用具有抗菌和愈合性质的成膜包衣包被的核及其获得方法

摘要

本发明涉及用含有一种或多种胞外多糖（EPS）以及任选地一种或多种生物活性分子的膜包被的核，所述生物活性分子例如杀菌剂或抑菌剂、愈合剂和/或抗炎剂，还涉及用于获得所述核以抑制珠母贝中核排斥的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及珍珠养殖(珠母贝生产珍珠)中的核包被领域。因此，本发明涉及 核，所述核包被有具有愈合和抗菌性能，且能够降低由所述核插入受体珠母贝 导致的死亡以及核排斥现象的膜。

背景技术

珍珠养殖是一种人类活动，由在自然环境中养殖珍珠贝(Pinctada sp)珠母贝 以生产养殖珍珠所组成。第一步骤包括收集和养殖珠母贝，其将用作供体牡蛎 或受体牡蛎。移植由外科手术操作所组成，其中将移植物（供体牡蛎套膜的上 皮的一部分）(约4mm²)与珍珠层珠(nacre bead)（核）的组合插入受体牡蛎的珍 珠袋中。一旦插入受体牡蛎中，移植物的上皮衬里扩增和覆盖珍珠袋，从而产 生围绕核的珍珠囊。所述珍珠囊在核周围沉积多层珍珠层，从而产生珍珠 (Montagnani等,2009)。

移植后45天左右，以不同的比率发生死亡和核排斥。在操作后三周内影响 40至50%牡蛎的这些现象看起来由感染性病理或由不适当的移植操作所导致。 核插入和致病性细菌污染后的炎症反应的发生，以及移植过程中切开的组织没 有快速愈合可能是核排斥的主要原因(Cochennec等，2010)。

因此，需要使得移植操作具有较低的失败率的方法，特别是通过降低死亡 和核排斥。

专利申请JP05219856描述在受体牡蛎中在移植步骤期间连同核或利用核插 入固体材料，所述固体材料在其表面含有与抗生素结合的聚合物。

日本专利申请JP02308869和JP63215609请求保护覆盖有聚合物的核的应 用，通过增加核表面的均匀性以改善特别是所获得的珍珠的质量，以及通过例 如避免各种寄生虫的核定植用于降低排斥和死亡现象。

日本专利申请JP02174621描述天然聚合物与抗真菌剂组合用于包被核的应 用，以限制移植期间的污染。

专利US6514614描述水溶性聚合物与具有抗菌活性的物质组合包被核，所 述聚合物部分地溶于海水(溶解速率大于25%)，以使得能够有效地降低摩擦和耐 所述核的插入。

最后，日本专利申请JP03183424描述用于用水溶性聚合物(或通过任何其它 能够延迟施用的化合物)包被核的系统，使得以控制的速率施用与所述聚合物结 合的抗生素。

然而，上述引用的公开物都没有解决使移植过程中形成的切口愈合的问题。 此外，抗生素的使用由于其不完全的生物降解性存在环境问题以及因为细菌耐 药性的发生存在公共健康问题。

令人惊奇地，本发明的申请人已经注意到，用EPS(胞外多糖)膜包被核使得 移植操作的失败率降低。不希望被任何理论所限制，用EPS膜包被核将有可能 加速受体牡蛎的伤口愈合。此外，杀菌剂或抑菌剂例如抗微生物肽(AMP)与所述 EPS膜的结合使得微生物污染的发生降低。因此，EPS单独或与杀菌剂或抑菌 剂组合的存在使得移植步骤的失败降低，特别是受体牡蛎的死亡和所述牡蛎的 核排斥降低。

发明内容

本发明涉及由包含一种或多种胞外多糖(EPS)的膜包被的核。

根据本发明的实施方案，EPS由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、古细 菌(archaea)或藻类(algae)产生。

