一种用两阶段溶氧控制技术提高发酵生产柠檬酸产量的方法

摘要

本发明公开了一种分两阶段溶氧控制技术提高发酵生产柠檬酸产量的方法，属于发酵过程优化领域。在发酵的第一阶段（28-32h）控制溶氧在45-55%，在发酵的第二阶段（37-50h）控制溶氧在35-45%，用此两阶段溶氧控制工艺，柠檬酸产量得到显著提高，其糖酸转化率最高为99%，而对照实施例的糖酸转化率为86%。本发明所提供的两阶段溶氧控制发酵工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对其它有机酸的发酵法生产就有一定的指导和启迪意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分两阶段控制溶氧提高发酵生产柠檬酸产量的方法，属于发酵过程优化领域。 

背景技术

柠檬酸(Citric acid)，又名枸橼酸，是一种三元羧酸，其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，是三羧酸循环中的中间代谢产物。柠檬酸在自然界中分布广泛，主要存在于柠檬、柑橘、梅子等果实中，具有令人愉悦的酸味，能刺激味觉。在行业中被称为第一食用酸剂［孙荣，王燕，杨平平.柠檬酸发酵现状及展望.中国调味品2011,36(001):90-92.］，广泛用于各种饮料、果汁、汽水、罐头、点心、蛋糕饼干、酒类、乳制品等食品的制造，在化工、制药、纺织业中也有广泛的应用，是目前世界上需求量最大的一种有机酸［冯志合，卢涛.中国柠檬酸行业概况.中国食品添加剂2011(3):158-163.］。 

柠檬酸是典型的生物发酵产品，是目前产量最大的发酵产品之一。目前，其主要生产方法为微生物深层发酵法。柠檬酸发酵的工业生产已经发展多年并且基本形成了成熟的生产工艺，目前中国由于生产工艺技术较先进、劳动力成本低廉等原因处于柠檬酸行业的领先地位，是柠檬酸的主要生产国和出口国。但是相对来说，目前的柠檬酸发酵工艺还是很粗放的，例如没有对溶氧水平的精细控制，为提高产量过度提高培养基的营养条件，粮耗依然很高等等。目前对微生物发酵法生产柠檬酸的研究主要集中于发酵条件的优化，如低值原料的开发培养基的优化［代真真，周勇，刘玉伟等.柠檬酸发酵过程中液化条件的影响.食品与生物技术学报2011,30(5):723-727.］、菌体固定化的研究［Demirel G，KO，A.The production of citric acid by using immobilized Aspergillus niger A-9and investigation of its various effects.Food chemistry2005,89(3):393-396.］以及菌种的改造优化等等［任晓莉，赵林，杨宝强等.UV和NTG复合诱变柠檬酸生产菌种黑曲霉.天津大学学报2010,43(006):553-556.］。 

对于柠檬酸发酵而言，溶氧有着重要的影响，因此溶氧的控制方式对柠檬酸的产量的提高至关重要。文献报道的溶氧水平优化大部分为对通气量的研究，搅拌转速关联的溶氧水平优化方面的研究很少，利用两阶段溶氧控制方式提高柠檬酸的产量，尚未见文献报道。工业生产工艺中溶氧水平单一控制，不能够使黑曲霉以最优的生长代谢水平产生最大量的柠檬酸，所以有必要开发一种更加有效的供氧提高发酵水平。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种两阶段溶氧控制策略提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，提高原料与设备的利用率、缩短发酵所需时间，以显著提高柠檬酸的产量。 

所述黑曲霉Aspergillus nigerH915-1于2013年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013172，保藏地址为中国武汉武汉大学。 

所述用两阶段溶氧控制技术提高发酵生产柠檬酸产量的方法，是在发酵第一阶段控制溶氧为45-55%，在发酵第二阶段控制溶氧为35-45%；所述发酵第一阶段时间为28-32h；所述发酵第二阶段时间为37-50h。 

所述用两阶段溶氧控制技术提高发酵生产柠檬酸的产量的方法，包括以下步骤： 

（1）将黑曲霉先转茄子瓶斜面培养基在37℃培养箱中培养72h，然后将孢子用无菌水洗下接种到含有35L发酵培养基的50L种子罐，溶氧控制为DO40%，温度37℃，发酵培养24h，使黑曲霉孢子萌发生长，最终发酵液pH下降到2以下； 

（2）之后将种子发酵液转接到含有350L发酵培养基的500L发酵罐，接种量10%，在发酵的第一阶段控制溶氧水平50%左右，在发酵的的第二阶段控制溶氧水平40%左右；所述发酵第一阶段时间为28-32h；所述发酵第二阶段时间为37-50h。 

所述茄子瓶斜面培养基为黑曲霉专用的木薯原料天然培养基，由宜兴协联生物化学公司提供。 

所述发酵培养基为玉米浆，玉米清液，控制总糖为15%(g/g)，总氮为0.08%(g/g)，其中玉米清液是通过板框压滤机过滤玉米混液得到的，玉米混液是含糖量很高的淀粉酶处理过的玉米粉液。 

所述50L种子罐及500发酵罐（中国船舶重工集团公司第七0二研究所设计，型号GSW702-S0906017-00）。 

本发明的有益效果：利用所述两阶段溶氧控制发酵工艺，糖酸转化率高达99%，不仅能显著提高柠檬酸的产量，且工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对其它有机酸的发酵法生产具有一定的指导和启迪意义。 

具体实施方式

菌种：黑曲霉（A.nigerH915-1），中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M2013172。 

