内皮素作用抑制剂和美白剂

摘要

本发明涉及内皮素作用抑制剂和美白剂，其含有下述通式（1）所表示的化合物或者其盐作为有效成分（1）（式中，R1表示甲酰基或者碳原子数为1～4的烷基。R2表示氢原子或者碳原子数为1～4的烷基。）

说明书

技术领域

本发明涉及内皮素作用抑制剂和美白剂。另外，本发明涉及适用于这些制剂的羊角衣酸含量高的地茶提取物的制造方法。

背景技术

内皮素是来自于内皮细胞的肽类激素，并且通过受体作用于各种细胞和组织。例如，已知在血管平滑肌细胞等中引起细胞内钙浓度上升（非专利文献1）。

近年来，有报道内皮素对于表皮黑素细胞（黑色素细胞）促进细胞内钙浓度上升，通过细胞内的信号传递体系促进细胞增殖，并且增强作为黑色素合成的限速酶的酪氨酸酶的活性（参照非专利文献2）。另外，有报道内皮素是表皮角化细胞（角质形成细胞）产生的黑素细胞活化因子之一，是紫外线诱导性色素沉淀或老年性色素斑形成的重要因素（非专利文献4、5）。

由这样的内皮素的生物作用可以充分预测到，能够抑制内皮素作用的物质对于改善或预防黑色素生成或色素沉淀等是有用的。

地茶（学名：Thamnolia vermicularis或者Thamnolia Subuliformis）是在中国高地等生长的地衣类的一种。据说有脂肪分解效果等的减肥效果，在日本作为茶等而被广泛地饮用。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Hirata Y.et al.(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.154,868-875

非专利文献2：Yada et al.(1991)J.Biol.Chem.266,18352-18357

非专利文献3：Imokawa et al.(1992)J.Biol.Chem.267,24675-24680

非专利文献4：Imokawa et al.(1995)J.Invest.Dermatol.105,32-37

非专利文献5：Kadono et al.(2001)J.Invest.Dermatol.116,571-577

发明内容

发明所要解决的课题

本发明将提供有效地抑制内皮素的作用的内皮素作用抑制剂作为课题。另外，本发明将提供抑制内皮素的作用并且能够抑制黑色素生成的美白剂作为课题。

进一步，本发明将提供以高浓度含有这些制剂的有效成分之一的羊角衣酸（Beomycesic acid）的地茶提取物的制造方法作为课题。

解决课题的技术手段

本发明者们鉴于上述课题，为了探求抑制内皮素的作用的新型物质而进行了专心研究。其结果发现：下述通式（1）所表示的化合物有效地抑制了由内皮素的作用而引起的黑素细胞内的钙（离子）浓度上升，得到了该化合物作为新型的美白成分是有用的见解。进一步，本发明者们对于能够高浓度地含有地茶提取物的美白成分的提取方法进行了专心研究。其结果发现：通过用特定的提取溶剂提取地茶，可以显著地增加得到的提取物中的羊角衣酸的浓度。至此本发明是基于这些见解完成的。

根据本发明，可以提供以下的技术手段。

<1>一种内皮素作用抑制剂，其中，所述内皮素作用抑制剂含有下述通式（1）所表示的化合物或者其盐作为有效成分。

通式（1）

（式中，R₁表示甲酰基或者碳原子数为1～4的烷基。R₂表示氢原子或者碳原子数为1～4的烷基。）

<2>一种美白剂，其中，所述美白剂含有所述通式（1）所表示的化合物或者其盐作为有效成分。

<3>一种抑制内皮素作用的方法，其中，所述方法包括将所述通式（1）所表示的化合物或者其盐施用于皮肤。

<4>一种美白方法，其中，所述方法包括将所述通式（1）所表示的化合物或者其盐施用于皮肤。

<5>所述通式（1）所表示的化合物或者其盐在用于制造具有内皮素作用抑制效果的医药品中的用途。

<6>所述通式（1）所表示的化合物或者其盐在用于制造具有美白效果的医药品中的用途。

<7>一种用于抑制内皮素作用的所述通式（1）所表示的化合物或者其盐。

<8>一种用于美白的所述通式（1）所表示的化合物或者其盐。

<9>一种羊角衣酸含量高的地茶提取物的制造方法，其中，所述制造方法包括：用选自含有60v/v%以上的醇的醇溶液、环状醚类、具有2个以上的氧原子的醚类、以及总碳原子数为3～6的酯类中的至少1种溶剂提取地茶的工序。

<10>所述<9>记载的制造方法，其特征在于，通过所述提取工序得到的提取物的羊角衣酸浓度与使用50v/v%浓度的醇溶液提取得到的提取物中的羊角衣酸浓度相比，为2倍以上。

