制备机会性感染和慢性消耗性疾病非人动物模型的方法及利用该模型筛选的药物

摘要

本发明公开了一种机会性感染和慢性消耗性疾病动物模型的建立方法，还公开了一种用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方，它由按重量份比计的附子100~180份，干姜100~180份，甘草100~160份制成。本发明的积极效果是：找到了建立机会性感染和慢性消耗性疾病动物模型的方法，且本模型具高度的可控性、可靠性、可重复性且使用方便、经济；模型证候符合临床机会性感染和慢性消耗性疾病发病过程；造模因素符合《内经》理论,不涉及病原生物，降低试验风险，保障生物安全；筛选获得的中药复方具有高效、无毒、药源广泛、使用方便、经济等特征，具有延长机会性感染和慢性消耗性疾病患者寿命、提高患者生活质量、改善各组织病变的作用，大剂量使用未见毒副反应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种非人动物模型，具体是制备机会性感染和慢性消耗性疾病非人动物模型的方法。本发明还涉及利用该模型筛选的方法，及筛选的治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的药物。

背景技术

机会性感染是指一些致病力较弱的病原体，在人体免疫功能正常时不能致病，但当人体免疫功能降低时，它们乘虚而入，侵入人体内，导致各种疾病。正常菌群在机体免疫功能低下，寄居部位改变或菌群失调等特定条件下也可引起感染。可见于以下情况：（1）皮肤和粘膜的表面屏障作用受到破坏，如损伤、烧伤、插管、手术等。（2）先天性免疫缺陷。包括：①体液免疫缺陷，如先天性无γ-球蛋白血症患者，常发生反复感染，尤其是细菌感染。②细胞免疫功能缺陷的患者，如胸腺不发育或发育不良的患者，极易发生病毒、结核菌或真菌感染，也易患寄生虫病如卡氏肺孢子虫感染。③严重联合免疫缺陷症，患者的T细胞及B细胞的免疫功能完全缺失，常在出生后1年内死于感染。（3）继发性免疫缺陷。如晚期肿瘤病人、应用免疫抑制剂类固醇激素、抗代谢药、烷化剂和叶酸拮抗剂等的患者、身体虚弱者及慢性病病人、某些感染如麻疹、传染性单核细胞增多症等的患者，常因免疫功能减退，易发生感染。（4）获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。AIDS是因机体免疫低下或缺陷，由累及全身多系统多器官的多种代谢紊乱和免疫失调组成，患者常死于机会性感染和代谢严重失常后的消耗性恶病质。人免疫缺陷病毒（HIV）和非HIV病毒感染均可引起AIDS，可累及眼、皮肤、泌尿系统、呼吸系统、消化系统、中枢神经系统等组织系统。HIV病毒主要侵犯辅助性T淋巴细胞，使这种细胞的数量明显减低，受感染的器官系统广泛，患者被感染的机会频繁，病人几乎都死于继发感染和肿瘤。目前，针对HIV引起获得性免疫缺陷综合征的治疗，常采用高效抗逆转录病毒疗法（HAART），尽管HAART疗法可使患者的血浆HIV载量及CD4⁺T淋巴细胞计数得到一定的改善，但多数患者出现临床症状恶化，甚至死亡。当前，HIV引起的获得性免疫缺陷综合征的发生仍在快速增长，发病率高、发病机制不清、表现形式多样、治疗无特异性是获得性免疫缺陷综合征的重要特征，已成为国内外艾滋病研究的热点课题。此外，非HIV病毒因素导致的获得性免疫缺陷综合征的产生原因、形成机制也不明了，其治疗亦是亟待解决的问题。（5）某些抗生素的长期应用，可抑制正常的菌丛，而这有利于某些条件致病菌如真菌的生长，从而导致机会性感染。（6）免疫过剩（自身免疫性疾病）。感染多发生于自身免疫性疾病发病的多年以前。临床常采用免疫抑制剂及抗感染药物等综合措施，但易引起患者免疫功能下降，诱发机会性感染。（7）器官移植术后。临床上，为抑制器官移植术后的宿主抗移植物反应及移植物抗宿主反应，常用免疫抑制药物，但易诱发感染。上述情况下，患者临床上常表现为反复感染或严重感染性疾病，甚至导致患者死亡。针对上述机会性感染，临床的主要措施治疗为：（1）消灭病原体。常用抗感染药物，如抗菌药物、抗真菌药、抗病毒药等，但抗感染药的应用会带来不同程度和类型的不良反应，如耐药性、广谱抗菌药的长期应用的二重感染、AIDS的抗反转录病毒治疗(ART)后出现的“免疫重建炎性综合征（IRIS）”——机体免疫功能重建过程中出现的临床症状恶化的异常表现、重要组织器官损伤等。（2）设法提高人体的免疫功能，如加强营养、输新鲜血或白细胞，注射γ-球蛋白、胸腺肽、特异性免疫核糖核酸等，但临床疗效有限并带来一定的不良反应。因此，开发促进机体免疫功能重建、低毒或无毒的药物，有望提高治疗机会性感染的效果。

