用于抑制转移性肿瘤生长的新型磺酰胺化合物

摘要

本发明公开了具有式R-Q-Ar-SO2NH2的治疗用磺酰胺化合物，其中R是芳基，杂芳基，烷基或环烷基，Q是基团-L(CH2)n-，其中n＝0，1或2，并且L是基团-NHCXNH-，-NHC(S)SNH-，-NHCONHCSNH-或-SO2NH-，X是O或S并且Ar是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C6-C10芳族或杂芳族基团，所述化合物选择性地抑制CAIX和CAXII，并且所述化合物有效抑制缺氧肿瘤生长、抑制转移并且损伤和减少哺乳动物的癌干细胞。

说明书

发明背景

发明领域

本发明属于新型磺酰胺化合物领域，所述新型磺酰胺化合物尤其用作 碳酸酐酶IX和XII的抑制剂，用于治疗缺氧的和转移的癌症，以及减少 哺乳动物中的癌干细胞。

相关技术的描述

已经分离和表征了哺乳动物中的十六种不同的α-碳酸酐酶(CA)同种 型，其中它们起着重要的生理学作用。它们中的一些是细胞溶质性的(CAI， CAII，CAIII，CAVII，CAXIII)，其他是膜结合的(CAIV，CAIX，CAXII， CAXIV和CAXV)，CAVA和CAVB是线粒体的，并且CAVI分泌在唾液 和奶中。哺乳动物的CA是首次被分离和详细研究的这样的酶(Supuran， CT.Nat.Rev.Drug Discov.2008，7，p168，Supuran，C.T.；Scozzafava， A.Bioorg.Med.Chem.(生物有机药物化学)2007，15，4336)并且它们中的 许多是确定的治疗靶标。典型的CA抑制剂主要是磺酰胺RSO₂NH₂，其作 为利尿药和抗青光眼药在临床上已使用超过50年。事实上有大约30种临 床使用的药物(或处于临床开发中的药剂)属于磺酰胺或氨基磺酸盐类，其 表现出CA抑制活性(Supuran，C.(2008)Nature(自然)，Vol7：168-181)， 并且其中的一些被确定为利尿药和抗青光眼药。

最近已显现出CA抑制剂具有尤其作为抗癌药的潜力。然而，设计CA 抑制剂作为治疗剂的关键障碍在于：人的大量同种型(即16种CA，其中 的13种具有催化活性)，其在许多组织/器官中相当广泛的定位；以及缺乏 目前可得的磺酰胺/氨基磺酸盐类抑制剂的同工酶选择性。事实上，在上述 衍生物中，还没有化合物具有治疗价值地选择性抑制CA同种型(1-25种磺 酰胺化合物针对所有人(h)CA同种型的抑制数据提供在Supuran，C.(2008) Nature(自然)7：168-181中。

同工酶CAIX和CAXII主要在肿瘤细胞中发现并且在正常组织中显示 受限的表达。当前CAI的局限性的有用概述提供在Poulsen，Expert Opin. Ther.Patents(专利)(2010)20(6)：795-806中。从此概述中很清楚的是，由于 可用化合物的局限性，还没有有效地证实CAIX对于癌症和转移的用途。

某些磺酰胺CAIX抑制剂可能确实显示抗肿瘤作用的证据最近才被公 布(Ahlskog，J.K.J.；Dumelin，C.E.；Trüssel，S.；Marlind，J.；Neri，D.Bioorg. Med.Chem.Lett.(生物有机药物化学通讯)2009，19，4851.)。已公开某些 化合物，例如在Maresca等人的PCT公开WO2009089383中。然而，选 择性是一个问题，因为持家碳酸酐酶的抑制是禁忌的。