<11>所述<9>或<10>记载的制造方法，其特征在于，所述醇为总碳原子数为1～4的醇。

<12>所述<9>或<10>记载的制造方法，其特征在于，所述醚类选自四氢呋喃、二氧六环、聚乙二醇、以及聚氧乙烯甲基糖苷。

<13>所述<9>或<10>记载的制造方法，其特征在于，所述酯为乙酸乙酯。

<14>所述<9>或<10>记载的制造方法，其特征在于，所述溶剂是总碳原子数为3～6的酯类和醇溶液的混合溶剂。

<15>一种内皮素作用抑制剂，其中，所述内皮素作用抑制剂含有通过所述<9>～<14>中任一项所述的制造方法所得到的羊角衣酸含量高的地茶提取物作为有效成分。

<16>一种美白剂，其中，所述美白剂含有通过所述<9>～<14>中任一项所述的制造方法所得到的羊角衣酸含量高的地茶提取物作为有效成分。

发明的效果

本发明的内皮素作用抑制剂具有优异的内皮素作用抑制效果，可以有效地抑制由内皮素引起的黑素细胞内的钙浓度上升。另外，本发明的美白剂可以抑制内皮素对于黑素细胞的作用，抑制黑色素生成。进一步，本发明提供高浓度地含有这些制剂的有效成分之一的羊角衣酸的地茶提取物的制造方法。

本发明的内皮素作用抑制剂和美白剂可以用于医药品、医药部外品、化妆品等中。

参照适当的附图，由下述的记载可以更明确本发明的上述以及其它的特征和优点。

附图说明

图1是表示在实施例1的参考例中，添加了德国洋甘菊提取物的体系中的细胞内钙浓度上升率（相对值%）的图。

图2是实施例2中添加羊角衣酸并培养后的皮肤片的照片。

图3是表示实施例2中添加了羊角衣酸的皮肤片中的黑色素量（相对值%）的图。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

1．通式（1）所表示的化合物

本发明的内皮素作用抑制剂和美白剂含有下述通式（1）所表示的化合物或者其盐作为有效成分。如后述的实施例中证实的，该化合物具有优异的内皮素作用抑制效果以及黑色素产生抑制效果。

通式（1）

通式（1）中，R₁表示甲酰基或者碳原子数为1～4的烷基。R₂表示氢原子或者碳原子数为1～4的烷基。作为碳原子数为1～4的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。

作为R₁，优选为甲酰基或者碳原子数为1～2的烷基（甲基、乙基），进一步优选为甲酰基或者甲基。

作为R₂，优选为氢原子或者碳原子数为1～2的烷基（甲基、乙基），进一步优选为氢原子或者甲基。

本发明的内皮素作用抑制剂和美白剂可以将所述通式（1）所表示的化合物的盐作为有效成分。作为盐没有特别地限定，例如可以列举锂盐、钠盐、钾盐等的碱金属盐，钙盐、镁盐等的碱土类金属盐，三甲基胺、三乙基胺等的烷基胺盐和季铵盐，三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺等的烷醇胺盐，或者赖氨酸、组氨酸、精氨酸等的氨基酸盐等，优选为碱金属盐、烷醇胺盐、氨基酸盐。（以下，统称为“通式（1）所表示的化合物或者其盐”，也简称为通式（1）所表示的化合物。）

以下列举所述通式（1）所表示的化合物的具体例子，但本发明并没有被这些限定。另外，下述例示的化合物中Me表示甲基。

巴尔巴地衣酸                         地弗地衣酸

（Barbatic acid）                 （Diffractaic acid）

羊角衣酸

在本发明的内皮素作用抑制剂或者美白剂中，作为有效成分可以单独使用所述通式（1）所表示的化合物，另外，也可以将2种以上混合使用。

如后述的实施例中证实的，所述通式（1）所表示的化合物可以有效地抑制由内皮素引起的黑素细胞的钙浓度上升。进一步，该化合物由于通过抑制内皮素对于黑素细胞的作用而能够抑制黑色素生成，因此，具有美白效果。另外，本发明中的“美白（作用）”是指抑制黑色素的生成，还原没有多余的黑色素的本来的透明肤色，或者防止、抑制皮肤的黑化或斑痕·雀斑等的色素沉淀。

所述通式（1）所表示的化合物可以通过化学合成进行制造，也可以从来自天然物的材料中提取·精制等而得到。另外，也可以作为市售的试剂得到。

作为化学合成所述通式（1）所表示的化合物的方法，例如可以列举Australian Journal of Chemistry(1975),28(5),1113-1124、药学杂志(1936),56,237-258、药学杂志(1932),52,991-993等中记载的方法。