根据本发明的实施方案，所述膜还包含一种或多种生物活性分子。

根据本发明的实施方案，所述生物活性分子选自一种或多种杀菌剂或抑菌 剂、一种或多种愈合剂和/或一种或多种抗炎剂。

根据本发明的实施方案，EPS选自HE800、EPS721、MO245、GG1、HYD 657、HYD1644、HYD1545、GY785、MS907、ST716、HYD721、GY772、 HYD750、GY768、GY788、BI746、GY786、GY685、GY686、ST719、HYD 1574、HYD1579、HYD1582、HYD1584、ST708、ST722、ST342、ST349、 HYD1625和HYD1666，优选MO245、HE800、GG1、HYD721和ST716。

根据本发明的实施方案，所述杀菌剂或抑菌剂选自抗微生物肽(AMP)。

根据本发明的实施方案，所述AMP选自鲎素（tachyplesin）或牡蛎防御素 Cg-Defs。

本发明还涉及用于获得如上所述的核的方法，所述方法包括用EPS包被核 的步骤，所述步骤通过浸渍在包含溶液体积的0.1至10%重量的EPS的溶液中 进行。

根据本发明的实施方案，所述方法包括：

-如上所述的第一步骤，和

-使一种或多种杀菌剂或抑菌剂与之前形成的EPS膜结合的第二步骤，所 述第二步骤通过浸渍在包含1至10MIC的所述杀菌剂或抑菌剂的溶液中进行。

根据另一个实施方案，用于获得用包含一种或多种EPS和一种或多种杀菌 剂或抑菌剂组合的膜包被的核的方法包括用EPS和杀菌剂或抑菌剂包被核的步 骤，所述步骤通过浸渍在包含溶液体积的0.05至10%重量的EPS和1至10MIC 的所述杀菌剂或抑菌剂的溶液中进行。

本发明还涉及包含如上所述的核的珠母贝。

本发明还涉及如上所述的核或如上所述的方法用于降低受体牡蛎核移植失 败的用途，所述失败由受体珠母贝的死亡或核排斥组成。

本发明还涉及用于移植受体珠母贝的方法，所述方法包括将移植物与如上 所述的核或与如上所述的方法获得的核组合插入所述受体珠母贝的珍珠袋中， 该移植物相应于供体牡蛎套膜的上皮。

本发明还涉及用于生产养殖珍珠的方法，所述方法包括如上所述的移植方 法。

本发明还涉及用于获得珍珠的方法，所述方法包括根据本发明的核或通过 根据本发明的方法获得的核与供体牡蛎套膜的上皮的一部分组合移植入受体牡 蛎的珍珠袋中。

本发明还涉及珍珠，其通过如上所述的获得珍珠的方法获得，或者包含根 据本发明的核或通过根据本发明的方法获得的核，或者包含膜，所述膜在一个 或多个珍珠层厚度下含有由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、古细菌或藻类 产生的一种或多种胞外多糖(EPS)。

本发明还涉及用于提高珍珠的质量和/或用于降低用核移植受体牡蛎失败的 方法，所述失败相应于受体珠母贝的死亡或核排斥，且所述方法包括用根据本 发明的核或用根据本发明获得核的方法获得的核移植受体牡蛎。

本发明还涉及根据本发明的核或由根据本发明的获得核的方法获得的核用 于降低核移植受体牡蛎失败和/或提高获得的珍珠的质量的用途，所述失败由受 体珠母贝的死亡或核排斥组成。

定义

在本发明中，下列术语具有以下含义：

-“核”：成分，一般为球形，由天然化合物(例如密西西比贻贝Amblema plicata （三桥蛤）的珍珠层)或合成化合物(例如Bironite(白云质))在移植步骤期间插入 受体牡蛎而形成，作为受体珠母贝的珍珠层沉积的支撑。所述核可以包被有特 定物质，以改善所得珍珠的质量。