发明内容

提供了脲基-磺酰胺组合物，所述组合物包含式(I)的化合物：

R-Q-Ar-SO₂NH₂

其中R是带有或不带有电荷的芳基、杂芳基、烷基或环烷基；

Q是基团-L(CH₂)_n-，其中n＝0，1或2，并且L是基团-NHCXNH-， -NHC(S)SNH-，-NHCONHCSNH-或-SO₂NH-，

其中X是O或S；并且Ar是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的 C₆-C₁₀芳族或杂芳族基团；

所述组合物用于治疗缺氧的和转移的癌症，用于损伤或破坏癌干细胞， 或者用于治疗特征在于增高的CAIX或CAXII的表达的任何癌症。

Q可以是-NHCONH-，Ar可以是苯基，并且R可以是以下中的一个： PhCH₂、Ph₂CH、4-FC₆H₄、4-ClC₆H₅、4-BrC₆H₄、C₆F₅、2-MeOC₆H₄、4-AcC₆H₄、 2-i-PrC₆H₄、4-i-PrC₆H₄、4-n-BuC₆H₄、4-n-BuOC₆H₄、4-正辛基-C₆H₄、 4-NCC₆H₄、2-NCC₆H₄、4-PhOC₆H₄、2-PhC₆H₄、3-O₂NC₆H₄、 4-MeO-2-MeC₆H₃、环戊基、茚满-5-基、3，5-Me₂C₆H₃、4-CF₃C₆H₄或 3，5-(CF₃)₂C₆H₃。

本发明的组合物的活性成分可以是以下中的任一种或多种：

4-{[(苄氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-102)；

4-{[(二苯甲氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-103)；

4-{[(4’-氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-104)；

4-{[(4′-溴苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-105)；

4-{[(五氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-107)；

4-{[(2’-甲氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-108)；

4-{[(4’-乙酰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-109)；

4-{[(2’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-110)；

4-{[(4’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-111)；

4-{[(4’-正丁基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-112)；

4-{[(4’-丁氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-113)；

4-{[(4’-正辛基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-114)；

4-{[(4’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-115)；

4-{[(2’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-116)；

4-{[(4’-苯氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-117)；

4-{[(联苯-2’-基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-118)；

4-{[(3’-硝基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-119)；

4-{[(4’-甲氧基-2’-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-120)；

4-[(环戊基氨基甲酰基)氨基]苯磺酰胺(MST-122)；

4-{([(3’，5’-二甲基苯基)氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-123)；

4-{[(4’-氯苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-124)；

4-{[(2’，3’-二氢-1H-茚-5’-基氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-125)；

