一种基于多元统计分析判别酱油种类的方法

摘要

本发明公开一种基于多元统计分析判别酱油种类的方法，利用多元统计分析技术建立了酿造酱油和配制酱油挥发性成分的标准聚类空间，然后通过计算得到待测样品在两个标准聚类空间所在主成分空间的投影点，并比较该投影点与两个标准聚类空间重心的空间距离，如果与酿造酱油标准聚类空间的重心的距离小于与配制酱油标准聚类空间的重心的距离，则判别该待测酱油样品为酿造酱油，反之则为配制酱油，这样即可实现酿造酱油和配制酱油的鉴别。本发明的酿造酱油和配制酱油的鉴别方法操作简单，准确率高，适用面广。

说明书

技术领域

本发明涉及酱油的鉴别方法，尤其涉及一种能鉴别出酿造酱油和配制酱油的基 于多元统计分析判别酱油种类的方法。

背景技术

酱油是我国传统的酿造制品，迄今已有2000多年的历史，已成为老百姓日常生 活中不可或缺的调味品。目前我国酱油年产量达500万吨，占世界年产量的60%，年 总产值超过160亿元。按生产工艺的不同，酱油分为酿造酱油和配制酱油两种，酿造 酱油是指以大豆、小麦或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液 体调味品。而配制酱油是以酿造酱油为主体，与水解植物蛋白液(HVP)、食品添加剂 混合配制而成，生产成本较低。由于酿造酱油和配制酱油的价格差，不少不法商贩为 了追求高回报，将配制酱油冠以酿造酱油的名义出售，这严重侵害了广大消费者的利 益，因此，对酿造酱油与配制酱油进行鉴别具有十分重要的现实意义。

目前已有多种方法应用于酿造和配制酱油的鉴别，这些方法中大多是通过分析测 定配制酱油中的单个特征性成分进行鉴别，目前用于判定酿造酱油和非酿造酱油的指 标（也称特征提示物）主要有：氯丙醇（3-Monochlo-Propane-1，2-diol,3-MCPD）和 乙酰丙酸，但研究表明这两个特征提示物各自有其局限性：

1、配制酱油的原料HVP在生产过程中，在盐酸催化、高温条件下，约10h便 可将植物蛋白质彻底水解成游离氨基酸，其副反应生成3-MCPD，此物质会致癌及引 起不育症。酿造酱油中不含3-MCPD，因此可通过检测3-MCPD含量鉴别配制酱油。 然而研究表明：HVP生产过程中，通过在水解后期加入水解促进剂、负压水蒸气蒸 馏等工艺处理方法，从而使得HVP中3-MCPD的含量减小至无法检出，这使得通过 检测3-MCPD的含量来鉴别配制酱油和酿造酱油不能顺利进行。2、乙酰丙酸(又称为 果糖酸)是HVP中特有的一种成分。在HVP生产过程中，植物原料中淀粉经酸解成 葡萄糖，葡萄糖转化成羟甲基糠醛，再分解成乙酰丙酸，而传统发酵工艺生产的酿造 酱油仅含有极其微量的乙酰丙酸。在日本和台湾，通过测定酿造酱油中乙酰丙酸的含 量来区别酿造酱油和配制酱油，如果酱油中乙酰丙酸的含量超过0.1%，就证明不是 酿造酱油。但是李国基等对酿造酱油、HVP、焦糖色素中乙酰丙酸的含量进行了测定。 其中，酿造酱油中乙酰丙酸含量较低，HVP中乙酰丙酸含量较多(最高含量为15.79%)， 而焦糖色素中也测出含有乙酰丙酸(最高含量达8.02%)。焦糖色素是酿造酱油合法的 添加剂，因此，通过测定乙酰丙酸无法鉴别添加了焦糖色素的酿造酱油和配制酱油， 该方法具有较大的应用局限性。

为消除单一特征成分鉴别配制酱油的局限性，出现了基于多个酱油特征性组分而 建立的判别方法。赵国华等利用酿造酱油和配制酱油的红外光谱图的差异性，将傅里 叶变换中红外光谱结合最小偏二乘法（PLS）,对酿造酱油、配制酱油、HVP可实现 类别分析和鉴别。由于该方法是利用酿造酱油在红外光谱中的特征指纹峰进行鉴别， 而不同品牌、不同酿造工艺的酿造酱油的红外特征指纹峰并不完全相似，因此该方法 适用面较窄。

