一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用

摘要

本发明涉及一种鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用，属于水产养殖技术领域。其筛选出一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株，并通过培养作为益生菌添加制剂添加入饲料或药物中。本发明为一种新型的拮抗菌，其生物活性稳定性、特异性高、对养殖鱼类和环境安全，可作为大宗淡水鱼类养殖中防治嗜水气单胞菌引起暴发性出血病的益生菌株，并可以该菌为主要菌种制备成微生物制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用，具体涉及一种抗活性成分稳定性高，可作为嗜水气单胞菌的拮抗菌及其应用，属于水产养殖技术领域。

背景技术

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, A.hy）隶属气单胞菌科（Aermonadaceae）、气单胞菌属（Aeromonas），该菌存在于水、土壤和水生动物体中。嗜水气单胞菌引起鱼类急性出血性败血症。这种疾病，也称爆发性流行病、出血病、出血性腹水病、腹水病等，能感染淡水主要养殖品种，如草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳜、青鱼、罗非鱼、鳗鲡、白鲫、黄尾鲴、鳊、金鱼、黄鳝等淡水养殖鱼类，是我国流行最广泛的一种水生动物条件致病菌。该菌为革兰阴性短杆菌，极端单鞭毛，无芽孢，无荚膜，散在排列，在0~41℃均能生长，生长的最适pH值范围为5.5~9.0。近年来在我国南方各省淡水养殖鱼类流行暴发性传染病，很多报道系为该菌所致败血症，，嗜水气单胞菌是淡水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原菌之一。

该细菌的防治方法主要包括：抗生素防治、中草药防治、疫苗防控及益生菌防控。1）抗生素防治。抗生素是用来治疗细菌性传染病的首选药物，抗生素对病原菌具有显著的抑制或杀灭作用。研究证实喹诺酮类药物和某些氨基糖苷类药物对嗜水气单胞菌具有较强的抑菌效果。但是随着抗生素的广泛使用，近年来不同地区由于用药种类和用法不同，产生了大量的耐药菌株，抗菌药物敏感性差异很大。2）中草药防治。中草药无抗药性，无残留，无环境污染，不会引发药源性疾病且抑菌杀菌效果明显，已越来越引起人们的关注。研究普遍表明单方使用五倍子、大黄、地榆、辣寥和乌梅、诃子、石榴皮、丁香、大蒜、秦皮、冰片、儿茶、威灵仙等中草药具有很强的抑杀菌能力。在实际生产中，将具有抑菌作用的中草药组合成复方，适当利用不同中草药相互协同作用来防治嗜水气单胞菌引起的疾病，这样可以更好地发挥中草药的抑菌作用。不同的中草药提取加工方法对病原菌的抑菌作用存在影响。3）疫苗防控。水产养殖上使用的疫苗主要分为2类：一类是弱毒疫苗，另一类是死的或灭活的疫苗。弱毒疫苗含有减毒的活病原，能诱导特异性抗体，并与自然感染相似。灭活的疫苗是由死的病原或病原的一些成分如细菌脂多糖或灭活的毒素组成的，能刺激动物的免疫系统。尽管目前可应用嗜水气单胞菌疫苗预防鱼类发生该病，但因该菌血清型众多机体免疫应答水平较低等原因而导致免疫保护效果差或不稳定。4）益生菌防控。随着耐药性问题的出现和环境的恶化使抗生素的使用受到越来越多的考验。与药物控制相比益生菌（probiotic）凭借其无毒高效的优点，通过改善养殖体系的水体环境，在宿主体内分泌营养物质和消化酶，提高宿主的抗病性，改善其免疫系统，降低疾病的发病率，进而提高水产养殖产量和经济效益，正受到越来越多的关注。目前，在水产病害控制上使用较多的益生菌为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和由光合细菌、乳酸菌等多种有益菌种组成的复合活性益生菌。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种新型的拮抗菌，其生物活性稳定性、特异性高、对养殖鱼类和环境安全，可作为大宗淡水鱼类养殖中防治嗜水气单胞菌引起暴发性出血病的益生菌株。