在由市售的试剂等得到的情况下，例如可以由NAMIKI SHOJI CO.,LTD.等取得。

作为从植物等天然原材料中提取、分离的方法，没有特别地限定，例如可以列举使用适当的溶剂提取植物，通过色谱法等方法从得到的植物提取物中分离出所述通式（1）所表示的化合物的方法。作为植物，例如可以使用地茶（日本名：雪茶，学名：Thamnolia vermicularis）。作为提取溶剂，可以使用通常用于植物成分的提取的溶剂，例如可以列举水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等的醇类；乙二醇、丙二醇、甘油、丁二醇等的多元醇类；丙酮、甲乙酮等的酮类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等的酯类；四氢呋喃、乙醚等的链状和环状醚类；聚乙二醇等的聚醚类；二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等的卤化烃类；己烷、环己烷、石油醚等的烃类；苯、甲苯等的芳香族烃类；吡啶类；超临界二氧化碳；油脂、蜡、其它的油等，这些可以单独使用或者将2种以上组合使用。另外，提取条件也可以使用通常的条件，作为一个例子，可以列举在0～100℃下将植物浸渍或者加热回流数分钟～数周左右。

2．羊角衣酸含量高的地茶提取物的制造方法

作为通式（1）所表示的化合物之一的羊角衣酸，优选使用选自醇含有率为60%以上的醇水溶液、环状醚类、具有2个以上的氧原子的醚类、以及总碳原子数为3～6的酯类中的至少1种作为提取溶剂，对作为原料的地茶进行提取来制造得到。通过该方法得到的地茶提取物与使用其它的提取溶剂的地茶提取物相比，以高浓度含有羊角衣酸。

[原料]

作为原料使用的地茶是指学名为Thamnolia vermicularis（日本名为雪茶）、或者学名为Thamnolia Subuliformis（日本名为雪地茶）的地茶科地茶属的地衣类。在地茶提取物中已知含有地茶酸（Thamnolicacid）、鳞片酸（Squamatic acid）、羊角衣酸等被称为缩酚酸类的化合物（参照日本食品化学学会刊Vol.14(2),2007,P63～69）。地茶的提取物也有报道具有黑色素生成抑制作用（参照日本特开2006-182731号公报）。另外，关于羊角衣酸，报道具有血管扩张作用和瘦身作用等（参照日本特开平2-223577号公报、以及美国专利申请公开第2004-0146359号说明书）。

在本发明中，也可以使用属于上述属的近缘地衣类。这些可以作为市售品得到。

作为原料，也可以将雪茶和雪地茶混合使用，也可以单独使用。优选使用雪茶。另外，可以使用地茶的任意部分（整体、全草、地衣体、枝状体、叶状体、子实体等），也可以将各部位多种组合使用。优选使用地衣体、枝状体。

提取中使用的地茶可以是直接未加工的，也可以为了提高提取效率而实施了干燥、切细、粉碎等的处理后的物质。

[提取溶剂]

提取溶剂，可以从含有60%以上的醇的醇溶液（作为醇，具体来说，可以列举甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等的醇类；丙二醇、丁二醇等的多元醇类，优选总碳原子数为1～4的醇）、环状醚类（例如，四氢呋喃、二氧六环）、具有2个以上的氧原子的醚类（具体来说，可以列举聚醚类，例如可以列举聚乙二醇、聚氧乙烯甲基糖苷等）、以及总碳原子数为3～6的酯类（例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯）中进行选择。在本发明中，可以单独使用这些溶剂，也可以将2种以上组合使用。另外，也可以用任意一种溶剂提取之后，置换为其它的溶剂。作为本发明的制造方法中的提取溶剂，优选使用浓度为60%以上的醇水溶液、或者乙酸乙酯，进一步优选使用浓度为70%以上的醇水溶液，更加优选使用浓度为90%以上的醇水溶液（优选乙醇），特别优选使用浓度为95%以上的醇水溶液（优选乙醇）。另外，本说明书中的溶剂浓度只要没有特别地限定为容量基准（v/v）。

提取溶剂的使用量相对于提取原料的地茶以质量比计优选为1～200倍量，进一步优选为1～100倍量，更加优选为1～50倍量，特别优选为5～40倍量，最优选为5～30倍量。

[提取方法]

地茶的提取方法·条件可以使用地衣类或植物的提取中使用的通常的方法·条件，没有特别地限制。例如，优选在0～100℃下将地茶进行浸渍或者加热回流数分钟～数周，特别优选在室温附近的温度下浸渍1小时～3周左右。另外，为了提高提取效率，也可以同时进行搅拌，或者在溶剂中进行均质处理。

