一种乙型肝炎表面抗原的纯化方法

摘要

本发明提供了一种乙型肝炎表面抗原的纯化方法，所述方法是通过疏水层析对含有乙型肝炎表面抗原的粗提液进行纯化的，其中，所述的疏水层析采用的介质是C4整体材料。本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：C4整体材料对HBsAg的收率最大可达到86％。此外，C4整体材料在重复使用性和层析速度上都优于传统介质。

说明书

技术领域

本发明属于乙肝病毒疫苗领域，更具体而言，涉及一种乙型肝炎表面抗原的纯化方法。

背景技术

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)组成乙型肝炎病毒(HBV)的包膜，而乙型肝炎病毒感染人体后引起乙型肝炎。控制乙型肝炎病毒感染的最有效的途径就是接种乙型肝炎疫苗。乙型肝炎表面抗原作为乙型肝炎疫苗的主要有效成分，有adr、adw、ayw和ayr四种血清型。其中欧美国家人群感染的乙型肝炎病毒以adw亚型为主，而我国则主要是adr亚型。

在实际生产中乙型肝炎表面抗原的纯化工艺主要采用的是(例如)美国默克公司的重组酵母乙型肝炎疫苗生产技术。其采用的是酿酒酵母表达乙型肝炎表面抗原，之后的纯化工艺通常主要包括以下步骤：破碎细胞；微滤除去细胞碎片；超滤除去小分子蛋白；硅胶吸附以及疏水层析。

其中，疏水层析也称为疏水性相互作用层析(hydrophobicinteraction chromatography，HIC)，是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相介质，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用，来进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析方法。常用的疏水性配基主要有苯基、烷基、聚乙二醇和聚醚等。配基中含有的苯环数越多，疏水作用越强，配基的疏水链越长，疏水作用也越强。常用基团疏水作用强弱的顺序是：丁基(C4)＜辛基(C8)＜苯基(强弱顺序可参见张延龄、张晖主编的《疫苗学》(第三版))，疏水作用与配基的疏水性和配基的密度成正比。不同金属离子对蛋白质的疏水性吸附影响不同，高价阴离子盐析作用大，其作用的强弱顺序如下：阴离子：PO₄^3-＞SO₄^2-＞Ac^-＞Cl^-＞Br^-＞ClO₄^-＞I^-＞SCN^-；阳离子：Ba²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞Li⁺＞Cs⁺＞Na⁺＞K⁺＞Rb⁺＞NH₄⁺。因此，在疏水层析相互作用分离蛋白的层析过程中，主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠盐溶液为流动相。在略低于盐析点的浓度下上样，经过层析柱使蛋白质和疏水性的介质作用而结合，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱。

Butyl-Sepharose 4B(丁基琼脂糖4B)是现有的HBsAg纯化工艺中使用的疏水层析介质，其凝胶颗粒的网孔结构是由琼脂糖形成束状结构后产生的，维持该结构的作用力是链状琼脂糖分子之间的氢键。由于没有交联剂的存在，决定凝胶颗粒网孔大小的因素是形成凝胶时琼脂糖的含量。Sepharose 4B的琼脂糖含量为4％，颗粒大小为45～165μm。该技术的收率较高，可达80-90％，但是，其在纯化HBsAg过程中存在以下缺陷：层析速度较慢，一般为每小时一个柱床体积，而且无法重复利用，或重复利用后无法达到生产工艺的指标要求，由此造成了实际生产的成本过高，因此需要寻求更为合适的疏水层析介质。

整体色谱柱(Monoliths)是一种利用聚合作用形成完整连续固定相的新技术，被誉为是第四代层析填料。与传统的颗粒填充介质相比，不需要填装，制备简单，载量高，物质传输速度快。其中，C4整体材料(Monoliths C4)是以丁基为配基的由聚甲基丙烯酸酯基质构成的一整片均一的连续固定相材料，以之作为层析柱床用于纯化分离，具有高流速、高载量和高分辨率的特点。但是，在现有的HBsAg纯化方法中，还没有报道过可采用Monoliths层析介质代替Butyl-Sepharose 4B层析介质，其原因主要在于：在纯化HBsAg的过程中，使用Monoliths层析介质极易出现流穿现象，即无法吸附HBsAg，或所得的收率过低，例如洗脱率为约45％或以下，无法达到疫苗生产工艺的指标要求，由此限制了Monoliths层析介质在HBsAg的纯化工艺中的使用。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种乙型肝炎表面抗原的纯化方法。