接种方式：采用孢子接种，菌种保藏采用茄子瓶斜面保藏，接种时用无菌去离子水将孢子洗下并用血球计数板对孢子悬液计数。发酵过程采用二级发酵，孢子先接种子培养基，接 种量为每毫升培养基接种30万个孢子，培养约24小时后转接发酵培养基，接种量为10%。 

发酵罐：3L NBS全自动发酵罐、50L种子罐及500L中试罐。 

茄子瓶斜面培养基为黑曲霉专用的木薯原料天然培养基。 

种子培养基为：玉米浆，硫酸铵，控制总糖为10%，总氮为0.2%。 

发酵培养基为:玉米浆，玉米清液，控制总糖为15%(g/g)，总氮为0.08%(g/g)，其中玉米清液是通过板框压滤机过滤玉米混液得到的，玉米混液是含糖量很高的淀粉酶处理过的玉米粉液。 

糖酸转化率测定及计算方法： 

其中总酸为发酵结束后测定的发酵液总酸含量，总糖为接种后发酵液总糖含量。 

总酸测定方法：称取1g左右的发酵过滤清液，然后用0.1429mol/L的NaOH滴定至终点，记下所消耗的体积V，即为发酵总酸单位%(g/g)。 

总糖测定方法：菲林法测定。具体方法如下： 

(1)总糖制备：在天平上准确称取一定质量的样品（记为m，一般样品10g，），加50ml去离子水，使样品浸润，搅拌均匀后用移液管吸取7.5ml的浓硫酸，加热至沸，保持沸腾5min，在冰水中急剧冷却，用40%的浓氢氧化钠中和pH至7-8，用去离子水定容至1000ml，待测定。 

(2)取费林甲乙液各5mL于干燥洁净的100mL三角瓶中，预加适量的0.1%标准葡萄糖溶液（记为c），加热至沸，然后以2.5-3.5秒的速度滴定到蓝色消失，沸腾后滴定所消耗的0.1%葡萄糖标准溶液体积在0.30至0.65mL，否则应重新滴定，预滴定的体积加上微滴定的体积作为空白V_o。 

(3)取费林甲乙液各5mL于干燥洁净的100mL三角瓶中，吸取5mL的样品（记为V_s，根据溶液浓度可减少体积）于100mL三角瓶中，根据估计的溶液浓度预加入一定体积的标准葡萄糖，然后加热至沸，以2.5-3.5秒的速度滴定到蓝色消失，预滴定的体积加上微滴定的体积作为样品的滴定体积V₁。 

计算公式 

溶氧控制方法：DO值为相对溶氧值，发酵开始时进行调零，接种稳定后设置DO值为 100%，通过发酵罐自动控制装置将DO值与搅拌转速关联，保持DO值动态稳定在设定值，如30%、40%。 

对照实施例13L发酵罐恒定溶氧发酵 

将黑曲霉孢子转接到茄子瓶斜面，在37℃培养箱中培养72h，然后转接到含有40mL种子培养基的250mL摇瓶中，35℃、转速300rpm条件下摇瓶发酵约24h，使黑曲霉孢子萌发生长，最终发酵液pH下降到2以下；再转接4瓶种子培养液到含有1.6L发酵培养基的3L发酵罐中，37℃，搅拌转速与溶氧水平DO相关联，控制DO40%，通气速率3.0vvm，进行发酵72h左右，使还原糖浓度下降到0.5%以下。对照实施例1最终糖酸转化率为86%。 

对照实施例2500L发酵罐恒定溶氧发酵 

将黑曲霉先转茄子瓶斜面在37℃培养箱中培养72h，然后将孢子用50-100ml无菌水洗下接种含有35L发酵培养基的50L种子罐，溶氧控制为DO40%，温度37℃，发酵培养24h，使黑曲霉孢子萌发生长，最终发酵液pH下降到2以下。之后将种子发酵液转接到含有350L发酵培养基的500L发酵罐，接种量10%，温度37℃，溶氧控制为DO40%，通气速率3.0vvm。对照实施例2的最终糖酸转化率为90%。 

实施例13L发酵罐两阶段溶氧发酵 

3L发酵罐发酵采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前30h）控制溶氧在55%，在发酵第二阶段（40h）控制溶氧在45%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到93%。其余发酵条件与对照实施例1相同。 

实施例23L发酵罐两阶段溶氧发酵 

3L发酵罐发酵采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前32h）控制溶氧在50%，在发酵第二阶段（40h）控制溶氧在40%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到95%。其余发酵条件与对照实施例1相同。 

实施例33L发酵罐两阶段溶氧发酵 

3L发酵罐发酵采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前28h）控制溶氧在45%，在发酵第二阶段（50h）控制溶氧在35%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到90%。其余发酵条件与对照实施例1相同。 

实施例4500L发酵罐两阶段溶氧发酵 

500L发酵罐采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前32h）控制溶氧在50%，在发酵第二阶段（40h）控制溶氧在40%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到99%。其余发酵条件与对照实施例2相同。 

实施例53L发酵罐两阶段溶氧发酵 

3L发酵罐发酵采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前32h）控制溶氧在55%，在发酵第二阶段（37h）控制溶氧在45%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到89%。其余发酵条件与对照实施例1相同。 

实施例63L发酵罐两阶段溶氧发酵 

3L发酵罐发酵采用两阶段培养法，在发酵第一阶段（前30h）控制溶氧在55%，在发酵第二阶段（50h）控制溶氧在45%。用此两阶段溶氧控制策略发酵生产柠檬酸，其糖酸转化率提高到90%。其余发酵条件与对照实施例1相同。 

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。