另外，在提取工序之后，也可以根据需要进一步通过适当的分离手段，例如凝胶过滤、色谱法、精密蒸馏等分离活性高的组分。

在通过本发明的制造方法得到的提取物中包含这样得到的各种提取物、其稀释液、其浓缩液、其精制物或者它们的干燥粉末等。

通过本发明的制造方法得到的地茶提取物含有高含量的羊角衣酸。具体来说，本发明的羊角衣酸含量高（高浓度含有）的地茶提取物的特征在于，与使用相同量的浓度为50%醇水溶液以相同的提取条件（提取时间、提取温度等）提取相同量的地茶的情况相比，得到的地茶提取物中的羊角衣酸浓度为2倍以上。本发明的地茶提取物中的羊角衣酸浓度相对于提取物的总质量优选为300ppm以上，进一步优选为400ppm以上，更加优选为800ppm以上。另外，本说明书中的ppm只要没有特别地限定是质量基准。

通过本发明的制造方法得到的地茶提取物以高浓度含有羊角衣酸，如后述的实施例中证实的，与现有的地茶提取物相比，具有更高的美白效果。因此，如果将通过该方法得到的地茶提取物用于本发明的内皮素作用抑制剂或者美白剂，则可以期待更优异的内皮素作用抑制效果以及美白效果。

3．内皮素作用抑制剂、美白剂

在本发明中，所述通式（1）所表示的化合物或者通过本发明的方法得到的羊角衣酸含量高的地茶提取物可以直接用作内皮素作用抑制剂或者美白剂。另外，也可以在该化合物或者提取物中加入例如氧化钛、碳酸钙、蒸馏水、乳糖、淀粉等适当的液体或者固体的赋形剂或者增量剂来使用。在该情况下，制剂中所含的所述通式（1）所表示的化合物的量没有特别地限制，但优选含有所述通式（1）所表示的化合物0.00001～5质量%，进一步优选含有0.00001～3质量%，特别优选含有0.0001～3质量%。另外，制剂中所含的上述地茶提取物的量没有特别地限制，但优选含有该提取物0.0001～50质量%，进一步优选含有0.001～20质量%，特别优选含有0.01～10质量%。

在本发明的美白剂中，除了所述通式（1）所表示的化合物或者通过本发明的方法得到的羊角衣酸含量高的地茶提取物以外，也可以加入其它的药效成分。例如，可以加入其它的美白剂、保湿剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、表面活性剂、增粘剂、色材等。在与其它的药效成分一起制成组合物的情况下，美白剂中所含的所述通式（1）所表示的化合物的量没有特别地限制，但优选含有所述通式（1）所表示的化合物0.00001～5质量%，进一步优选含有0.0001～5质量%，特别优选含有0.0001～3质量%。另外，美白剂中所含的该提取物的量没有特别地限制，但优选含有该提取物0.0001～50质量%，进一步优选含有0.001～20质量%，特别优选含有0.01～10质量%。

本发明的内皮素作用抑制剂和美白剂可以以皮肤外用剂的形态使用。“皮肤外用剂”是指作为皮肤化妆品、外用医药品、外用医药部外品等施用于皮肤的外用剂，其剂型也能够采取水溶液体系、增溶体系、乳化体系、粉末体系、凝胶体系、软膏体系、乳脂、水-油双层体系、水-油-粉末三层体系等广泛的形态。例如，可以列举洗面料、化妆水、乳液、乳脂、凝胶、精华液（美容液）、敷面膏、面膜、粉底、软膏、薄片状制品等的形态。

在以皮肤外用剂的形态使用的情况下，除了所述通式（1）所表示的化合物或者通过本发明的方法得到的羊角衣酸含量高的地茶提取物以外，可以适当配合通常的皮肤外用剂中所用的成分，例如表面活性剂、油性物质、高分子化合物、防腐剂、上述以外的药效成分、粉体、紫外线吸收剂、色素、香料、乳化稳定剂、pH调节剂等。另外，含有所述通式（1）所表示的化合物或者所述羊角衣酸含量高的地茶提取物的皮肤外用剂的使用量根据有效成分的含量不同而不同，例如，在乳脂状、软膏状的情况下，优选每1cm²皮肤面积使用0.1～5μg；在液体制剂的情况下，优选每1cm²皮肤面积使用0.1～10μg。

实施例

以下，基于实施例更详细地说明本发明，但本发明并没有被限定于此。在以下的试验例和实施例中，作为地茶使用雪茶（Thamnoliavermicularis）

制造例

（制造例1）羊角衣酸

在41.6g雪茶（新和物产公司制造）中加入1L95%乙醇水溶液，在30℃下提取30天之后，过滤，用200mL95%乙醇水溶液清洗滤纸上的雪茶，加上最初的滤液，得到1100mL雪茶提取物（固形物成分2.98g）。用HPLC对56mL该提取物（固形物成分151.7mg）进行分离，得到28.00mg羊角衣酸（收率18.5%）。