-“珍珠养殖”：目的是通过一般属于珠母贝属的珠母贝产生养殖珍珠的人类 活动。

-“杀菌剂”具有杀菌作用，即导致细菌死亡的物质。

-“抑菌剂”具有抑菌作用，即抑制细菌形成，生长和/或分裂的物质。

-“MIC”：最低抑菌浓度。这相应于培养过夜后活性剂(agent)抑制微生物的 可见生长的最小浓度。确定活性剂MIC的方法在本领域中是众所周知的。

-“愈合”描述能够促进伤口恢复或愈合的活性剂，所述伤口更具体而言是开 放伤口，如切割伤口。

-“约”：位于数字元素之前，指比该数字元素多或少10%。

-“珍珠层(nacre)”：由文石(aragonite)晶体(形成珍珠层的约90%)和贝壳硬蛋 白形成的生物矿化结构。文石是式为CaCO₃+痕量Sr、Pb、Zn的化学化合物。

具体实施方式

在珍珠养殖中，珍珠的产生由在移植步骤期间珍珠层沉积在插入受体牡蛎 的核上所导致。移植核的步骤通常具有高的失败率，这归因于受体牡蛎在移植 过程中产生的切口处愈合不良或细菌污染。因此，珍珠养殖中所用的核越来越 多地被能够使移植步骤的失败率降低的包衣所覆盖。

因此，本发明涉及由包含一种或多种胞外多糖(EPS)的膜覆盖或包被的核。

所述EPS膜会有愈合的特性，能够使移植步骤诱导的伤口愈合加速，因此 使得导致移植失败的受体牡蛎的死亡降低。

已证明，一些细菌具有在受控条件下合成包括胞外多糖(EPS)在内的胞外聚 合物的能力，以响应营养失衡条件。胞外多糖可定义为通过连接相似的碳水化 合物(通常称为糖或单糖)而形成的大分子。这些胞外多糖可以以工业规模生产， 并且特别是具有粘合(本质上与这些分子的功能相关)和成膜特性。

许多微生物，例如革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、古细菌、真菌和一 些藻类可产生EPS。有利地，通过革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、古细菌 或藻类产生EPS。

可通过众所周知的物理或化学提取方法，例如超声处理、离心、碱处理、 乙醇提取、酶提取从微生物培养物提取EPS。

根据本发明的实施方案，EPS可以选择由海洋生物产生的那些，所述海洋 生物例如芽孢杆菌(Bacillus)、盐单胞菌(Halomonas)、动性球菌(Planococcus)、 肠杆菌(Enterobacter)、交替单胞菌(Alteromonas)、假交替单胞菌 (Psuedoalteromonas)、红球菌(Rhodococcus)、动胶菌(Zoogloea)、蓝细菌 (Cyanobacteria)、弧菌(Vibrio)，如Satpute等中所描述(Biotechnology Advances 2010,28;436-450)。如果该分类法必须进行修改，本领域技术人员能够适应分类 法的修改，以便从中推断出能够在本发明中使用的EPS。

根据本发明的实施方案，可以通过来自深海热液生态系统的细菌的发酵获 得EPS。更具体地，这些EPS是在来自深海热液生态系统的细菌发酵期间在受 控条件(由于富含碳水化合物的营养环境导致的高碳/氮比所产生的营养失衡)下 合成的那些(参见例如Guezennec,J.(2002).Deep-sea hydrothermal vents:A new  source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest？ Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology29:204-208)。

根据一个实施方案，EPS选自包括不带电荷(或中性)EPS的组，例如GG1。

根据一个实施方案，EPS选自包括带电荷EPS的组，例如HE800和MO245。

根据一个实施方案，EPS可以选自HE800、EPS721、MO245、GG1、HYD 657、HYD1644、HYD1545、GY785、MS907、ST716、HYD721、GY772、 HYD750、GY768、GY788、BI746、GY786、GY685、GY686、ST719、HYD 1574、HYD1579、HYD1582、HYD1584、ST708、ST722、ST342、ST349、 HYD1625和HYD1666，优选MO245、HE800、GG1、HYD721和ST716。

根据一个实施方案，EPS是天然的。根据另一个实施方案，可以化学或物 理修饰所述EPS(例如，通过添加硫酸基团、醋酸基团、乳酸基团、琥珀酸基团 或丙酮酸基团修饰)。