慢性消耗性疾病一般是指各种恶性肿瘤、肺结核、慢性萎缩性胃炎、严重创伤、烧伤、系统性红斑狼疮、慢性化脓性感染、慢性失血等一类过度消耗身体能量物质，造成机体能量负平衡的疾病总称。表现为厌食症、慢性萎缩性胃炎、慢性结肠炎、慢性肝炎、结核病、肿瘤（尤其是恶性肿瘤)、甲亢、糖尿病等。患者常出现恶病质，极度消瘦，最终因过度衰弱而死亡。临床治疗措施为：（1）针对营养摄入不足、厌食症、长期过度节食等患者，常采用增加患者营养供应的措施；（2）针对慢性萎缩性胃炎、慢性结肠炎、慢性肝炎等患者，采用改善营养吸收、抗菌等措施；（3）对于结核病、肿瘤等患者，采用抗菌、抗肿瘤治疗（化疗、放疗、手术等措施）以及降低患者营养消耗等措施；（4）针对甲亢、糖尿病等患者，常采取改善患者代谢功能的治疗措施。上述临床治疗措施常会引起多种不良反应，导致慢性消耗性疾病的临床疗效尚不理想。因此，研发高效、低毒或无毒的治疗慢性消耗性疾病的药物，已成为当务之急。

采用动物模型研究机会性感染和慢性消耗性疾病比采用人体试验进行研究更易实现。利用适宜的动物机会性感染和慢性消耗性疾病模型进行机会性感染和慢性消耗性疾病研究具高度的可控性、可靠性、可重复性,同时可缩短研究进程,减少干扰因素,降低试验风险。具有中医证候特征的机会性感染和慢性消耗性疾病动物模型研究方面属于空白,筛选机会性感染和慢性消耗性疾病治疗药物及疗效的科学客观评价带来了明显障碍。

发明内容

本发明在于提供制备机会性感染和慢性消耗性疾病非人动物模型的方法。

实现本发明目的的技术方案是：包含如下步骤：

包含如下步骤：

（1）将每只雄性非人动物于每天18:00与6-10只，雌性非人动物合笼，并使之交配，

（2）次日9:00-9:30、12:30-13:00、17:00-17:30三个时间段，使上述雄性非人动物进行游泳，每次游泳结束后给予喂食低于或等于4摄氏度的蒸馏水或凉开水，

（3）连续7天，

（4）挑选出现下述症状的的非人动物：眼病+脱毛+腹胀腹泻+血尿+机会感染。

其中,

所述非人动物选自：大鼠、小鼠；

所述机会感染包括：肺炎链球菌、金葡球菌、变异杆菌、白色念珠菌、肾霉菌感染和/或肠道粪类圆线虫感染；

所述机会感染通过病原检测发现。

一般利用小鼠比较方便，所以实现本发明目的的较佳的方案是，（1）：将每只1月龄的清洁级雄小鼠于每天18:00与6-10只雌性小鼠合笼，并使之交配；（2）：次日9:00-9:30、12:30-13:00、17:00-17:30三个时间段，使上述雄小鼠进行游泳，每次游泳结束后给予低于或等于4摄氏度的蒸馏水或凉开水3ml，（3）连续7天，（4）挑选出现下述症状的的雄小鼠：病+脱毛+腹胀腹泻+血尿+机会感染。

本发明的方法以出现“眼病+脱毛+腹胀腹泻+血尿+机会感染”作为造模成功。

本模型建立的理论依据是：

根据机会性感染和慢性消耗性疾病的病变过程和临床症状，机会性感染和慢性消耗性疾病应属于中医“疫病”、“虚劳”等范畴。出现机会性感染和慢性消耗性疾病外因主要是感受疫毒之邪，损伤机体正气，内因是精气夺导致正气耗损，气血俱虚，日久则五脏俱虚，最终导致正不胜邪，它病从生。我们根据 “精气夺则虚→邪气盛则实→正邪相争则传变”的《内经》理论，建立了符机会性感染和慢性消耗性疾病的小鼠模型。