4-{[([4’-(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-126)；

4-{[([3’，5’-双(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-127)；

3-(3-(4’-碘苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-128)；

3-(3-(4’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-129)；

3-(3-(3’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-130)；

3-(3-(4’-乙酰基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-131)；

3-(3-(2’-异丙基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-132)；

3-(3-(全氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-133)；

4-(3-(4’-氯-2-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-134)；

4-(3-(4’-溴-2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-135)；

4-(3-(2’-氟-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-136)；

4-(3-(2’，4’，5’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-137)；

4-(3-(2’-氟-5’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-138)；

4-(3-(2’-氟-3’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-139)；

4-(3-(2’，3’，4’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-140)；

4-(3-(2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-141)；

4-(3-(2’，4’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-142)；

4-(3-(3’-氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-143)；

4-(3-(2’，5’-二氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-144)；

4-(3-(2’-氯-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-145)；

4-(3-(2’-氯-4’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-146)；

4-(3-(2’，6’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-147)；或

4-(3-(全氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-148)。

提供了根据本发明的组合物，在体内或在体外，相比于它们抑制CAI 和CAII的活性，所述组合物以更大的程度抑制肿瘤相关CAIX的活性。

提供了抑制哺乳动物的肿瘤生长、侵入和/或肿瘤转移的方法，所述方 法通过用根据本发明的组合物来治疗所述哺乳动物。

提供了一种减少哺乳动物的乳腺癌细胞数量或质量(mass)的方法，所述 方法通过用根据本发明的组合物来治疗所述哺乳动物。

提供了一种使用本文提供的组合物减少哺乳动物癌干细胞群中的癌干 细胞的方法。

提供了一种使用由本发明提供的组合物来诱导缺氧癌细胞的细胞死亡 的方法。

根据权利要求10的方法，其中所述哺乳动物还用另外的抗癌剂治疗。

根据本发明如此治疗的哺乳动物可以用另外的化疗剂或其他抗癌剂治 疗。本文中治疗的任何癌症或肿瘤或细胞群可以超过和高于非癌起源组织的 正常水平地表达CAIX或CAXII。

根据本发明的实施方案，所治疗的肿瘤可以为乳腺癌、肺癌、胰腺癌、 肾癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌或成胶质细胞瘤。使用所述组合物治疗 具有癌症或肿瘤的哺乳动物可以减少或消除转移。

所述哺乳动物可以是人。

还提供了一种化合物，所述化合物包含式(I)R-Q-Ar-SO₂NH₂，其中R 可以是带有或不带有电荷的芳基、杂芳基、烷基或环烷基；Q可以是 -L(CH₂)_n-，其中n＝0、1或2，并且L可以是基团-NHCXNH-， -NHC(S)SNH-，-NHCONHCSNH-或-SO₂NH-，其中X是O或S；并且Ar 可以是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C₆-C₁₀芳族或杂芳族基团， 或者其中Q可以是-NHCONH-，Ar是苯基，并且R可以是PhCH₂、Ph₂CH、 4-FC₆H₄、4-ClC₆H₅、4-BrC₆H₄、C₆F₅、2-MeOC₆H₄、4-AcC₆H₄、2-i-PrC₆H₄、 4-i-PrC₆H₄、4-n-BuC₆H₄、4-n-BuOC₆H₄、4-正辛基-C₆H₄、4-NCC₆H₄、 2-NCC₆H₄、4-PhOC₆H₄、2-PhC₆H₄、3-O₂NC₆H₄、4-MeO-2-MeC₆H₃、环戊 基、茚满-5-基、3，5-Me₂C₆H₃、4-CF₃C₆H₄或3，5-(CF₃)₂C₆H₃。

为了进一步清楚，优选的本发明化合物在以下例示。

根据本发明的组合物的特征在于：在体外，相比于它们抑制CAI和 CAII的活性，它们以更大的程度抑制肿瘤相关的CAIX和CAXII的活性。

还提供了组合物及其抑制缺氧中的人乳腺癌细胞的侵入和/或诱导缺氧 中的人乳腺癌细胞的细胞死亡的用途。

还提供了组合物及其通过抑制CAIX活性而损伤乳腺癌干细胞的维持 的用途。

还提供了组合物及其通过抑制CAIX活性而减少人乳腺癌中的癌干细 胞群的用途。

还提供了一种用MST-017、MST-114、MST-119、MST-104或MST-130 来治疗转移的或缺氧的癌症的方法。

还提供了包含式(I)的化合物的药物组合物，特别是药物组合物。

在结合附图、表、公式和实施例阅读了以下对本发明具体实施方案的描 述后，本发明的其他方面和特征对于本领域的普通技术人员将变得明显。

附图简述

图1显示与无复发生存(relapse free survival)(A)、远处无复发生存 (distant relapse free survival)(B)和乳腺癌特异生存(breast cancer specific  survival)(C)相关的CAIX表达的Kaplan-Meier分析，获得极高水平的统计 学显著性(分别为p＜10-17，p＜10-16和p＜10-13)。相比于CAIX阴性组， CAIX阳性组中的10年远处无复发生存和乳腺癌特异生存率分别为57％ (相比于73％)，以及62％(相比于78％)。在包括所有标准预后变量和生 物学亚型的多变量分析中，CAIX表达保持强独立不良预后因素，其中危 害比为1.4。