根据本发明的一个实施方案，EPS膜在核周围是连续的。

本发明还涉及包被有包含一种或多种EPS和一种或多种生物活性分子的膜 的核。

根据一个实施方案，这些生物活性分子是杀菌剂或抑菌剂。在珍珠养殖中， 对核添加杀菌剂或抑菌剂能够使受体牡蛎中的细菌污染的发生受限制，受体牡 蛎中的细菌污染能够导致核排斥或所述牡蛎的死亡。

根据另一个实施方案，这些生物活性分子是愈合剂或抗炎剂，如胶原蛋白、 纤维蛋白原、层粘连蛋白或生长因子。

根据本发明的一个实施方案，所述杀菌剂或抑菌剂选自化学抗生素，例如 四环素、卡那霉素、磺胺间甲氧嘧啶和氨苄青霉素。

根据本发明的另一个实施方案，所述杀菌剂或抑菌剂选自抗微生物肽 (AMP)。

所述抗微生物肽(AMP)是先天免疫效应分子，在进化中被保留并在整个生命 界普遍存在。最近几年中，已鉴定了多种AMP，显示在结构、大小和作用模式 方面具有极大的多样性。一般地，AMP的特征是阳离子和疏水性氨基酸的高比 例。这些分子通常具有两亲性质，其是与细菌膜相互作用所必需的(Bulet等， 2004)。AMP通过洗涤剂型效应或通过形成孔而使微生物膜通透化，或通过抑制 构成细菌壁的肽聚糖的合成，或通过抑制细菌代谢途径来杀死微生物(Brodgen 等，2005)。

对于一般使用的化学抗生素，AMP具有完全可生物降解的优点。由于其生 物学特性，看起来它们是替代传统化学抗生素的好的候选。事实上，它们具有 广谱的抗微生物活性，低特异性，不同的作用模式以及对环境是无害的。

可以通过化学合成或在细菌或酵母重组系统中表达(克隆、表达、纯化)来产 生AMP。

根据本发明的实施方案，AMP可属于具有α螺旋结构的线性AMP家族， 具有一种或多种氨基酸过高比例的AMP家族，具有1或2个二硫键的发夹AMP 家族(β发夹)，或具有3个或更多个二硫键具有β折叠和α螺旋的环状AMP家 族(Bulet等,Immunological Reviews,2004,198:169-184;Brogden,Nature Review  Microbiology,2005,3:238-250)。

具有α螺旋的线性AMP的实例包括，但不限于天蚕素（cecropin）、stomoxyn （螫蝇抗菌肽）、ponericin（猛蚁抗菌肽）、spinigerin（白蚁抗菌肽）、oxyopinin （蜘蛛抗菌肽）、cupiennin（萨氏九杯蛛抗菌肽）、clavanin（海鞘抗菌肽）、styelin （海鞘抗菌肽）、摩西鱼毒肽(pardaxin)、misgurin（泥鳅抗菌肽）、pleurocidin（鱼 类抗菌肽）、鲶鱼抗菌肽(parasin)、虹鳟鱼抗菌肽(oncorhyncin)、moronecidin（鱼 类抗菌肽）、蛙皮素（magainin）、牛蛙抗菌肽(temporin)、cathelicidin（蛇毒抗菌 肽）和indolicidin（牛抗菌肽）。

富含一种或多种氨基酸，脯氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的AMP的实例 包括，但不限于bactenecins（牛白细胞抗菌肽）、PR-39、黄蜂素（abaecins）、意 大利蜜蜂素（apidaecins）、果蝇素（drosocin）、红蝽素（pyrrhocoricins）、Cg-Prp、 prophenin（猪抗菌肽）和indolicin（抗菌肽）。