本发明的制备机会性感染和慢性消耗性疾病非人动物模型的方法，其优点是：①本模型具高度的可控性、可靠性、可重复性且使用方便、经济；②本模型证候符合临床发病过程；③造模因素符合《内经》理论；④本模型建立不需要用病原生物感染动物，降低试验风险，保障生物安全。

本发明的另一目的是提供筛选治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的药物的方法，该方法利用按照前述方法制备的非人动物模型，包括如下步骤：

（1）以备选物质对按照前述方法制备的非人动物模型给药，并且

（2）观察、检查和/或检测该动物模型的机会性感染和慢性消耗性疾病状况的变化，

（3）挑选出能够减轻症状、延长寿命和/或降低死亡率的物质，以此作为治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的药物或作为治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的药物的有效成份。

其中所述备选物质包括：中药单方、中药复方、化合物、组合物。这里，中药包括民族药，如：藏药、蒙药、苗药、瑶药、壮药、傣药、彝药、畲药、维药。

其中所述给药是：将备选物质直接或处理成便于给药的形式，通过口服或注射的方式进入该动物模型体内。此外也可以采取任何的适合的给药方式。

本发明中，筛选治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的药物的方法，在原则上、一般方法上及具体的过程、实验、检测、药物制备、剂型剂量、用药等所有的药物研发筛选的全部相关事项，均与规范的、常规的或法律法规规定的方法和要求一致。

本发明的第三个目的在于提供一种用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。该中药复方利用按照前述方法制备的非人动物模型，通过前述的筛选方法获得。

该中药复方，由下述按重量份配比的原料制成：附子100~180份，干姜100~180份，甘草100~160份。

本中药复方优选的重量份配比是：附子150份，干姜150份，甘草150份。

所述的原料均为干品。

本中药复方可由包括如下步骤的方法制备：

（1）按照原料药重量比例称取中药材，碎断；

（2）加药材总量5~9倍量水，煮沸后小火提取3~6小时；

（3）过滤去渣，得水提液，所得水提液即为用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。

将上述水提液按照常规的药品制造方法，制成以其为全部成份或部分成份的口服液或注射剂、片剂、胶囊、颗粒药剂以治疗机会性感染和慢性消耗性疾病。 

本中药复方各组份的药理作用是：

附子：辛、甘，大热；有毒。归心、肾、脾经。具有回阳救逆，补火助阳，逐风寒湿邪之功效。主治亡阳虚脱，肢冷脉微，阳痿，宫冷，心腹冷痛，虚寒吐泻，阴寒水肿，寒湿痹痛等。《本草汇言》云：“附子，回阳气，散阴寒。……凡属阳虚阴极之候，肺肾元热证者，服之有起死之殊功。” 用于阴盛克阳，大汗亡阳，吐泻厥逆，肢冷脉微，心腹冷痛，冷痢，脚气水肿，风寒湿痹，阳痿，宫冷，虚寒吐泻，阴寒水肿，阳虚外感，阴疽疮疡以及一切沉寒痼冷之疾。而且附子对垂体——肾上腺皮质系统有兴奋作用，还能兴奋迷走神经而具强心作用。药理作用：强心、抗心律失常、抗休克、扩张血管、增加血流量、增强肾上腺皮质系统的功能、抗寒冷等作用；以及抗炎，镇痛、抗寒冷、提高对缺氧的耐受能力等作用。

干姜：味辛，性热。归脾、胃、心、肺经。具有温中散寒、回阳通脉、燥湿消痰、温肺化饮的作用。主治脘腹冷痛、呕吐、泄泻、肢冷脉微、亡阳厥逆、寒饮喘咳、寒湿痹痛。药理作用：具有兴奋豚鼠离体肠管、兴奋血管运动中枢及心脏呼吸中枢、兴奋心脏、抗组胺、抑菌、抑制血小板凝集等作用。

甘草：味甘，性平，无毒。具有益气补中、缓急止痛、润肺止咳、泻火解毒、调和诸药、利尿之功效。主治倦怠食少、肌瘦面黄、心悸气短、腹痛便溏、四肢挛急疼痛、脏躁、咳嗽气喘、咽喉肿痛、痈疮肿痛、小儿胎毒及药物、食物中毒。也用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹和四肢挛急疼痛、热淋尿痛、痈肿疮毒以及缓解药物毒性、烈性。药理作用：具有抗炎、抗病毒、治疗溃疡、保肝解毒、增强免疫功能、抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。临床被广泛用于治疗胃及十二指肠溃疡、各种急慢性肝炎、支气管炎、艾滋病和抗动脉粥样硬化形成。