分离成分的结构分析通过NMR进行。由于分离成分的NMR光谱数据与文献中报道的羊角衣酸（参照日本食品化学学会刊（日食化刊）Vol.14(2),2007）的光谱数据几乎一致，因此，鉴定分离的成分为羊角衣酸。将通过NMR的结构分析的结果表示于表1中。另外，表中的Me表示甲基。

表1：

羊角衣酸

（参考例1）鳞片酸

用HPLC对24mL制造例1中得到的雪茶提取物（固形物成分65.04mg）进行分离，得到5.6mg鳞片酸（收率8.61%）。分离成分的结构分析通过NMR进行。由于分离成分的NMR光谱数据与文献中报道的鳞片酸（Yunnan Zhiwu Yanjiu，24(4)，525-530(2002)）的光谱数据几乎一致，因此，鉴定分离的成分为鳞片酸。将通过NMR的结构分析的结果表示于表2中。另外，表中的Me表示甲基。

表2：

鳞片酸

（制造例2）巴尔巴地衣酸

将作为试剂市售的巴尔巴地衣酸（由NAMIKI SHOJI CO.,LTD.取得）用于后述的活性评价。

（制造例3）地弗地衣酸

将作为试剂市售的地弗地衣酸（由NAMIKI SHOJI CO.,LTD.取得）用于后述的活性评价。

（参考例2）德国洋甘菊提取物

在40g德国洋甘菊（日本名：母菊，由新和物产株式会社取得）的花序中加入400mL含有50%乙醇的水溶液，在室温下提取14天之后，过滤，得到德国洋甘菊提取物（221mL）（蒸发残留成分2.63%）。

实施例1内皮素作用抑制效果的验证

对于上述制造的各化合物以及提取物，使用下述的评价体系验证内皮素作用抑制效果。

（1）评价体系

将来自正常人类新生儿表皮的黑素细胞（NHEMs，KURABOINDUSTRIES LTD.）以3×10⁴cells/well（200μL/well）接种于荧光检测用的96孔板上，在5%CO₂下37℃下进行培养。对于培养基，使用含有PMA（—）的增殖用添加剂（HMGS）的Medium254。

培养3天之后，将培养板倾析从中除去培养基，置换为含有细胞内Ca²⁺⁺测定试剂Fluo4-AM的分析缓冲液，在37℃下培养1小时。接着，在FDSS（Functional Drug Screening System）机器中在测定开始20秒之后对规定浓度的上述化合物前处理1分钟之后，添加作为配体的内皮素（ET-1，终浓度100nM），在Ex.480nm/Em.540nm的测定波长下从测定开始直至5分钟后经时检测Fluo4-AM的荧光。

通过将对照中的Fluo4-AM的荧光增加比（Max ratio-Min ratio）作为100的情况下的相对值（%），算出各化合物的细胞内钙（钙离子）浓度上升率（%），评价内皮素作用抑制效果。另外，作为对照，以0.1～0.5v/v%的终浓度添加乙醇或者10～95v/v%的含水乙醇溶液。

（2）参考例：德国洋甘菊提取物的评价

作为阳性对照，使用上述调制的德国洋甘菊提取物（蒸发残留成分2.63%，50%乙醇溶剂）。德国洋甘菊提取物已知抑制由内皮素的作用引起的黑素细胞的Ca浓度上升，并且抑制黑色素产生。

以0.5v/v%和1.0v/v%的终浓度对德国洋甘菊提取物进行前处理，供给上述评价体系，算出由内皮素刺激引起的钙（Ca）浓度上升率（N=6）。将结果表示于图1中。

由图1可以明确，添加了德国洋甘菊提取物的体系中确认有浓度依赖性Ca浓度上升抑制作用。特别是浓度为1v/v%的体系中，抑制了20%以上的Ca浓度上升，确认有优异的内皮素抑制作用。

（3）本发明的化合物的评价

以表3所示的终浓度对上述调制的化合物进行前处理，供给到上述评价体系，算出由内皮素刺激引起的Ca浓度上升率（N=6）。将结果表示于表3中。

表3：

化合物浓度（μM）细胞内Ca浓度上升率（%）备注羊角衣酸5052.7本发明鳞片酸5095.9参考例巴尔巴地衣酸5038.4本发明地弗地衣酸5028.0本发明

由表3可以确认，在添加有羊角衣酸、巴尔巴地衣酸、地弗地衣酸的体系中，在浓度为50μM时都能够抑制由内皮素刺激引起的细胞内Ca浓度上升45%以上。即是说，所述通式（1）所表示的化合物具有优异的内皮素抑制作用，其抑制效果高于公知的美白成分的德国洋甘菊提取物。