按照本发明提供的技术方案，本发明提供的鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株为解淀粉芽胞杆菌（FFRC-S24），分离自鱼类肠道，该菌拮抗能力强，因分离自鱼体肠道，安全性高。以解淀粉芽胞杆菌（FFRC-S24）为有效活性成分的微生物制剂可以有效拮抗嗜水气单胞菌的感染。

芽孢杆菌通常为嗜温好氧和兼性厌氧，可产生抗逆性内生孢子以耐受各种不良的环境条件，在产品的发酵生产及运输储存上相对其它细菌具有较强的优势。芽孢杆菌作为水产上的益生菌产品在我国已经得到大规模推广应用，其生产工艺和使用流程已非常成熟，并且解淀粉芽孢杆菌在动物饲料工业中作为益生菌添加剂可提高磷的转化率，因此，所述拮抗嗜水气单胞菌的解淀粉芽胞杆菌FFRC-S24将会具有广阔的市场前景。

一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013191，保藏日期为2013年5月9日，分类命名为解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24（Bacillus amyloliquefaciens）FFRC-S24。

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为20μL/L-10mL/L，并于25-30℃培养18-48h，使菌的浓度达到1×10⁹–3×10¹⁰ CFU/mL；LB液体培养基的组分为：酵母提取物4-6g/L, 蛋白胨8-15g/L, 氯化钠8-12g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24搅拌进鱼类饲料中，使得饲料中含有的益生菌浓度为1×10¹⁰–5×10¹² CFU/KG。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24，细菌浓度为1×10⁹-1×10¹¹ CFU/mL，直接泼洒至大宗淡水鱼养殖塘口，泼洒使用量为0. 05- 0.5L/m³。

本发明的有益效果：本发明筛选自解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24的鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株对嗜水气单胞菌的拮抗能力较强，对水产动物安全，作为防治由嗜水气单胞菌引起的大宗淡水鱼类出血病的微生物制剂，具有十分广阔的应用前景。

生物材料样品保藏：一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013191，保藏日期为2013年5月9日，分类命名为解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24（Bacillus amyloliquefaciens FFRC-S24）。

附图说明

图1 实施例3饲料中添加（实验组）和不添加解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）在不同时间段肠道A.hy43的数量。

具体实施方式

实施例1 鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株的体外筛选

在大宗淡水鱼肠道、水环境及底泥中利用LB固体培养基分离细菌，将分离得到的细菌制备成菌悬液，取直径为6mm的小纸片浸泡，晾干后用于细菌筛选。

取指示菌（嗜水气单胞菌）400uL均匀涂布于LB琼脂平板上，将直径为6mm的小纸片浸泡在解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）菌液中，待涂有指示菌的平板自然晾干后，取纸片贴在上面，然后放入25-30℃恒温培养箱中正面朝上培养1h后，进行倒置培养48h。结果显示解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径达7-13mm。

依据相同的操作方法，结果显示解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）对来自于不同来源的嗜水气单胞菌株（发病鱼体、健康鱼体、水体、底泥）都具有拮抗能力。解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）对水产养殖中常见的其他病原菌：维氏气单胞菌、副溶血弧菌、鮰鱼爱德华氏菌、海豚链球菌、无乳链球菌无明显的拮抗现象。

实施例2

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为20μL/L，并于25℃培养48h，使菌的浓度达到1×10⁹ CFU/mL；

    LB液体培养基的组分为：酵母提取物4g/L, 蛋白胨8g/L, 氯化钠8g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24搅拌进鱼类饲料中，使得饲料中含有的益生菌浓度为1×10¹⁰ CFU/KG。

实施例3

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为10mL/L，并于30℃培养18h，使菌的浓度达到2×10¹⁰ CFU/mL；

LB液体培养基的组分为：酵母提取物6g/L, 蛋白胨10g/L, 氯化钠12g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24搅拌进鱼类饲料中，使得饲料中含有的益生菌浓度为3×10¹² CFU/KG。

