基于优化发酵培养基及微生物代谢组学方法提高Hygrocin A产量的研究

摘要

链霉菌可以产生多种抗菌、防霉、抗病毒、抗肿瘤活性、具有降压和免疫抑制剂性能的次级代谢产物，因此链霉菌被誉为“天然药物的合成工厂”。研究发现Streptomyces hygroscopicus ATCC29253的一种次级代谢产物hygrocin A具有抗菌活性，其降解产物hygrocin C，D和F对乳腺癌细胞MDA-MB-431及前列腺癌细胞PC3具有显著的细胞毒性。因此提高hygrocin A发酵产量对于hygrocin A后期应用研究具有重要的意义。本研究的工作重点在于采用优化发酵工艺技术以及基于微生物代谢组学平台调控技术提高hygrocinA的产量，主要研究内容及结果如下:
　　1)采用单因素实验与正交试验相结合的方式，优化hygrocinA发酵培养基M3配方如下:葡萄糖4g/L，黄豆饼粉8g/L，麦芽提取物10g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgCl21 g/L，NaCl1.5 g/L。同时由hygrocin A产素曲线可知，Sreptomyces hygroscopicus ATCC29253发酵10天时hygrocin A产量达到最高，种子最佳活化时间为48 h。评价优化后的培养基M3中hygrocin A产量是原培养基M10中的6倍。并且，优化后的M3发酵培养基同时表达雷帕霉素（已商业化的一种新型大环内酯类免疫抑制剂），产量可达雷帕霉素原培养基M2中产量的62.78％。
　　2)借助微生物代谢组学与外源添加相结合的方法，优化hygrocin A的发酵工艺，提高发酵产量，并与优化培养基的方法做对比。针对S.hygroscopicus ATCC29253建立一套合适的微生物代谢组学方法平台，即对常见代谢物用快速过滤法淬灭、-40℃预冷的50％甲醇反复冻融浸提、50％甲醇复溶;对胞内短链-CoA用快速过滤法淬灭、15％ TCA抽提、Waters Oasis(R)HLB固相萃取、0.1M甲酸铵∶甲醇(95∶5)复溶。监控发酵过程中与雷帕霉素及hygrocin A生物合成相关胞内代谢物的变化情况，推测相应的代谢物关系谱图。在发酵过程中添加莽草酸、赖氨酸及丁二酸钠到发酵液中，雷帕霉素在外源添加培养基中产量均明显高于未添加培养基，且在发酵培养基M10中的产量明显高于在优化后M3培养基中的产量;同时hygrocin A产量在外源添加培养基中也明显高于未添加培养基，在发酵培养基M10中的产量明显低于在优化后M3培养基中的产量。在优化培养基的基础上继续应用微生物代谢组学及外源添加的技术，可以在提高雷帕霉素产量的基础上进一步提高hygrocin A产量。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1 链霉菌

2 链霉菌次级代谢产物

2．1 链霉菌次级代谢产物分类

2．2 链霉菌次级代谢产物的生物合成

3 影响链霉菌次级代谢产物的发酵条件

3．1 培养基

3．2 环境因素

4 微生物代谢组学

4．1 微生物代谢组学平台的建立

4．2 代谢组学在微生物研究中的应用

5 选题的依据及意义

第二章 正交试验设计优化提高S．hygroscopicus产Hygrocin A量的研究

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 Hygrocin A及雷帕霉素产素曲线

3．2 Hygrocin A发酵条件优化

3．3 优化后M3培养基产素能力

4 小结

第三章 基于代谢组学分析调控提高S．hygroscopicus产Hygrocin A量的研究

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 S．hgy菌种生长曲线及hygrocin A产素曲线

3．2 S．hyg胞内代谢小分子检测

3．3 S．hyg胞内代谢小分子变化趋势

3．4 代谢关系图

3．5 外源添加对hygrocin A及雷帕霉素产量的影响

4 小结

总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

附录

致谢