含有2至4个半胱氨酸的发夹AMP的实例包括，但不限于鲎素、protegrin （猪源抗菌肽）、死亡素（thanatin）、蝎血素（androctonin）、gomesin（蜘蛛抗 菌肽）、polyphemusin（鲎抗菌肽）、铁调素（hepcidin）、brevinin（蛙皮抗菌肽）、 esculentin（蛙皮抗菌肽）、tigerinin（蛙科动物抗菌肽）和bactenecin（牛白细胞 抗菌肽）。

含有6个或更多个半胱氨酸残基或具有开放环的环状AMP的实例包括，但 不限于防御素(脊椎动物、无脊椎动物或植物)、termicin（蚂蚁抗菌肽）、heliomicin （夜蛾抗菌肽）、drosomycin（果蝇霉素）、ASABF、pBD、penaeidins（对虾肽）、 ALF和大防御素(big-defensins)。无脊椎动物防御素的实例是Cg-Defs牡蛎防御 素或MGD贻贝防御素。

根据本发明的一个实施方案，所述AMP选自鲎素和Cg-Defs牡蛎防御素。

根据本发明的一个实施方案，所述AMP通过化学合成来合成。根据本发明 的另一个实施方案，所述AMP通过在细菌或真菌重组系统中，优选在酵母系统 中生物合成。

由受体牡蛎移植导致的死亡或核排斥一般发生在操作后45天内，通常在操 作后的最初三周内。

根据本发明的一个实施方案，所述AMP稳定地与所述EPS膜结合。

根据本发明的一个实施方案，包含EPS和任选包含抑菌剂或杀菌剂的膜耐 受海水洗涤，且在4至30℃范围的温度下稳定超过三周，优选稳定超过一个月。 因此，包含EPS和任选包含抑菌剂或杀菌剂的膜在与海水接触期间不溶解(实施 方案1)达至少三周。

根据本发明的一个实施方案，包含EPS和任选包含抑菌剂或杀菌剂的膜在 37℃的温度下保持抑制细菌生长的活性超过三周，优选超过1个月。

根据本发明的一个实施方案，EPS膜和抑菌剂或杀菌剂如AMP之间的结合 由吸附现象或EPS和所述抑菌剂或杀菌剂之间的化学反应导致。

本发明还涉及用包含细菌来源的一种或多种胞外多糖的膜包被珍珠养殖核 的方法。

根据本发明的一个实施方案，所述方法包括将核浸渍在EPS水溶液，优选 在反渗透水中的EPS溶液中的第一步骤。根据本发明的优选实施方案，所述EPS 水溶液的EPS浓度为0.1至10%重量/体积，更优选每体积水溶液0.5至5%重量 EPS，甚至更优选1%(重量EPS。

根据本发明的一个实施方案，所述将核浸渍在含有一种或多种EPS的溶液 中的第一步骤在恒定的温度下，优选在环境温度(即15至25℃)下，更优选约20 ℃下进行。根据本发明的该实施方案，所述将核浸渍在含有一种或多种EPS的 溶液中的第一步骤优选进行1至60分钟，更优选进行5至20分钟，甚至更优 选进行10分钟。

根据本发明的另一个实施方案，所述将核浸渍在含有一种或多种EPS的溶 液中的第一步骤在恒定的温度下，优选在1至10℃下，更优选约4℃下进行。 根据本发明的该实施方案，所述将核浸渍在含有一种或多种EPS的溶液中的第 一步骤优选进行1至3小时，更优选进行约2小时。

根据本发明的一个实施方案，然后将包被的核真空干燥。

当包被核的膜进一步包含一种或多种杀菌剂或抑菌剂时，上述的第一步骤 之后进行第二步骤，所述第二步骤包括将核浸渍在包含浓度为1至10MIC，优 选10MIC的一种或多种杀菌剂或抑菌剂的溶液中。

根据本发明，所述杀菌剂或抑菌剂在生物学上可接受的极性溶剂的溶液中， 所述生物学上可接受的极性溶剂例如水(例如反渗透水)、乙醇、三氟乙醇 (CF₃CH₂OH,TFE)或它们的混合物，例如水/TFE，优选三氟乙醇(CF₃CH₂OH)或 反渗透水。