具体而言，本发明提供：

(1)一种乙型肝炎表面抗原的纯化方法，所述方法是通过疏水层析对含有乙型肝炎表面抗原的粗提液进行纯化的，其中，所述的疏水层析采用的介质是C4整体材料。

(2)根据(1)所述的方法，其中，所述的疏水层析中所用的上样缓冲液的pH为7.0-7.4，并且所述的上样缓冲液中含有2.5％-4.5％的硫酸铵。

(3)根据(2)所述的方法，其中，所述的上样缓冲液含有50mM-200mM的3-(N-吗啉)丙磺酸，并且所述的上样缓冲液的pH为7.2-7.4。

(4)根据(3)所述的方法，其中，所述的上样缓冲液含有2.5-3.5％的硫酸铵。

(5)根据(3)所述的方法，其中，所述的上样缓冲液含有3％的硫酸铵以及50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸。

(6)根据(2)所述的方法，其中，所述的上样缓冲液为含有3.5-4.5％硫酸铵的PB缓冲液，其中所述PB缓冲液的浓度为20mM-200mM，并且所述的上样缓冲液的pH为7.0-7.2。

(7)根据(6)所述的方法，其中，所述的上样缓冲液含有4％的硫酸铵。

(8)根据(1)所述的方法，其中，所述的疏水层析的洗脱缓冲液含有0.08-0.12％Triton X-100以及50mM-200mM的3-(N-吗啉)丙磺酸，并且所述的洗脱缓冲液的pH为7.2-7.4。

(9)根据(8)所述的方法，其中，所述的疏水层析的洗脱缓冲液含有0.1％的Triton X-100以及50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸。

(10)根据(1)-(9)任一项所述的方法，其中，所述的方法包括以下步骤：

1)提供含有乙型肝炎表面抗原的粗提液；

2)将步骤1)所述的含有乙型肝炎表面抗原的粗提液中的缓冲液置换为上样缓冲液，从而得到上样样品；

3)将步骤2)得到的上样样品在平衡后的C4整体材料上进行上样，以使所述的C4整体材料吸附所述的乙型肝炎表面抗原；

4)用上样缓冲液充分流洗步骤3)得到的已经吸附乙型肝炎表面抗原的C4整体材料，以洗掉未与所述C4整体材料充分结合的上样样品；以及

5)用洗脱缓冲液对步骤4)得到的C4整体材料进行洗脱，以将所述的乙型肝炎表面抗原从所述的C4整体材料洗脱下来，从而得到纯化后的乙型肝炎表面抗原。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

相对于传统的颗粒形状的基质材料，本发明所采用的介质(C4整体材料)是整体的高度多孔材料。在乙型肝炎表面抗原的纯化工艺中，单一连续结构使本发明所采用的介质具有极高的稳定性和耐压性，相对于传统介质小于0.5MPa的耐压范围，本发明所采用的介质的层析柱可以耐受2-10MPa的压力。高度互连的孔状介质中不存在流动相盲端，从而突破了物质传输的扩散限制，使本发明所采用的介质的动态结合能力和分辨率不受流速的影响。例如，本发明实施例中具体采用的Monoliths C4的孔径均一，大小在1.5μm左右，适合乙型肝炎表面抗原等生物大分子的纯化，保证了在极高流速下(30CV/min)，巨大生物分子和抗原颗粒都能以很高的结合力与该介质上的相应功能基团结合。

此外，在相同的使用次数后(再生大于10次)，本发明所采用的介质仍然能保持很好的效能，所以本发明所采用的介质比传统介质重复使用性更好。在现有的实验数据中，传统介质，例如Workbeads3147L介质对HBsAg的收率最大仅能达到43％，虽然Butyl-Sepharose4B对HBsAg的收率初次使用可以达到80-90％，但是再次使用不到75％，而本发明所采用的介质对HBsAg的收率最大可达到86％，经多次使用后对HBsAg的收率也能大于75％。除此之外，本发明所采用的介质由于采用的是整片均一连续结构，在高流速下不影响分辨率和结合能力。因此综上所述，本发明所采用的介质在重复使用性、收率和层析速度上都优于传统介质。