图2显示(A)三种细胞系67NR、66cl4和4T1的细胞培养物以及显示 体内肿瘤细胞的生物发光标记的小鼠模型和(B)三种肿瘤类型的缺氧诱导 的基因表达表(高表达，暗；低表达，亮)。

图3示出了显示原发性肿瘤中的CAIX过表达的蛋白质印迹。NMG＝ 正常乳腺。β-肌动蛋白用作加样对照。

图4显示(A)通过qRT-PCR(图)和溶解产物的蛋白质印迹(凝胶)测量的 与被温育72h的转移性细胞(4T1，66cl4)和非转移性细胞(67NR)中的CAIX 表达相关的数据图。数据被表示为平均值±s.em.n＝3，^**P＜0.005， ^***P＜10^-3。β-肌动蛋白作为加样对照显示。(B)将表达非沉默shRNA(shNS) 或靶向CA IX的shRNA(shCAIX)的4T1细胞温育72h。分析表达shCAIX 的两个独立克隆(C2，C5)。下图，通过蛋白质印迹评估溶解产物的CAIX 表达。β-肌动蛋白用作加样对照。

图5包括(A)表达shCAIX并且在缺氧下培养48h的TOP 4T1细胞的 TUNEL-阳性细胞(箭头)的代表图像，并且将细胞死亡的量与表达shNS的 4T1细胞进行比较。上图，TUNEL-阳性细胞(箭头)的代表图像。比例尺＝100 um。(A)下图，显示通过在20x放大倍率计数5个随机视野/细胞系定量 TUNEL-阳性细胞的图。数据表示为相比于常氧培养的对照细胞的TUNEL- 阳性细胞的倍数变化。n＝5。(B)表达shNS或shCAIX的4T1细胞在指定 条件培养72小时并且在总细胞溶解产物上测定细胞内的ATP水平。 *P＜0.01，相比于常氧中的ATP水平。

图6显示(A)使用4T1肿瘤模型的自发性转移的代表性生物发光图像。 热点图(heat map)(亮，最不强的；较暗，最强的；)显示覆盖在灰度体图像 上。(B)相同视图，但利用表达shNS或shCAIX的4T1细胞和接种到10 BALB/c小鼠的乳腺中的亲本4T1细胞。*表示完成从对照组的原发性肿瘤 切除。

图7显示减少了CAIX表达的人乳腺癌细胞的减少的原发性肿瘤生长。 将表达shNS或shCAIX的MDA-MB-231细胞和亲本MDA-MB-231细胞 皮下地接种到NOD.CB17-prkdc^scid/J小鼠的侧腹中并且监测动物的肿瘤生 长。每组n＝7。插图：表达靶向人CAIX的shRNAmir(shCAIX)或非沉默 对照序列(shNS)的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧培养72h并且对缺氧 诱导的CAIX表达进行分析，显示蛋白质印迹。β-肌动蛋白用作加样对照。

图8显示CAIX的减少抑制实验转移模型中的肺转移瘤的形成。图(A) 显示表达CAIX的4T1细胞的实验转移的代表性发光图像。图(B)显示在来 自4T1 shNS组的小鼠肺的大体图像中存在转移性结节。图(C)显示不同肿 瘤组中的可见结节数量的定量。图(D)显示在来自4T1细胞的肺转移瘤中的 CAIX的免疫组织化学染色。

图9显示(A)MST-017或之前鉴别的“CAI-17”(Supuran，C.2008，Nature. Vol7：168-181)的化学结构，(B)细胞在10uM MST-017存在下培养72h。 显示了在指定条件下结合至细胞系的FITC标记的抑制剂的代表性图像。 (C)是在有或没有MST-017(对于4T1，66cl4和67NR细胞分别为400，600 和400uM)的情况下下培养72h的细胞的胞外pH的变化的图。n＝3。示 出了胞外pH的平均变化±s.e.m。