根据本发明的第一实施方案，浸渍核的第二步骤在恒定的温度下，优选1 至10℃下，更优选约4℃下进行。根据本发明的一个实施方案，所述浸渍核的 第二步骤优选进行24至120小时，更优选进行48至96小时，甚至更优选进行 72小时。根据另一个实施方案，所述浸渍核的第二步骤进行12至48小时，优 选进行12至24小时，更优选进行24小时。

根据本发明的第二实施方案，所述浸渍核的第二步骤在恒定的温度下，优 选在环境温度(20至30℃)下，更优选约25℃下进行。根据本发明的一个实施方 案，所述浸渍核的第二步优选进行30分钟至3小时，优选进行1至2小时，甚 至更优选进行约1小时30分钟。

根据本发明的实施方案，然后将包被的核真空干燥。

根据本发明的实施方案，所述方法任选地包括在第一浸渍步骤和第二浸渍 步骤之间漂洗核的步骤。根据该实施方案，用体积为10至1000mL的蒸馏水， 优选100至300mL的蒸馏水，更优选约200mL的蒸馏水漂洗核。

本发明还涉及获得用包含一种或多种EPS和一种或多种抑菌剂或杀菌剂的 膜包被的核的方法，所述方法包括将核浸渍在包含EPS和抑菌剂或杀菌剂的溶 液中的单个步骤。

根据一个实施方案，以相对于溶液的总体积的重量计，所述EPS以0.05至 10%的浓度，优选0.1至5%，更优选1%的浓度存在在溶液中。

根据一个实施方案，所述杀菌剂或抑菌剂以1至10MIC的浓度存在在溶液 中。

根据一个实施方案，所述浸渍步骤在恒定的温度下，1至10℃，优选4℃下 进行，且进行12至128小时，优选48至96小时，更优选72小时。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的包被的核或根据本发明的方法 获得的包被的核在4℃保存。根据本发明的另一个实施方案，根据本发明的包被 的核或根据本发明的方法获得的包被的核在环境温度下保存。

根据本发明的一个实施方案，核是天然来源的，更优选地，所述核由属于 Amblema属的密西西比贻贝，优选Amblema plicata（三桥蛤）的珍珠层形成。 核的实例是由Aming(Standard Aming)或Poe Import出售的那些。

根据本发明的一个实施方案，所述核的直径为1至20mm，优选2至15mm， 更优选2至4mm，甚至更优选2.1至3.5mm。

根据本发明的一个实施方案，所述核的直径为2至2.5BU，优选约2.4BU。 BU是计量单位，1BU相应于3.03mm。

本发明还涉及包含如上所述的核或通过如上所述的方法获得的核的牡蛎。

优选地，所述牡蛎属于珠母贝(Pinctada)属，更优选属于合浦珠母贝（Pinctada  fucata）、大珠母贝（Pinctada maxima）或黑蝶珠母贝（Pinctada margaritifera） 的种。

本发明还涉及用于移植受体珠母贝的方法，包括将移植物与如上所述的核 或通过如上所述的方法获得的核的组合插入受体珠母贝的珍珠袋中，所述移植 物相应于供体牡蛎套膜的上皮。

根据本发明的一个实施方案，所述移植方法包括(i)人工打开受体珠母贝， (ii)在受体珠母贝的组织中产生切口，以便到达珍珠袋，并使得能够使在第三步 骤(iii)中将移植物与如上所述的用EPS膜包被的核的组合插入受体珠母贝的珍 珠袋中，所述移植物相应于供体牡蛎套膜的上皮的一部分(约4mm²)。