研究表明，酿造酱油的挥发性成分极其复杂，因此具有独特的香气。这些挥发性 成分主要来源于原料成分、米曲霉的代谢产物、耐盐酵母菌和耐盐细菌的代谢产物以 及非酶化反应生成物。目前报道的酿造酱油挥发性成分有300多种，游离醇、有机酸、 以及酯类是最重要的组成部分。配制酱油一般是通过酿造酱油和HVP配制而成，其 主要原料HVP在生产中的化学反应过程简单，挥发性成分较少，由于强酸和高温条 件的影响，产生了大量的吡嗪类挥发性成分。由于酿造酱油和配制酱油中的挥发性成 分在含量与组成上均具有差异性，因此，如何利用二者的差异性来鉴别配制酱油和酿 造酱油，这是本领域技术人员所要解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多元统计分析判别酱油种类的方法， 简化操作过程，提高准确率，扩大应用面。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是：

一种基于多元统计分析判别酱油种类的方法，包括如下步骤：

1）将作为标准样品的多种酿造酱油、多种配制酱油、多种水解植物蛋白液各 自加水后分别进行蒸馏、萃取、干燥、过滤、浓缩，得到浓缩液；

2）采用气相色谱-质谱联用仪器分析步骤1）得到的浓缩液，计算每一浓缩液 标准挥发性成分组中各挥发性成分峰面积占每一浓缩液总挥发性成分峰面积的比 值，根据比值数据建立主成分空间，并得到标准样品中的各酿造酱油样品的标准聚 类空间A以及标准样品中其余样品的标准聚类空间B；

3）将待测酱油样品加水后进行蒸馏、萃取、干燥、过滤、浓缩，得到浓缩液；

4）采用气相色谱-质谱联用仪器分析步骤3）得到的浓缩液，计算所述浓缩液 标准挥发性成分组中各挥发性成分峰面积占所述浓缩液总挥发性成分峰面积的比 值，得到主成分数据，将主成分数据在步骤2）中的主成分空间进行投影，计算并 比较投影点与聚类空间A的重心、聚类空间B的重心之间的直线距离，如投影点与 标准聚类空间A的重心之间的直线距离小于投影点与标准聚类空间B的重心之间的 直线距离，则判定所述待测样品为酿造酱油，反之则为配制酱油；

所述标准挥发性成分组中包括筛选出的配制酱油和酿造酱油共有的、且在配制 酱油和酿造酱油中所占含量差别大的多种挥发性成分。

优选地，所述标准挥发性成分组包括酯类挥发性成分、酸类挥发性成分、吡嗪 类挥发性成分。

优选地，所述标准挥发性成分中的酯类挥发性成分包括棕榈酸乙酯、顺-9-十 六碳烯酸乙酯油酸乙酯、亚油酸乙酯、十六碳烯酸乙酯、亚麻酸乙酯。

优选地，所述标准挥发性成分中的酸类挥发性成分包括肉豆蔻酸、十五烷酸、 棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八(烷)酸、油酸、亚油酸。

优选地，所述标准挥发性成分中的吡嗪类挥发性成分包括2-甲基吡嗪、2,5-二 甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、 2,6-二乙基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙烯基-6-甲基吡嗪。

优选地，步骤2）具体为：采用气相色谱-质谱联用仪器分析步骤1）得到的浓 缩液，计算每一浓缩液标准挥发性成分组中各挥发性成分峰面积占每一浓缩液总挥 发性成分峰面积的比值，将比值数据进行中心化处理和无量纲化处理，然后再进行 主成分分析，求得各标准样品在第一主成分和第二主成分的得分，以第一主成分为 x轴，第二主成分为y轴绘制主成分投影图，将各标准样品的第一主成分、第二主 成分的得分在主成分投影图分别进行描点，标准样品中的各酿造酱油样品在主成分 投影图形成标准聚类空间A，标准样品中的其余酱油样品在主成分投影图形成标准 聚类空间B。

优选地，步骤4）具体为：采用气相色谱-质谱联用仪器分析步骤3）得到的浓缩 液，计算所述浓缩液标准挥发性成分组中各挥发性成分峰面积占所述浓缩液总挥发性 成分峰面积的比值，将比值数据进行中心化处理和无量纲化处理，然后再进行主成分 分析，求得其在第一主成分和第二主成分上的得分，并在步骤2）构建的主成分空间 上进行投影，然后通过公式1计算出待测样品投影点与标准聚类空间A重心之间的 直线距离Ga，通过公式2计算出待测样品投影点与标准聚类空间B重心之间的直线 距离Gb，如果Ga<Gb，表明该样品为酿造酱油，反之，该样品为配制酱油；