图10示出了显示MST-017减弱4T1原发性肿瘤的生长的体内效力的 数据。(A)CAIX表达的4T1细胞水平通过蛋白质印迹进行分析。(B)左图， 肿瘤生长通过基于卡尺的测量进行监测。治疗开始和终止通过箭头指示。 经载体(vehicle)治疗和未经治疗的动物用作对照。(C)所治疗动物的重量被 监测作为总体抑制剂毒性的一个量度。在每剂CAIX抑制剂之前对小鼠进 行称重。

图11显示如作图的和通过CAIX的蛋白质印迹的所治疗动物的67NR 肿瘤生长的差异。对于(A)，67NR细胞在常氧或缺氧下培养并且CAIX表 达水平通过蛋白质印迹分析。对于(B)，动物接种67NR细胞并如图10那 样进行治疗。框(C)图显示数据，所述数据显示在不同治疗和对照之间没有 观察到显著的重量差异。

图12显示(A)CAIX抑制剂MST-119的化学结构，和(B)在静脉内注射 4T1细胞和用MST-119处理后形成的转移瘤的代表性生物发光图像。框(C) 显示来源于肿瘤的生物发光的定量的结果。

图13显示(A)在静脉内注射4T1细胞和用MST-104处理后形成的转移 瘤的代表性生物发光图像。框(B)显示来源于肿瘤的生物发光的定量的结 果。

图14显示被正位植入乳腺中并用CAIX抑制剂MST-104处理的人乳 腺肿瘤的生长的剂量依赖性抑制。随时间监测肿瘤生长。插图显示当在缺 氧下生长时这些细胞上调CAIX的表达。

图15显示：与亲本MDA-MB-231人乳腺癌细胞相反，当在缺氧下在 3D Matrigel^TM培养物中培养时，高度肺转移性MDA-231 LM2-4细胞是侵 入性的。

图16显示CAIX的脲基-磺酰胺抑制剂(MST-104，MST-119，MST-107， MST-130)在缺氧下在3D Matrigel^TM培养物中抑制高度转移性人乳腺癌细 胞的侵入。

图17显示在缺氧下在3D Matrigel^TM培养物中脲基-磺酰胺对细胞死亡 的不同作用。(A)TUNEL-阳性细胞的数量的代表性图像。框(B)示出了 TUNEL-阳性细胞的定量的结果。

图18显示4T1乳腺癌细胞中的CAIX表达的遗传减少(A)增加在缺氧 下开始肿瘤球(tumorsphere)生长所需的细胞数量和(B)减少缺氧诱导的 CD44⁺/CD24^-/low癌干细胞的增加。

图19显示用脲基-磺酰胺MST-104对人乳腺癌正位肿瘤的治疗减少该 肿瘤内的癌干细胞群。框(A)显示对ESA+癌干细胞进行分类的代表性 FACS图。框(B)示出了对肿瘤中存在的ESA+人乳腺癌干细胞的数量的定 量的结果。

发明详述

适用于治疗转移癌的脲基-磺酰胺组合物如本文所述进行了合成和应 用。它们包含式(I)：

R-Q-Ar-SO₂NH₂

其中R可以是带有或不带有电荷的芳基、杂芳基、烷基或环烷基；

Q可以是基团-L(CH₂)_n-，其中n＝0、1或2，并且L可以是基团 -NHCXNH-，-NHC(S)SNH-，-NHCONHCSNH-或-SO₂NH-，其中X可以 是O或S；并且Ar可以是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C₆-C₁₀芳族或杂芳族基团。