本发明还涉及用于生产养殖珍珠的方法，包括如上所述的移植方法。

本发明还涉及用于获得珍珠的方法，包括使用如上所述的包被的核或根据 如上所述的包被方法获得的包被的核。

根据本发明的一个实施方案，用于获得珍珠的方法包括将根据本发明的核 与供体牡蛎套膜的上皮的一部分组合移植入受体牡蛎的珍珠袋中。

根据本发明的一个实施方案，所述用于生产或获得珍珠的方法包括：包括 收集和养殖珠母贝的第一步骤，所述珠母贝优选属于上述列举的属和种，以获 得供体珠母贝和受体珠母贝。

根据本发明的一个实施方案，然后清洗所述供体珠母贝和受体珠母贝，以 除去任何寄生虫。

根据本发明的一个实施方案，所述生产方法进一步包括在移植后养殖受体 珠母贝的步骤，优选养殖期间为10至24个月，优选12至20个月，更优选16 至18个月。在养殖期间，移植物的上皮衬里扩增并覆盖珍珠袋，在核的周围产 生珍珠囊，并在核的周围沉积多层珍珠层，从而导致产生珍珠。

本发明还涉及通过如上所述的获得珍珠的方法获得的珍珠。

本发明还涉及包含根据本发明的包被的核或通过根据本发明的方法获得的 核的珍珠。

本发明还涉及其中核用EPS膜包被的珍珠，所述EPS优选为由革兰氏阳性 细菌或革兰氏阴性细菌、古细菌或藻类产生的EPS，任选地与一种或多种生物 活性分子结合。

本发明还涉及在一个或多个珍珠层厚度下包含EPS膜的珍珠，优选EPS由 革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、古细菌或藻类产生，任选地与一种或多种 生物活性分子结合。

根据本发明的一个实施方案，所述珍珠具有尺寸，优选2至20mm，优选5 至15mm，甚至更优选6.8至10mm的直径。

根据本发明，如本发明所述的核周围存在膜具有许多优点：

-改善核表面的均一性，和/或

-改善所得的珍珠的质量(表面缺陷的外观的限制)，和/或

-加速移植期间形成的切口的愈合，和/或

-作用于移植物和珍珠囊的细胞，改善珍珠的发育，和/或

-抑制微生物污染现象，和/或

-降低切口感染引起的受体牡蛎的死亡。

本发明还涉及用于改善核的均一性的方法，包括如本发明所述的用膜包被 所述核。

本发明还涉及用于改善在受体牡蛎移植中获得的珍珠的质量的方法，包括 使用根据本发明的核。根据本发明的一个实施方案，在移植步骤期间使用根据 本发明的核限制珍珠上表面缺陷的外观。

本发明还涉及用于降低受体牡蛎核移植失败的方法，所述失败相应于受体 珠母贝的死亡或核排斥，所述方法包括用根据本发明的核或通过根据本发明的 获得核的方法获得的核移植受体牡蛎。

本发明还涉及用于在移植期间抑制核排斥的方法，所述方法包括在移植中 使用根据本发明的包被核。

本发明进一步涉及用于降低由移植步骤导致的受体牡蛎死亡的方法，包括 在移植中使用根据本发明的包被核。根据本发明的一个实施方案，由本发明的 方法所防止的死亡由在移植期间产生的切口感染引起。

本发明还涉及根据本发明的核或通过根据本发明的获得核的方法获得的核 用于降低受体牡蛎的核移植失败和/或用于提高所获得的珍珠的质量的用途，所 述失败由受体珠母贝的死亡或核排斥组成。

本发明还涉及用于加速在移植期间产生的切口愈合的方法，包括使用根据 本发明的包被核。

本发明还涉及用于抑制移植期间发生的微生物污染现象的方法，所述方法 包括在移植中使用根据本发明的包被核。

此外，对环境而言，使用AMP作为抑菌剂或杀菌剂优于传统的化学抗生素 的使用，并且对于健康亦如此，因为珠母贝的肌肉可能被生食。

附图说明

图1是通过扫描显微镜获得的未包被的核(a)和包被的核(b、c和d)的一组照 片。标记对应于故意的撕裂，以证实膜的存在。

图2是用与核一起孵育的细菌溶液进行培养后的培养皿的一组照片。(a)未 包被的核或仅用EPS包被的核。(b)用EPS/AMP的组合包被的核，没有漂洗。 (c)用EPS/AMP的组合包被的核，并用海水或MilliQ水漂洗。