另一方面，在添加有鳞片酸的体系中，在浓度为50μM时抑制细胞内Ca浓度上升至约4%左右。

实施例2黑色素产生抑制作用的验证

使用上述制造的羊角衣酸，对于皮肤中的黑色素产生的抑制作用进行验证。

使用以10nM的终浓度添加有黑素细胞活化因子的内皮素-1（ET-1）和SCF（干细胞增殖因子）的EPI-100-NMM113培养基，在37℃、5%CO₂条件下培养含有黑素细胞的三维培养皮肤模型（MEL300A，KURABO INDUSTRIES LTD.）。自培养第一天，以50μM的终浓度添加羊角衣酸（N=2）。培养基3天进行一次交换。14天之后，用PBS清洗皮肤模型，进行照片拍摄。将结果表示于图2中。其后，使用分析缓冲试剂测定细胞呼吸活性，确认上述终浓度是没有表现出细胞毒性的浓度（结果没有图示）。

接着，用PBS清洗皮肤模型杯，用小镊子剥离皮肤片移至管中，用PBS清洗3次。用50%乙醇清洗3次，再用100%乙醇清洗2次之后，在室温下放置一晚，使之完全干燥。加入200μL2M的NaOH之后，在100℃下使之溶解，对于通过离心分离得到的上层清液在405nm的测定波长下测定吸光度，算出黑色素量。将结果表示于图3中。黑色素量表示为将对照的黑色素量作为100的情况下的相对值（%）。另外，作为对照，以0.1～0.5v/v%的终浓度添加乙醇或者10～95v/v%的含水乙醇溶液。

由图2可以明确，在添加有羊角衣酸的体系中，与对照的体系相比皮肤的颜色更亮，抑制了由于黑色素产生而造成的皮肤的黑化。另外，如图3所示，在添加有羊角衣酸的体系中，在没有显示细胞毒性的添加浓度下，与对照的体系相比皮肤组织中的黑色素量降低了40%以上。

如上所述，已知内皮素作用于黑素细胞使钙浓度上升，并且使黑色素产生增加（参照Yada et al.(1991)J.Biol.Chem.266,18352-18357、Imokawa et al.(1992)J.Biol.Chem.267,24675-24680），抑制内皮素的该作用的物质作为美白成分有用。在本发明的上述实施例中，实际确认了抑制内皮素对黑素细胞的作用的物质可以有效地抑制黑色素产生。因此，所述通式（1）所表示的化合物通过有效地抑制促进细胞内钙浓度上升的内皮素的作用，从而可以抑制黑色素产生，其作为美白剂是有用的。

接着，使用上述分离的鳞片酸，与上述同样地验证黑色素产生抑制作用。在添加有鳞片酸的体系中，没有发现如羊角衣酸那样显著的黑色素量的降低。

因此，可知地茶所含的羊角衣酸抑制了由内皮素作用引起的细胞内Ca浓度上升，显著地抑制了皮肤中的黑色素产生。另一方面，即使是相同地茶中所含的成分，鳞片酸几乎没有发现有内皮素作用抑制效果以及黑色素产生抑制效果。

实施例3-1

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL60%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到75.9g雪茶提取物（蒸发残留成分0.45（w/v）%）。

实施例3-2

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL70%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到74.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.52（w/v）%）。

实施例3-3

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL80%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到72.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.50（w/v）%）。

实施例3-4

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL90%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到71.7g雪茶提取物（蒸发残留成分0.46（w/v）%）。

实施例3-5

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL95%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到69.3g雪茶提取物（蒸发残留成分0.52（w/v）%）。

实施例3-6

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL99.5%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到67.5g雪茶提取物（蒸发残留成分0.47（w/v）%）。

参考例3-1

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL10%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到80.0g雪茶提取物（蒸发残留成分0.69（w/v）%）。

参考例3-2

与日本特开2006-182731中记载的方法同样地，在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得，中国产）中加入100mL50%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到77.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.51（w/v）%）。

羊角衣酸浓度的测定（1）

在下述的条件下使用HPLC对上述实施例3-1～3-6以及参考例3-1和3-2中得到的各雪茶提取物的羊角衣酸含量进行分析。测定中使用的装置以及测定条件如下所述。将结果表示于表4中。

测定机器：日立HPLC多系统软件Z30ZL200、日立HPLC ManagerD-7000、日立HPLC用自动取样器L-7200、日立HPLC用柱温箱L-7300、日立HPLC用紫外可见检测器L-7420、日立HPLC泵L-7100