$\mathrm{Ga}=\sqrt{{(x-x_{\mathrm{Da}})}^2+{(y-y_{\mathrm{Da}})}^2}$………………………………………公式1

$\mathrm{Gb}=\sqrt{{(x-x_{\mathrm{Db}})}^2+{(y-y_{\mathrm{Db}})}^2}$………………………………………公式2

x——待测样在第一主成分的得分；y为待测样在第二主成分的得分；

x_Da——标准聚类空间A重心的横坐标值，y_Da为标准聚类空间A重心的纵坐标 值；

x_Db——标准聚类空间B重心的横坐标值，y_Db为标准聚类空间B重心的纵坐标值。

优选地，步骤1）以及步骤3）中，采用同时蒸馏萃取器进行蒸馏萃取。

优选地，步骤1）具体为：将标准样品加水后接入同时蒸馏萃取器，设定蒸馏温 度为98℃～102℃；将乙醚接入同时蒸馏萃取器，设定蒸馏温度为38℃～42℃；冷凝 水的温度设定为3℃～8℃，然后进行同时蒸馏萃取2h～3h；在萃取所得的有机相中加 入干燥剂干燥然后过滤浓缩。

优选地，所述干燥剂为无水硫酸钠。

与现有技术相比，本发明的基于多元统计分析判别酱油种类的方法，利用多元 统计分析技术建立了酿造酱油和配制酱油挥发性成分的标准聚类空间，然后通过计 算得到待测样品在两个标准聚类空间所在主成分空间的投影点，并比较该投影点与 两个标准聚类空间重心的空间距离，如果与酿造酱油标准聚类空间的重心的距离小 于与配制酱油标准聚类空间的重心的距离，则判别该待测酱油样品为酿造酱油，反 之则为配制酱油，这样即可实现酿造酱油和配制酱油的鉴别。本发明的酿造酱油和 配制酱油的鉴别方法操作简单，准确率高，适用面广。

附图说明

图1为本发明形成的标准样品主成分投影图；

图2为本发明实施例一形成的标准样品与待测样品主成分投影图；

图3为本发明实施例二形成的标准样品与待测样品主成分投影图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例 对本发明作进一步的详细说明。

本发明的基于多元统计分析判别酱油种类的方法涉及到如下处理步骤：

a、样品特征组分获取：

准确量取200mL酱油样品置于1000mL的圆底烧瓶中，加入300mL蒸馏水， 接入同时蒸馏萃取器（SDE），设定蒸馏温度为100℃；准确量取50mL重蒸乙醚置 于100mL的圆底烧瓶中，接入SDE，设定蒸馏温度为40℃；冷凝水的温度设定为 （3-8℃）；然后进行同时蒸馏萃取2h；在萃取所得的有机相中加入4.0g无水硫酸 钠干燥过夜，过滤后浓缩至2mL。该步骤为萃取步骤，在实际操作中，也可采用其 他的萃取方案，并不局限于前述的步骤、仪器及工艺条件。

b、挥发性成分分析：

用气相色谱-质谱联用仪器（以下简称GC-MS）对浓缩液进行分析，分别获取 标准挥发性成分组中各挥发性成分的峰面积，并计算每一样品中各挥发性成分的峰 面积占标准挥发性成分组总的峰面积比值。其中，标准挥发性成分组中包括多种挥 发性成分，这些挥发性成分是配制酱油和酿造酱油所共有的，且这些挥发性成分在 配制酱油中的量与在酿造酱油中的量差别较大。一般来说，符合前述条件的挥发性 成分一般包括包括酯类挥发性成分、酸类挥发性成分、吡嗪类挥发性成分。本发明 中，标准挥发性成分组包括：棕榈酸乙酯、顺-9-十六碳烯酸乙酯油酸乙酯、亚油酸 乙酯、十六碳烯酸乙酯、亚麻酸乙酯、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、 硬脂酸；十八(烷)酸、油酸、亚油酸、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡 嗪、2-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪、3-乙基-2,5- 二甲基吡嗪、2-乙烯基-6-甲基吡嗪。在实际操作中，为了数据更准确，也可以筛选 出更多的挥发性成分加入到标准挥发性成分组。在实际操作中，为了操作效率更高， 也可去除前述标准样品组的某一种或几种挥发性成分。