式(I)，其中Q可以是基团-NHCONH-，Ar可以是苯基并且R可以是 PhCH₂，Ph₂CH，4-FC₆H₄，4-ClC₆H₅，4-BrC₆H₄，C₆F₅，2-MeOC₆H₄，4-AcC₆H₄， 2-i-PrC₆H₄，4-i-PrC₆H₄，4-n-BuC₆H₄，4-n-BuOC₆H₄，4-正辛基-C₆H₄， 4-NCC₆H₄，2-NCC₆H₄，4-PhOC₆H₄，2-PhC₆H₄，3-O₂NC₆H₄， 4-MeO-2-MeC₆H₃，环戊基，茚满-5-基，3，5-Me₂C₆H₃，4-CF₃C₆H₄， 3，5-(CF₃)₂C₆H₃，可用于本发明的方法。

本发明的代表化合物为：

4-{[(苄氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-102)；

4-{[(二苯甲氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-103)；

4-{[(4’-氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-104)；

4-{[(4′-溴苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-105)；

4-{[(五氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-107)；

4-{[(2’-甲氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-108)；

4-{[(4’-乙酰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-109)；

4-{[(2’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-110)；

4-{[(4’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-111)；

4-{[(4’-正丁基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-112)；

4-{[(4’-丁氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-113)；

4-{[(4’-正辛基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-114)；

4-{[(4’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-115)；

4-{[(2’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-116)；

4-{[(4’-苯氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-117)；

4-{[(联苯-2’-基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-118)；

4-{[(3’-硝基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-119)；

4-{[(4’-甲氧基-2’-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-120)；

4-[(环戊基氨基甲酰基)氨基]苯磺酰胺(MST-122)；

4-{([(3’，5’-二甲基苯基)氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-123)；

4-{[(4’-氯苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-124)；

4-{[(2’，3’-二氢-1H-茚-5’-基氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-125)；

4-{[([4’-(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-126)；

4-{[([3’，5’-双(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-127)；

3-(3-(4’-碘苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-128)；

3-(3-(4’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-129)；

3-(3-(3’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-130)；

3-(3-(4’-乙酰基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-131)；

3-(3-(2’-异丙基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-132)；

3-(3-(全氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-133)；

4-(3-(4’-氯-2-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-134)；

4-(3-(4’-溴-2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-135)；

4-(3-(2’-氟-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-136)；

4-(3-(2’，4’，5’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-137)；

4-(3-(2’-氟-5’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-138)；

4-(3-(2’-氟-3’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-139)；

4-(3-(2’，3’，4’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-140)；

4-(3-(2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-141)；

4-(3-(2’，4’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-142)；

4-(3-(3’-氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-143)；

4-(3-(2’，5’-二氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-144)；

4-(3-(2’-氯-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-145)；

4-(3-(2’-氯-4’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-146)；

4-(3-(2’，6’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-147)；或

4-(3-(全氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-148)。

为了清楚，所述C₆-C₁₀芳族基团是指苯基，或者1-萘基或2-萘基，并 且杂芳族基团是指含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C₂-C₁₂杂环芳 族化合物。此外，1，3，4-噻二唑是优选的杂环基。

还提供了式(I)的化合物，其中，如在体外测量的，相比于它抑制CAI 和CAII的活性，所述化合物以更大的程度抑制肿瘤相关的CAIX和CAXII 的活性。

本发明的另一个目的是一种用于制备式(I)的化合物的方法。一个优选 的反应在式R-NCX的化合物和式NH₂-Ar-SO₂NH₂或 NH₂CSNH-Ar-SO₂NH₂的化合物之间进行，其中R和X如上所定义，其中 Ar如上所定义。

另一个优选的反应是式NH₂-Y-SO₂NH₂的化合物与N，N-二甲基-/二乙 基二硫代氨基甲酸钠/钾的氧化硫代氨基甲酰化，其中Y是基团-(CH₂)_nAr-， n＝0，1，2并且Ar是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C₆-C₁₀芳族 或杂芳族基团。

