃棉过滤，收 集滤液；将滤液缓缓加入到盛有2000ml50%（体积分数）乙醇水溶液的烧杯中，边加 边剧烈搅拌，然后静置，待胶态几丁质析出后去除清液，收集胶体几丁质；用缓冲液 冲洗胶体几丁质，以相同的缓冲液定容至1000ml，冷藏备用。

分别采用以下缓冲液：pH3.0-8.0的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、 pH8.0-9.0的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液和pH9.0-11.0的0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠 缓冲液。

2、将50mg待测干粉溶于10ml缓冲液（与步骤1中相同的缓冲液），得到待测溶 液。

3、检测步骤2得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法同实施例1的步骤四的3。

采用pH8.0的Tris-HCl缓冲液时，Chi92蛋白的酶活最高，待测溶液的酶活为 67.640U/ml。计算采用其它缓冲液时待测溶液与最高酶活相比的相对酶活，见图6。 在pH6.0-9.0时，Chi92蛋白保持80％以上的相对酶活。

二、pH稳定性

1、用缓冲液溶解待测干粉（每5mg干粉溶于1ml缓冲液），4℃静置2h后作为待 测溶液。分别采用以下缓冲液：pH3.0-8.0的0.2mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和 pH9.0-12.0的0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、检测步骤1得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法同实施例1的步骤四的3。

相对酶活结果见图7。Chi92蛋白在pH范围为4.0-9.0间都很稳定，保持70%以 上的酶活。

三、最适温度

1、将50mg待测干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、检测步骤1得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法参见实施例1的步骤四的3 （差异仅在于采用不同的反应温度）。

采用40℃的反应温度时，Chi92蛋白的酶活最高，待测溶液的酶活为86.861U/ml。 计算采用其它反应温度时待测溶液与最高酶活相比的相对酶活，见图8。在30℃-45℃ 时，Chi92蛋白保持60％以上的相对酶活。

四、温度稳定性

1、将50mg待测干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 在不同温度（40℃或50℃）下分别保温20、40、60、80、100或120分钟后作为待测 溶液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、检测步骤1得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法同实施例1的步骤四的3。

相对酶活结果见图9。40℃下处理60min后，Chi92蛋白仍然保留80%以上的相对 酶活，温度稳定性较好。

实施例4、金属离子及化学试剂对Chi92蛋白作为几丁质酶酶活的影响

将实施例2的步骤一的2得到的干粉作为待测干粉（主要组分为Chi92蛋白），进 行本实施例的实验。

1、将50mg待测干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 得到待测溶液。

2、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

3、在步骤2制备的1%胶体几丁质中加入化合物，使化合物的浓度为5mmol/L。分 别采用以下化合物：KCl（提供K⁺）、NaCl(提供Na⁺)、CaCl₂(提供Ca²⁺)、LiCl(提供 Li⁺)、CoCl₂(提供Co²⁺)、CrCl₃(提供Cr³⁺)、NiCl₂(提供Ni²⁺)、CuCl₂(提供Cu²⁺)、M_gCl₂(提 供Mg²⁺)、FeCl₃(提供Fe³⁺)、MnCl₂(提供Mn²⁺)、PbCl（提供Pb⁺）、ZnCl₂(提供Zn²⁺)、AgNO₃(提供Ag⁺)、EDTA、SDS和β-巯基乙醇。

3、将步骤2得到的每种不同体系进行如下检测：

（1）取4支试管，分别加入0.25mL待测溶液和0.25mL步骤2得到的体系，其中 三支试管于40℃水浴1h，另外一支于4℃放置，作为对照；

（2）取完成步骤（1）的试管，每管加入1mL DNS溶液，沸水浴5min，然后用蒸 馏水补齐至2.5ml，离心取上清液，在540nm测定OD值，对照标准曲线方程并计算酶 活。

4、CK组：检测步骤1得到的待测溶液的几丁质酶酶活，方法同实施例1的步骤 四的3。

结果见图10。Mn²⁺离子对Chi92蛋白的酶活有一定的促进作用，Cr³⁺、Cu²⁺等对Chi92 蛋白的酶活有一定的抑制作用，EDTA（螯合剂）几乎完全抑制Chi92蛋白的酶活。

实施例5、Chi92蛋白作为几丁质酶的底物特异性

一、底物的制备

1、1%胶体几丁质的制备

同实施例1的步骤四的1。

2、1%大麦β-葡聚糖的制备

1g大麦β-葡聚糖溶于100ml蒸馏水中，100℃水浴3min，静置至室温，5000rpm 离心5min，去除沉淀，上清的浑浊物即为1%大麦β-葡聚糖，4℃保存。

3、1%羧甲基纤维素

1g羧甲基纤维素缓慢加入到100ml蒸馏水中，边加边使用磁力搅拌器搅拌，得到 均一的浑浊物，即为1%羧甲基纤维素，4℃保存。

4、虾壳粉和蟹壳粉的制备

取虾壳或蟹壳，洗净，干燥后打为粉末，过100目筛，取粉末，然后用5%HCl 水溶液浸泡粉末2h以去Ca²⁺，水洗至中性，干燥；然后用10%NaOH水溶液浸泡粉末， 沸水浴2h以去蛋白：，水洗至中性，干燥；得到的粉末即为虾壳粉或蟹壳粉。

二、Chi92蛋白作为几丁质酶的底物（一些β-1,4-糖苷键连接的多糖）特异性

1、将50mg实施例2的步骤一的2得到的干粉溶于10ml pH6.0、0.1mol/L的磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液，得到待测溶液。

2、用步骤一制备得到的各种底物、几丁质、羧甲基纤维素、壳聚糖、乙二醇几丁 质或大麦β-葡聚糖代替1%胶体几丁质，方法参见实施例1的步骤四的3。

结果见表1。

结果表明，Chi92蛋白对1%胶体几丁质、1%大麦β-葡聚糖、1%羧甲基纤维素有 不同程度的降解能力，而与羧甲基纤维素粉末、壳聚糖粉末、虾壳粉末、几丁质粉末、 大麦β-葡聚糖粉末以及乙二醇几丁质粉有微弱的降解能力，但与蟹壳粉反应后没有 检测到还原糖的产生。

表1Chi92蛋白对不同底物的降解能力

底物 Chi92比活（U/mg） 1%胶体几丁质 809.207±2.97 1%大麦葡聚糖 235.554±1.49 1%羧甲基纤维素 139.698±0.0 几丁质（粉末） 38.888±0.0 壳聚糖（粉末） 14.614±0.0 乙二醇几丁质（粉末） 9.660±0.0 大麦葡聚糖（粉末） 12.137±0.0 虾壳粉 10.651±0.0 蟹壳粉 0.0±0.0 羧甲基纤维素 71.583±0.0