GC-MS的参数设定如下：

气相色谱仪分析条件：

色谱柱为HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm)）。

升温程序：起始温度为50℃，维持5min后以2℃/min的速度升温到150℃， 再后以5℃/min的速度升温到240℃；

柱流量：1.0mL/min；进样口温度：260℃；

进样方式：不分流进样；

进样量:1μL。

质谱仪分析条件：EI离子源，电子能量70eV，电子倍增器电压350V，离子 源温度200℃，质量扫描范围33～450amu。

以上的GC-MS的参数仅为本发明可实施方案中的一种，在实际实施过程中， 并不局限于上述的参数，可以根据需要，设定为其他合适的参数。

本发明的基于多元统计分析判别酱油种类的方法包括如下步骤：

1、取8种市售的酿造制酱油、2种配制酱油样品、2种HVP以及2种自行用 酸水解蛋白液和酿造酱油配制的样品作为标准样品，将标准样品进行上述步骤a、 特征组分提取以及步骤b、挥发性成分分析处理后，再利用数学软件matlab将22 种挥发性成分的峰面积占比数据进行中心化处理和无量纲化处理（统称“标准化处 理”）；标准化处理后的数据再用Princomp函数进行主成分分析，求得各标准样品在 第一主成分和第二主成分的得分（见表1）；以第一主成分为x轴，第二主成分为y 轴绘制主成分投影图，将各标准样品的第一主成分、第二主成分的得分在主成分投 影图分别进行描点，8种酿造酱油标准样品在主成分投影图形成聚类空间A，其重 心坐标为Da（x_Da=-2.2032，y_Da=0.0031），空间半径R₁=2.7456。2种配制酱油样品、 2种HVP以及2种自行用酸水解蛋白液和酿造酱油配制的样品形成聚类空间B，其 重心坐标为Db（x_Db=2.9376，y_Db=0.0041），空间半径R₂=1.6072（如图1所示）。

表1标准样品主成分得分

2、将待鉴别的样品（待测样品）经上述步骤a、特征组分提取以及步骤b、挥发 性成分分析处理后处理后，获取的22种挥发性成分峰面积占比数据在进行标准化处 理后，用Princomp函数进行主成分分析，求得其在第一主成分和第二主成分上的得 分（即待测样品在主成分投影图x轴和y轴的坐标位置），并在步骤1构建的主成分 空间上进行投影，然后通过公式1计算出待测样品与聚类空间A重心之间的直线距 离Ga，通过公式2计算出待测样品与聚类空间B重心之间的直线距离Gb。如果 Ga<Gb，表明该样品为酿造酱油，反之，该样品为配制酱油，从而实现酿造酱油和配 制酱油的鉴别。

$\mathrm{Ga}=\sqrt{{(x-x_{\mathrm{Da}})}^2+{(y-y_{\mathrm{Da}})}^2}$………………………………………公式1

$\mathrm{Gb}=\sqrt{{(x-x_{\mathrm{Db}})}^2+{(y-y_{\mathrm{Db}})}^2}$………………………………………公式2

x——待测样在第一主成分的得分；y为待测样在第二主成分的得分；

x_Da——聚类空间A重心的横坐标值，y_Da为聚类空间A重心的纵坐标值；

x_Db——聚类空间B重心的横坐标值，y_Db为聚类空间B重心的纵坐标值。

实施例一

取酿造酱油、配制酱油和HVP各两个样品作为待测样品，按上述判别方法进行 处理，主成分投影图如图2所示，距离判别的鉴别结果见表2。从图2可以看出，两 个待测的酿造酱油样品与酿造酱油的标准样品聚为一类，其他两个待测配制酱油、两 个HVP样品与配制酱油标准样品聚为另一大类，与实际情况相符。从表2可以看出， 鉴别准确率为100%。

表2鉴别准确率考察

实施例二

将配制酱油的原料HVP添加进入酿造酱油，配制成20%、30%、40%和50%的 混合液，按上述判别方案进行处理，主成分投影图如图3所示，距离判别的鉴别结果 见表3。从图3可以看出，4个待测的HVP加标样品与配制酱油标准样品聚为同一大 类，与实际情况相符。从表3可以看出，鉴别准确率为100%。

表3鉴别准确率考察

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。