实施例

参照以下实施例，本发明将更容易理解和解释。

实施例1：EPS膜存在

用包含EPS MO245和任选鲎素的膜包被核。这些核通过两步骤方法获得：

1)在4℃下浸渍在含有1%MO245的溶液中2小时，

2)在4℃下浸渍在含有70mg/l鲎素(即10MIC)的TFE溶液中72小时。

通过扫描显微镜获得的图1毫无疑义地证明膜的存在。图b和c证明撕裂 后膜的存在，图d证明用水和/或TFE洗涤后膜保持稳定。

实施例2：抗微生物活性

实验：

使用标准直径的核用于研究用细菌发酵获得的生物聚合物对表面预处理的 影响。

用仅包含EPS MO245或包含EPS MO245与鲎素组合的膜包被核。

这些核通过单个步骤的方法获得：在4℃下将核浸渍在包含0.1%MO245和 任选70mg/l(即10MIC)的鲎素的溶液中48小时。

某些核用200ml海水或MilliQ水漂洗，然后干燥。然后，将所有的核真空 干燥。

对这些核进行传统的细菌生长抑制试验：在30℃下将核放置在Tahiti（塔希 提岛）移植物中与对数生长期生长的弧菌菌株(弧菌Pmar02-149)细菌溶液接触 18个小时，所述弧菌菌株分离自黑蝶珠母贝(Pinctada margaritifera)。然后，用 分光光度计在630nm的光密度下测量细菌生长。然后，在培养皿(Zobell琼脂培 养基)上涂布细菌溶液，然后计数形成的菌落。

图2a显示未包被的核的存在不抑制细菌生长。用仅包含EPS的膜包被的核 得到相似的结果。

图2b显示用包含EPS+AMP的组合的膜包被的核的存在抑制细菌生长。

图2c显示用包含EPS+AMP的组合的膜包被的核的抗菌活性在核洗涤后被 保留。

此外，研究了随时间推移及抗海水处理(牡蛎珍珠腔中的必需元素)的抗微生 物活性的稳定性。结果表明，用包含EPS+AMP的组合的膜包被的核的抗微生 物活性在环境温度(18至21℃)下稳定至少两周。

然后，在用EPS MO245或EPS GG1与鲎素组合包被的核上进行相同的实 验。

通过相对于对照(没有核的细菌培养)，接触18小时后，细菌生长抑制百分 比来测量核的抗微生物活性。所测得的抑制率列于下表中。

核的包被 抑制% EPS MO245+鲎素 97% EPS GG1+鲎素 95%

用EPS与AMP(鲎)的组合包被的核强烈抑制细菌生长(对于EPS MO245和 GG1，分别为97和95%)。

实施例3：在移植实验中本发明的核的效力

1-死亡

将未包被的核、单独用EPS GG1包被的核、或用EPS GG1与AMP(鲎素) 组合包被的核连同受体牡蛎套膜的上皮的一部分(移植物)共同移植入受体牡蛎 中。对于该实验使用67个供体牡蛎。每个类型的核和每个供体，使用8个移植 实验。

移植后40天评价受体牡蛎的死亡。以相对于接受未包被的核的牡蛎的百分 比评价死亡。结果列在下面的表中：

条件 死亡(%) 未包被的核 100% 用EPS GG1包被的核 77.6% 用EPS GG1和鲎素包被的核 76.1%

在核上存在EPS膜或EPS+AMP膜抑制牡蛎死亡差不多25%。

2-移植排斥

如上所述，在移植实验中使用未包被的核或用EPS MO245和AMP(鲎素) 包被的核。

测量移植后40天的核排斥。结果列在下面的表中，并以相对于接受未包被 的核的牡蛎表示。

根据本发明的包含EPS和AMP的膜的存在使得可能降低核排斥大于20%。