<HPLC分析条件>

流速：0.75mL/min

使用的柱：Inertsil ODS-35μm(GL Science)，3.0I.D.×150mm

柱温度：40℃

移动相：含有0.1%三氟乙酸的水溶液：含有0.1%三氟乙酸的甲醇=30:70（羊角衣酸保留时间9.06min）

检测波长：254nm

表4：

由表4的结果可以明确，在提取溶剂的醇浓度为50%以下的情况下，提取物中的羊角衣酸浓度显示同样低的值。另一方面，如果提取溶剂的醇浓度为60%以上，则提取物中的羊角衣酸浓度急剧地增加。

实施例4-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL60%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到79.8g雪茶提取物（蒸发残留成分0.26（w/v）%）。

实施例4-2

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL70%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到78.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.27（w/v）%）。

实施例4-3

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL80%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到75.8g雪茶提取物（蒸发残留成分0.28（w/v）%）。

实施例4-4

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL90%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到74.0g雪茶提取物（蒸发残留成分0.30（w/v）%）。

实施例4-5

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL95%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到72.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.34（w/v）%）。

实施例4-6

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL99.5%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到70.7g雪茶提取物（蒸发残留成分0.30（w/v）%）。

参考例4-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL10%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到86.2g雪茶提取物（蒸发残留成分0.36（w/v）%）。

参考例4-2

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL50%乙醇溶液，在40℃下提取一周之后，过滤，得到81.7g雪茶提取物（蒸发残留成分0.29（w/v）%）。

羊角衣酸浓度的测定（2）

与上述羊角衣酸浓度的测定（1）同样地，对上述实施例4-1～4-6以及参考例4-1和4-2中得到的各提取物中的羊角衣酸浓度进行测定。将结果表示于表5中。

表5：

由表5的结果可以明确，在提取溶剂的醇浓度为50%以下的情况下，提取物中的羊角衣酸浓度显示同样低的值。另一方面，可知如果提取溶剂的醇浓度为60%以上，则提取物中的羊角衣酸浓度急剧地增加。另外，与表4的结果比较可知，雪茶的使用相对于溶剂量越少，随着醇浓度的变化羊角衣酸浓度的上升越显著。

实施例5-1

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL100%1,3-丁二醇，在40℃下提取一周之后，过滤，得到86.95g雪茶提取物（蒸发残留成分0.26（w/v）%）。

参考例5-1

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL50%1,3-丁二醇，在40℃下提取一周之后，过滤，得到86.07g雪茶提取物（蒸发残留成分0.35（w/v）%）。

羊角衣酸浓度的测定（3）

与上述羊角衣酸浓度的测定（1）同样地，对上述实施例5-1以及参考例5-1中得到的各提取物中的羊角衣酸浓度进行测定。将结果表示于表6中。

表6：

BG=1,3-丁二醇

由表6可以明确，作为溶剂使用50%1,3-丁二醇得到的提取物中羊角衣酸浓度较低，相对于此，使用100%1,3-丁二醇得到的提取物中羊角衣酸浓度显示非常高的值。

实施例6-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL四氢呋喃，在40℃下提取一周之后，过滤，得到75.3g雪茶提取物（蒸发残留成分0.32（w/v）%）。

实施例6-2

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL1,4-二氧六环，在40℃下提取一周之后，过滤，得到93.4g雪茶提取物（蒸发残留成分0.32（w/v）%）。

实施例6-3

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL聚乙二醇（PEG200），在40℃下提取一周之后，过滤，得到100.1g雪茶提取物。

实施例6-4

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL聚乙二醇（PEG400），在40℃下提取一周之后，过滤，得到100.0g雪茶提取物。

实施例6-5

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL聚乙二醇（PEG600），在40℃下提取一周之后，过滤，得到98.1g雪茶提取物。

实施例6-6

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL聚氧乙烯甲基糖苷（商品名称：Gurukamu E-10，Noveon公司制造），在40℃下提取一周之后，通过倾析将雪茶与提取物分离，得到74.4g雪茶提取物。

实施例6-7

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL聚氧乙烯甲基糖苷（商品名称：Gurukamu E-20，Noveon公司制造），在40℃下提取一周之后，通过倾析将雪茶与提取物分离，得到111.3g雪茶提取物。

参考例6-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL乙醚，在40℃下提取一周之后，过滤，得到60.7g雪茶提取物（蒸发残留成分0.03（w/v）%）。

参考例6-2

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL棕榈基-1,3-二甲基丁基醚，在40℃下提取一周之后，过滤，得到70.5g雪茶提取物。