附图说明

图1为Monoliths C4在MOPS上样缓冲液条件下的上样层析图；其中，a中的上样缓冲液含50mM MOPS；b中的上样缓冲液含2％硫酸铵以及50mM MOPS；c中的上样缓冲液含3％硫酸铵以及50mM MOPS；d中的上样缓冲液含4％硫酸铵以及50mM MOPS；其中，a、b、c、d中的洗脱缓冲液均为含0.1％Triton X-100以及50mMMOPS的洗脱缓冲液；FT表示的是上样流穿峰；E表示的是含0.1％Triton X-100的50mM MOPS的洗脱峰；X轴表示的是从上样到洗脱的流出体积，Y轴表示的是280nm的吸光度值。

图2为Monoliths C4在PB上样缓冲液条件下的上样层析图；其中，a中的上样缓冲液为含3％硫酸铵的20mM PB缓冲液，洗脱缓冲液为含0.1％Triton X-100以及50mM MOPS的洗脱缓冲液；b中上样缓冲液为含4％硫酸铵的20mM PB缓冲液，洗脱缓冲液为含0.1％Triton X-100以及50mM MOPS的洗脱缓冲液；c中上样缓冲液为含3％硫酸铵的20mM PB缓冲液，洗脱缓冲液为含0.1％TritonX-100的20mM PB缓冲液；d中上样缓冲液为含4％硫酸铵的20mMPB缓冲液，洗脱缓冲液为含0.1％Triton X-100的20mM PB缓冲液；FT表示的是上样流穿峰；E表示的是洗脱缓冲液洗脱峰；X轴表示的是从上样到洗脱的流出体积，Y轴表示的是280nm的吸光度值。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明中所述的“C4整体材料”是指以丁基为配基并且以聚甲基丙烯酸酯作为基质而形成的一整片均一的连续固定相材料，例如(但是本发明不限于此)，奥地利BIA Separation公司的Monoliths C4介质。

本发明中所述的“MOPS”是指3-(N-吗啉)丙磺酸。

本发明中所述的“％”是指重量/体积％(W/V)，其中该重量/体积％可按每100ml溶液体积所含溶质的克重数计算得到。

本发明所述的“PB缓冲液”是指磷酸盐缓冲液，其浓度可根据需要进行配制，pH分布5.7-8.0，根据其pH的差别其磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的含量有所不同。

本发明中的含有乙型肝炎表面抗原的粗提液(或粗制纯化样品)采用的是将表达HBsAg的微生物细胞(例如，酿酒酵母细胞)发酵液经细胞破碎后，除去了细胞碎片和小分子蛋白的粗提液，但是本发明不限于此，也可采用其它的含有乙型肝炎表面抗原的粗提液。

由于Monoliths层析介质具有诸多优点，因此迫切需求其在HBsAg纯化工艺中能够得以有效地应用，针对前述的现有技术中存在的问题，采用合适的Monoliths层析介质是实现在HBsAg纯化工艺中应用Monoliths层析介质的关键，本发明人由此进行了多方面的实验，最终确认了C4整体材料。本发明人通过实验进一步证实了采用C4整体材料不仅能够大幅提高HBsAg的收率，而且可以加快层析速度，并可重复使用次数。本发明所采用的C4整体材料的例子可包括但不限于奥地利BIA Separation公司的Monoliths C4整体柱。

此外，针对HBsAg纯化过程中容易出现的流穿现象，本发明人进行了深入研究，最终发现所用的上样缓冲液的pH和是否含有硫酸铵对于C4整体材料能否吸附HBsAg具有显著的影响。具体而言，本发明人发现，所述的疏水层析中所用的上样缓冲液的pH为7.0-7.4，并且所述的上样缓冲液中硫酸铵的含量为2.5％-4.5％时，能够实现流穿率低于15％。

优选的是，所述的上样缓冲液含有50mM-200mM的3-(N-吗啉)丙磺酸，并且所述的上样缓冲液的pH为7.2-7.4。更优选的是，所述的上样缓冲液含有2.5-3.5％的硫酸铵。最优选的是，所述的上样缓冲液含有3％的硫酸铵以及50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸。