反应条件是本领域技术人员已知的那些条件，参见例如A.Scozzafava 和C.T.Supuran Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机药物化学通讯) 2000，10，1117-1120；C.T.Supuran；F.Briganti；S.Tilli；W.R. Chegwidden；A.Scozzafava Bioorg.Med.Chem.(生物有机药物化学) 2001，9，703-714；C.T.Supuran；A.Scozzafava；B.C.Jurca；M.A.Ilies  Eur.J.Med.Chem.(药物化学杂志)1998，33，83-93。

以下方案显示可以用来制备根据本发明的化合物的方法的实例。

根据本发明的化合物是选择性的CAIX和CAXII抑制剂。因此，还提 供了式(I)的化合物，其中，如在体外测量的，相比于它抑制CAI和CAII 的活性，所述化合物以更大的程度抑制肿瘤相关的CAIX和CAXII的活性。 这些化合物可用于方法中以减少人乳腺癌的生长，抑制在实体瘤中典型的 缺氧条件下乳腺癌细胞的侵入，杀死缺氧下的人乳腺癌细胞，以及减少癌 干细胞群。

癌干细胞(CSC)被定义为具有以下性能的癌细胞的亚群：自我更新潜 力、产生非CSC后代的能力以及相对于肿瘤内的其他癌细胞的极大增强 的肿瘤引发潜力(Chaffer and Weinberg，(2011)Science331：1559-1564； Clevers，(2011)Nat.Med.17：313-319；Hanahan and Weinberg，(2011)Cell. 144：646-674)。CSC在实验上被定义为当植入适当动物宿主时具有播种新 肿瘤的能力的细胞(Chaffer and Weinberg，2011；Hanahan and Weinberg， 2011)。它们被认为是癌治疗抗性的组分。

表1：用脲基磺酰胺MST-101至MST-127对hCAI、hCAII(细胞溶质同种 型)以及hCAIX和hCAXII(跨膜，肿瘤相关酶)的抑制。

本发明的化合物可用于制备药物以及用于治疗具有CAIX或CAXII高 度过表达的缺氧肿瘤的方法。“过表达”是指基因的过度表达，通常通过产 生其过多的作用或产物。所述药物对于CAIX具有抑制作用，并且对于反 转缺氧肿瘤及其周围环境的酸化尤其有效。

本发明的化合物还能够损害和/或根除癌干细胞。癌干细胞被认为是肿 瘤对传统治疗剂或技术如化疗或放射的抗性的基础。

在大多数癌症疗法中，具有互补作用形式的多药剂典型地用作化疗“混 合剂(cocktail)”的一部分。预期本发明的组合物可以用于这样的混合剂，根 据所治疗癌症的性质所述混合剂可以含有一种或多种另外的抗肿瘤药。因 此，可以联合本发明的组合物使用其他化疗剂，如抗代谢药(即、5-氟尿嘧 啶、floxuradine、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、 6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨 (capacitabine)、喷司他丁(pentostatin)、曲美沙特(trimetrexate)或克拉屈滨 (cladribine))；DNA交联和烷基化剂(即、顺铂、卡铂、streptazoin、美法仑 (melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、卡莫司汀(carmustine)、 methclorethamine、洛莫司汀(lomustine)、bisulfan、噻替派(thiotepa)、ifofamide 或环磷酰胺)；激素药(即、他莫昔芬(tamoxifen)、roloxifen、托瑞米芬 (toremifene)、阿那曲唑(anastrozole)或来曲唑(letrozole))；抗生素类(即、普 利霉素(plicamycin)、博来霉素(bleomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达 比星(idarubicin)、更生霉素(dactinomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、多柔比 星(doxorubicin)或柔红霉素(daunorubicin))；免疫调节剂(即、干扰素、IL-2 或BCG)；抗有丝分裂药(即、雌氮芥(estramustine)、紫杉醇(paclitaxel)、多 西紫杉醇(docetaxel)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春瑞 宾(vinorelbine))；拓扑异构酶抑制剂(即、托泊替坎(topotecan)、伊立替康 (irinotecan)、依托泊甙(etoposide)或替尼泊甙(teniposide))；以及其他药剂 (即、羟基脲、曲妥珠单抗(trastuzumab)、六甲蜜胺(altretamine)、利妥昔单 抗(retuximab)、L-天冬酰胺酶或吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab  ozogamicin))。