羊角衣酸浓度的测定（4）

与上述羊角衣酸浓度的测定（1）同样地，测定实施例6-1～6-7以及参考例6-1和6-2中得到的各提取物中的羊角衣酸浓度。将结果表示于表7中。

表7：

由表7的结果可以明确，作为溶剂使用氧原子数为1的链状醚得到的提取物（参考例6-1、6-2）中羊角衣酸浓度较低，相对于此，使用环状醚和氧原子数为2以上的醚得到的提取物（实施例6-1～6-7）中羊角衣酸浓度表现出非常高的值。

实施例7-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL乙酸乙酯，在40℃下提取一周之后，过滤，得到81.3g雪茶提取物（蒸发残留成分0.14（w/v）%）。

实施例7-2

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入50mL乙酸乙酯和50mL99.5%乙醇的混合溶剂，在40℃下提取一周之后，过滤，得到76.2g雪茶提取物（蒸发残留成分0.34（w/v）%）。

实施例7-3

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入50mL乙酸乙酯和50mL95%乙醇水溶液的混合溶剂，在40℃下提取一周之后，过滤，得到77.2g雪茶提取物（蒸发残留成分0.37（w/v）%）。

实施例7-4

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入50mL乙酸乙酯和50mL50%乙醇水溶液的混合溶剂，在40℃下提取一周之后，过滤，得到80.1g雪茶提取物（蒸发残留成分0.44（w/v）%）。

参考例7-1

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL氯仿，在40℃下提取一周之后，过滤，得到132.6g雪茶提取物（蒸发残留成分0.04（w/v）%）。

参考例7-2

在5.0g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL己烷，在40℃下提取一周之后，过滤，得到51.8g雪茶提取物（蒸发残留成分0.02（w/v）%）。

参考例7-3

在2.5g雪茶（由新和物产株式会社取得）中加入100mL甲苯，在40℃下提取一周之后，过滤，得到70.9g雪茶提取物（蒸发残留成分0.01（w/v）%）。

羊角衣酸浓度的测定（5）

与上述羊角衣酸浓度的测定（1）同样地，测定实施例7-1～7-4以及参考例7-1～7-3中得到的各提取物中的羊角衣酸浓度。将结果表示于表8中。

表8：

由表8可以明确，使用烃溶剂或者卤素类溶剂得到的提取物中羊角衣酸浓度较低，相对于此，使用乙酸乙酯及其混合溶剂得到的提取物中羊角衣酸浓度表现出非常高的值。

实施例8内皮素作用抑制效果的验证

1．雪茶提取物

使用上述实施例1的评价体系，验证上述实施例3中得到的雪茶提取物的内皮素作用抑制效果。

作为评价样品，使用实施例3-1、3-2、3-3、3-5、3-6或者其稀释品、以及参考例3-1、3-2中得到的提取物。以下述表9所示的评价浓度对这些提取物进行前处理，提供给上述评价体系，算出由内皮素刺激而引起的Ca浓度上升率（N=6）。另外，对各提取物，在将溶剂置换为DMSO之后，在上述试验中添加0.6v/v%进行评价。作为对照，使用添加了0.6v/v%DMSO的物质。将结果表示于表9中。

2．德国洋甘菊提取物

以0.5v/v%的终浓度对上述参考例2中得到的德国洋甘菊提取物进行前处理，提供给与上述雪茶提取物同样的评价体系，算出由于内皮素刺激而产生的钙（Ca）浓度上升率（N=6）。将结果表示于表9中。

表9：

由表9可以明确，在添加有用醇浓度为50%以下的溶剂提取得到的提取物的体系（样品1和2）中，细胞内Ca浓度上升率几乎没有变化。相对于此，在添加有用醇浓度为60%以上的溶剂提取得到的提取物的体系（样品3～8）中，由于内皮素刺激导致的细胞内Ca浓度上升率显著降低。另外，样品3～8的细胞内Ca浓度上升抑制作用与作为公知的美白成分的德国洋甘菊提取物（样品9）的程度相同，或者在其以上。

由以上的结果可知，使用特定的提取溶剂得到的本发明的地茶提取物具有优异的内皮素抑制作用。

（配方例）

将所述制造例1～3中得到的化合物作为有效成分，通过通常的方法分别调制下述所示组成的洗剂、乳液、美白液和乳脂。

1．洗剂的调制

2.乳液的调制

3．美容液的调制

4．美容液的调制

5．乳脂的调制

尽管将本发明与其实施方式一起进行说明，但是，除非特别指定，本发明并不限于说明的任意详细部分，可以在不违反附加的权利要求所示的发明精神和范围的情况下进行广泛的解释。

本申请基于2010年12月13日在日本进行专利申请的日本特愿2010-277001以及2010年12月13日在日本进行专利申请的日本特愿2010-277002主张优先权，在此作为参照并将其内容作为本说明书记载的一部分引入。