优选的是，所述的上样缓冲液为含有3.5-4.5％硫酸铵的PB缓冲液，其中所述PB缓冲液的浓度为20mM-200mM，并且所述的上样缓冲液的pH为7.0-7.2。更优选的是，所述的上样缓冲液含有4％的硫酸铵。

其中，与含MOPS的上样缓冲液相比，含PB的上样缓冲液中需要加入更高浓度的硫酸铵才能实现HBsAg吸附在Monoliths C4疏水柱上；而在20mM PB中加入0.1％Triton X-100对HBsAg的洗脱效果不如含有0.1％Triton X-100的50mM MOPS，这进一步表明50mM MOPS缓冲系统比20mM PB缓冲系统更适用于HBsAg疏水层析。

优选的是，所述的疏水层析的洗脱缓冲液含有0.08-0.12％TritonX-100以及50mM-200mM的3-(N-吗啉)丙磺酸，并且所述的洗脱缓冲液的pH为7.2-7.4。更优选的是，所述的疏水层析的洗脱缓冲液含有0.1％的Triton X-100以及50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸。

优选的是，本发明所述的方法包括以下步骤：

1)提供含有乙型肝炎表面抗原的粗提液；

2)将步骤1)所述的含有乙型肝炎表面抗原的粗提液中的缓冲液置换为上样缓冲液，从而得到上样样品；

3)将步骤2)得到的上样样品在平衡后的C4整体材料上进行上样，以使所述的C4整体材料吸附所述的乙型肝炎表面抗原；

4)用上样缓冲液充分流洗步骤3)得到的已经吸附乙型肝炎表面抗原的C4整体材料，以洗掉未与所述C4整体材料充分结合的上样样品；以及

5)用洗脱缓冲液对步骤4)得到的C4整体材料进行洗脱，以将所述的乙型肝炎表面抗原从所述的C4整体材料洗脱下来，从而得到纯化后的乙型肝炎表面抗原。

疏水层析中所用的缓冲液中的pH通常调至中性(7-8)左右。虽然样品的本身的疏水性质的影响更大，但是疏水层析缓冲液pH的改变会影响蛋白表面的电荷进而影响蛋白的吸附。所以，本发明中所用的各种缓冲液也都有一个最适的范围，其中，本发明人通过实验发现：本发明中适合的含MOPS的缓冲液的pH范围是7.2-7.4，适合的含PB的缓冲液的pH范围是7.0-7.2。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

在以下实施例中，HBsAg粗提液样品可由北京天坛生物制品股份有限公司制备，其制备方法为：将表达HBsAg的酵母细胞发酵液经高压匀浆破碎、0.2μm膜微滤、300KD超滤膜超滤、再经硅胶吸附提取后制备而成。

在以下实施例中，超滤装置100KD Vivaflow 50可购自德国赛多利斯公司。C4整体材料采用的是0.34ml的Monoliths C4型疏水层析预装柱(CIM Monoliths C4 Disk)，可由奥地利BIA Separation公司提供；MOPS可得自美国Sigma公司；Triton X-100可得自美国Sigma公司；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)可得自国药集团化学试剂有限公司。

在以下实施例中，例如，可采用以下方法制备所需缓冲液：PB缓冲液采用pH为7.0的20mM PB缓冲液配方，含有各种浓度的硫酸铵的上样缓冲液为在pH为7.0的缓冲液里加入不同浓度的硫酸铵，然后再用1mol/L NaOH调节pH至7.0；洗脱缓冲液为在pH为7.0的20mM MOPS中加入0.1％(W/V)的Triton X-100，然后再用1mol/LNaOH调节pH至7.0。含有各种浓度的硫酸铵的MOPS上样缓冲液可以是在pH为7.4的MOPS溶液里加入不同浓度的硫酸铵，然后再用1mol/L NaOH调节pH至7.4；含有各种浓度的硫酸铵的MOPS洗脱缓冲液可以是在pH为7.4的50mM MOPS中加入0.1％(W/V)的Triton X-100，然后再用1mol/L NaOH调节pH至7.4。