实验证实，本发明的用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方，具有延长机会性感染和慢性消耗性疾病小鼠寿命、降低死亡率，并能改善机会性感染和慢性消耗性疾病小鼠眼、肺、肝、肾等组织病理学改变，且用药后无毒副作用，为一种高效、低毒、药源广、使用方便、经济的中药复方。

具体实施方式

中药复方制备

实施例1

称取：附子150g，干姜150g，甘草150g。

上述原料均为干品。

然后，

（1）碎断至1~3mm；

（2）加水2500g，煮沸后小火提取4小时；

（3）过滤去渣，得水提液450ml。即每毫升含生药1克。

所得水提液即为用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。

实施例2

称取：附子100g，干姜100g，甘草160g。

上述原料均为干品。

然后，

（1）碎断至1~3mm；

（2）加水3200g，煮沸后小火提取6小时；

（3）过滤去渣，得水提液450ml。即每毫升含生药1克。

所得水提液即为用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。

实施例3

称取：附子180g，干姜180g，甘草100g。

上述原料均为干品。

然后，

（1）碎断至1~3mm；

（2）加水3220g，煮沸后小火提取6小时；

（3）过滤去渣，得水提液450ml。即每毫升含生药1克。

所得水提液即为用于治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。

建模与药物治疗

昆明种雄小鼠72只，体重16.9±2 g，1月龄，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：GLMC20130308HL。

将1月龄的清洁级雄小鼠随机分为2组：①正常对照组（CTRL， 24只）：每日9:00-9:30、12:30-13:00、17:00-17:30三个时间段进行游泳，每次游泳结束后给予28℃蒸馏水3ml，连续7天。②模型组（MAIDS， 48只）：造模因素包括“房劳失精+疲倦+内湿寒”，每日18:00先将每只雄性小鼠与6-10只雌性小鼠合笼交配，次日白天进行与对照组相同的游泳，每次游泳结束后给予低于或等于4摄氏度的蒸馏水3ml，连续7天。

造模成功后，模型组分成不治疗组和中药复方治疗组两组，每组24只。不治疗组不予药物治疗，每日灌胃自来水，每只1 毫升。

中药复方治疗组给与本发明所得的中药复方治疗。中药复方原料共450克（附子150g，干姜150g，甘草150g）加入2500毫升水,煎煮药汤450毫升,每毫升含生药1克,每日灌胃一次，每次1毫升,连续治疗7天后停药，观察小鼠寿命，并于给药后的第28天检测小鼠各组织病理学变化。

观察发现，正常对照组24只小鼠均不发病。

而模型组48只小鼠7天后出现：（1）眼病（眼结膜和角膜溃疡、出血、化脓→双眼闭合、失明）；（2）脱毛（相当于病人红斑皮疹）；（3）消化功能失常（严重腹胀、粘液便）；（4）血尿等代谢失常消耗性疾病；（5）消瘦；（6）高传染力；（7）病原检测发现肺炎链球菌、金葡球菌、变异杆菌、白色念珠菌、霉菌、大量粪类圆线虫等机会感染。模型组小鼠各组织的病理改变为：肺出血水肿、肠道粪类圆线虫、肾霉菌感染。

不治疗组发病小鼠7天内的死亡率高达87.5%。     

中药复方治疗组小鼠死亡率降低到12.5%，肺、肠、肾上述病理变化均得到明显改善，肠道粪类圆线虫全部被清除。

从实验的结果看，本发明的用于机会性感染和慢性消耗性疾病动物模型的建立方法能成功建立符合临床机会性感染和慢性消耗性疾病病变过程的动物模型；模型动物均出现机会感染及消耗性恶病质，眼、肺、肾、肠道均出现病理改变；且造模因素符合《内经》理论，本建模方法具高度的可控性、可靠性、可重复性且使用方便、经济；筛选所得的治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方具有延长机会性感染和慢性消耗性疾病小鼠寿命、降低死亡率，并能改善小鼠眼、肺、肝、肾等组织病理学改变，且用药后无毒副作用，为一种高效、低毒、药源广、使用方便、经济的治疗机会性感染和慢性消耗性疾病的中药复方。