实施例4

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为5mL/L，并于28℃培养30h，使菌的浓度达到3×10¹⁰ CFU/mL；

LB液体培养基的组分为：酵母提取物5g/L, 蛋白胨10g/L, 氯化钠10g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24搅拌进鱼类饲料中，使得饲料中含有的益生菌浓度为5×10¹² CFU/KG。

实施例5

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为1mL/L，并于26℃培养48h，使菌的浓度达到2.5×10¹⁰ CFU/mL；LB液体培养基的组分为：酵母提取物4g/L, 蛋白胨8g/L, 氯化钠12g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24，细菌浓度为1×10¹⁰ CFU/mL，直接泼洒至大宗淡水鱼养殖塘口，泼洒使用量为0. 05L/m³。

实施例6

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为3mL/L，并于27℃培养25h，使菌的浓度达到1×10¹⁰ CFU/mL；LB液体培养基的组分为：酵母提取物6g/L, 蛋白胨15g/L, 氯化钠8g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24，细菌浓度为9×10⁹ CFU/mL，直接泼洒至大宗淡水鱼养殖塘口，泼洒使用量为0.2L/m³。

实施例7

取解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24接种于LB液体培养基，接种量为8mL/L，并于29℃培养31h，使菌的浓度达到3×10¹⁰ CFU/mL；LB液体培养基的组分为：酵母提取物6g/L, 蛋白胨15g/L, 氯化钠12g/L。

将接种于LB液体培养基的解淀粉芽孢杆菌FFRC-S24，细菌浓度1×10¹¹ CFU/mL，直接泼洒至大宗淡水鱼养殖塘口，泼洒使用量为0.4L/m³。

    实施例3  解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）对肠道病原抑制作用

将A.hy43于30℃ LB液体培养基中振荡培养18h，将其投入到水族箱中，使得水族箱中嗜水气单胞菌的浓度达到10⁷ CFU/mL，浸泡一天后取三尾团头鲂进行肠道采样，记为0h。然后将A.hy43^GFP浸泡过的团头鲂分为两组，放入新的水族缸中，一组为实验组，一组为对照组。

实验组投喂拌有益生菌S24的饲料，对照组投喂普通饲料，分别在12h、24h、36h、48h取实验组和对照组各3尾鱼，在酒精灯旁，无菌操作采集团头鲂前、中、后肠各约1cm，置于灭菌后的1.5 mL离心管，称重。

将采集肠道用灭菌生理盐水进行洗涤，之后分别加入2mL灭菌生理盐水进行匀浆。将匀浆液用灭菌生理盐水分别稀释10倍、100倍、1000倍，取3个梯度的稀释液体以及组织原液各100 μL均匀涂布于含有卡那霉素的LB营养琼脂平板(含有卡那霉素60 μg/mL)，置于30 °C生化培养箱中培养18 h。在荧光显微镜下观察菌落荧光，并计数。

结果显示实验组肠道中A.hy43的数量均少于对照组。0-12h间，嗜水气单胞菌的数量处于下降阶段，12h后各组的细菌量均开始增加。但投喂S24的实验组增加速度较对照组慢。

具体数据如表1所示。

表1 饲料中添加（实验组）和不添加解淀粉芽孢杆菌（FFRC-S24）在不同时间段肠道A.hy43的数量

实施例4 保护率实验

选择30尾体重 75±0.5g的健康团头鲂，在水族箱中进行暂养7d，开始试验。试验分为两组，每组各15尾。对照组投喂普通饲料，实验组投喂2.1含解淀粉芽孢杆菌饲料。投喂2w后，分别用A.hy43进行浸泡攻毒，每个水族缸中的A.hy43浓度为10⁷CFU/ml，饲养观察 7d，统计各组的死亡率，依下式计算免疫保护率。免疫保护率 （RPS）=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100%。

各组的死亡量见表2，从表中我们计算得到S24的保护率为60%。

表2 保护率实验结果

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