在以下实施例中，乙型肝炎表面抗原的含量可通过科华生物工程有限公司的ELISA检测HBsAg试剂盒进行测定。

实施例1

1.1实验方法

1.1.1主要仪器和设备

Purifier 100型纯化系统，可得自美国GE公司。

1.1.2试验方法

1.1.2.1BIA Separation公司Monoliths C4型疏水层析预装柱(以下均简称为CIM Monoliths C4 Disk)纯化HBsAg

(1)以MOPS体系作为上样缓冲液

分别以50mM MOPS以及含有2％、3％和4％硫酸铵(A.S)的50mM MOPS作为上样缓冲液，以含有0.1％Triton X-100的50mMMOPS作为洗脱缓冲液，进行试验。具体实验步骤为：

1)通过超滤装置100KD Vivaflow 50，将含有乙型肝炎表面抗原的粗提液中的缓冲液置换为上样缓冲液，置换流速为50ml/min，从而制备得到上样样品；

2)用上样缓冲液将CIM Monoliths C4充分平衡，其中UV基线稳定后所用上样缓冲液体积应大于五个柱床体积；

3)将步骤1)得到的上样样品在步骤2)平衡好的CIM MonolithsC4介质上上样，以使所述的CIM Monoliths C4介质吸附所述的乙型肝炎表面抗原，其中，上样流速分别为2ml/min；

4)用上样缓冲液充分流洗步骤3)得到的已经吸附乙型肝炎表面抗原的CIM Monoliths C4，以洗掉未与所述CIM Monoliths充分结合的上样样品，所用的上样缓冲液体积大于两个柱床体积；

5)用洗脱缓冲液对步骤4)得到的Monoliths C4介质进行洗脱，以将所述的乙型肝炎表面抗原从所述的Monoliths C4介质洗脱下来，其中，洗脱流速分别为2ml/min，从而得到纯化后的乙型肝炎表面抗原。

(2)以PB缓冲液体系作为上样缓冲液

1)以PB缓冲液作为上样缓冲液，以含有0.1％Triton X-100的50mM MOPS作为洗脱缓冲液

分别以含有3％和4％硫酸铵的20mM PB作为上样缓冲液，以含有0.1％Triton X-100的50mM MOPS作为洗脱缓冲液，进行试验。具体实验步骤参见步骤(1)，上样和洗脱流速分别为2ml/min。

2)以PB缓冲液作为上样缓冲液，以含有0.1％Triton X-100的20mM PB作为洗脱缓冲液

分别以含有3％和4％硫酸铵的20mM PB作为上样缓冲液，以含有0.1％Triton X-100的20mM PB作为洗脱缓冲液，进行试验。具体实验步骤见步骤(1)，上样和洗脱流速分别为2ml/min。

(3)流穿率、洗脱率的计算公式：

1.2实验结果

1.2.1CIM Monoliths C4Disk在MOPS缓冲液条件下试验结果

用50mM MOPS缓冲液上样后，出现了HBsAg上样流穿率大于100％的情况，可能由于HBsAg含量检测出现误差所致；如图1a，图1a中HBsAg流穿峰极高，280nm吸光度值达600mAU。由图1a与表1a两者结果可以判定，在50mM MOPS条件下上样，HBsAg几乎全部流穿。

用含4％、3％和2％硫酸铵的50mM MOPS缓冲液在CIMMonoliths C4 Disk上纯化HBsAg的试验结果表明，当使用含有3％硫酸铵的50mM MOPS缓冲液上样时，HBsAg上样流穿率最低为1.4％，之后用含0.1％Triton X-100的50mM MOPS对HBsAg进行洗脱，洗脱率最高为86.23％。

表1CIM Monoliths C4 Disk在MOPS缓冲液条件下HBsAg的流穿率和洗脱率

而其它试验结果显示，上样缓冲液中硫酸铵浓度在2.5-3.5％的范围内，MOPS的浓度在50-200mM的范围内时，流穿率低于15％。洗脱缓冲液中Triton X-100浓度在0.08-0.12％范围内，MOPS缓冲液浓度在50-200mM的范围内时，洗脱率高于75％，纯化效果较好。

(2)CIM Monoliths C4 Disk在PB缓冲体系条件下的结果

以含有3％和4％硫酸铵的20mM PB分别作为上样缓冲液，用CIM Monoliths C4 Disk纯化HBsAg，试验结果表明：用含4％硫酸铵的20mM PB上样时，HBsAg上样流穿率分别为0.5％(试验b)和2.92％(试验d)，可以将HBsAg大部分吸附在疏水柱上，是理想的上样缓冲液。

如表2所示，用含有0.1％Triton X-100的50mM MOPS和含有0.1％Triton X-100的20mM PB作为缓冲液洗脱HBsAg的结果表明：含0.1％Triton X-100的50mM MOPS对HBsAg的洗脱率可达到81.45％(试验b)；含有0.1％Triton X-100的20mM PB作为洗脱缓冲液对HBsAg的洗脱率只有42.65％(实验d)。因而，相对而言，0.1％Triton X-100的50mM MOPS是理想的洗脱缓冲液。

表2CIM Monoliths C4 Disk在PB缓冲液条件下纯化HBsAg的结果

而其它试验结果显示，上样缓冲液中硫酸铵浓度在3.5-4.5％的范围内，PB缓冲液的浓度在20-200mM的范围内时，流穿率低于15％。洗脱缓冲液中Triton X-100浓度在0.08-0.12％范围内，MOPS缓冲液浓度在50-200mM的范围内时，洗脱率高于75％，纯化效果较好。洗脱缓冲液中Triton X-100浓度在0.08-0.12％范围内，PB缓冲液浓度在50-200mM的范围内时，洗脱率低于75％，纯化效果不太好。

实施例2

2.1实验方法

2.1.1主要仪器和设备

参见实施例1。

2.1.2试验方法

以含3％硫酸铵的50mM MOPS为上样缓冲液，以含0.1％TritonX-100的50mM MOPS为洗脱缓冲液，在CIM Monoliths C4 Disk上进行多次试验，具体的实验步骤可参见实施例1，从而验证CIMMonoliths C4 Disk的可重复使用次数。

每次使用CIM Monoliths C4 Disk后，均应对其再生，以保持其性能，具体再生过程如下：

1)用去离子水清洗已经使用过的CIM Monoliths C4 Disk，体积大于五个柱床体积，流速为2ml/min；

2)用1mol/L的NaOH清洗步骤1)清洗过的柱子，体积大于五个柱床体积，流速为1ml/min；

3)用去离子水清洗步骤2)清洗过的柱子，体积大于五个柱床体积，流速为6ml/min；

4)用将要使用的上样缓冲液平衡步骤3)清洗过的柱子，体积大于五个柱床体积。即可进行下一轮层析试验。

2.2实验结果

2.2.1上样缓冲液为含3％硫酸铵的50mM MOPS，洗脱缓冲液为含0.1％Triton X-100的50mM MOPS，上样量为2ml，流速为2ml/min。

表3CIM Monoliths C4 Disk在MOPS缓冲系统不同使用次数时的流穿率和洗脱率

  实验次数  流穿率  洗脱率  1  2.5％  82.09％  2  2.5％  85.09％  3  1.9％  75.37％  4  3.1％  78.25％

2.2.2上样缓冲液为含4％硫酸铵的20mM PB，洗脱缓冲液为含0.1％Triton X-100的50mM MOPS，上样量为2ml，流速为2ml/min。

表4CIM Monoliths C4 Disk在PB缓冲系统不同使用次数时的流穿率和洗脱率

  实验次数  流穿率  洗脱率  1  3.08％  83.28％  2  0.10％  82.35％  3  0.87％  78.39％  4  2.03％  76.52％

实验2.2.1和实验2.2.2均为同一个CIM Monoliths C4 Disk，用两种不同的缓冲系统总共做了八次实验，每次实验的流穿率均低于5％，HBsAg洗脱率均大于75％，均达到目的指标。可知CIM Monoliths C4Disk可以使用八次以上。

CIM Monoliths C4 Disk的使用流速可以达到2ml/min，约350柱床体积每小时，而Butyl-Sepharose 4B使用流速为每小时一个柱床体积，后者的流速约为前者的350倍左右。不过，也许随着柱子体积的放大流速的倍数会降低，但至少应该是Butyl-Sepharose 4B的十倍以上。