所述分子可以与已知的药物赋形剂如盐、水、脂质和/或简单糖类配合 以得到适于注射、局部施用或摄入的制剂。

药物制剂涉及开发稳定且对于人使用是可接受的化合物的制剂。已经 测试了所述化合物的制剂以确保药物与任何增溶剂、稳定剂、冻干剂或水 合剂(hydrating agent)相容。

任何制剂的设计涉及药物的物理、化学和力学性质的表征以便选择在 制剂中应当使用什么其他成分。

粒度、多态性、pH和溶解度，所有这些可以影响药物的生物利用度并 因此影响药物的活性。必须通过确保存在的药物的量在每个剂量单位例如 每个片剂中一致的方法将药物与无活性添加剂结合。

不可能在临床试验开始时就完成制剂研究。这意味着最初开发简单制 剂以用于I期临床试验。不要求证实这些制剂的长期稳定性，因为它们将 在大概几天中使用(测试)。

当到III期临床试验时，药物的制剂应当被开发为接近于最终将在市场 上使用的制剂。进行稳定性研究以测试温度、湿度、氧化或光解(紫外光或 可见光)是否具有任何影响，并且分析该制剂以判断是否形成任何降解产 物。

在一个实施方案中，本发明的化合物被配制在聚乙二醇以及乙醇和盐 水中。在一个具体实施方案中，所述制剂包含37.5％PEG400、12.5％乙醇 和50％盐水。

如在本文中使用的，肿瘤可以用来指任何原发性或转移性癌症、缺氧 的肿瘤组织或恶性生长。对缺氧敏感的任何肿瘤和/或转移瘤，特别是乳腺 癌、肺癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌 和卵巢癌可以根据本发明的实施方案进行治疗。可获得用来确定利用本发 明的组合物治疗的另外的合适癌症类型的方法，即用于检测缺氧组织的方 法对于本领域技术人员是可获得的且是已知的。参见，例如美国专利No. 5,401,490和5,843,404，其公开了检测缺氧或缺氧组织的方法。本领域技 术人员已知这些技术等中的任一种可以用来鉴别缺氧组织。

相对于正常组织，易受治疗的肿瘤具有升高的CAIX或CAXII水平。 同工酶CAIX和CAXII主要在肿瘤细胞中发现并且在正常组织中显示受限 的表达。最近已证实，通过有效地水合二氧化碳以提供质子和碳酸氢根， 这些CA显著有助于实体瘤的胞外酸化，而抑制它们在某种程度上反转这 种现象。响应于缺氧诱导因子(HIF)途径，CAIX和CAXII在许多这样的肿 瘤中过表达。

如数据中证实的，CAIX和CAXII与缺氧和转移瘤相关。因此将不需 要测试缺氧和转移性肿瘤以证明升高的CAIX和CAXII水平指示使用本发 明的化合物的治疗，因为所述数据已经支持该推测。然而，Gudas等的美 国专利No.US7378091公开了可用于检测和诊断的CAIX抗体。针对CAXII 的抗体，以及RNA探针可以用来评估活检肿瘤样品中的CAXII的过表达。

CA XII还在Battke等，(2011)Cancer Immunol Immunother.May； 60(5)：649-58中进行了评估。

肿瘤生长、持久性和/或传播可以说成受本发明的化合物抑制，或者受 它们在治疗受此折磨的哺乳动物中的使用的抑制。本申请中的“抑制”可 以指消退的诱导、生长的抑制以及传播的抑制，特别是当这些术语涉及哺 乳动物，尤其是人经受的肿瘤和癌症时。

可以联合本发明的化合物使用典型的化疗剂，其包括但不限于多西紫 杉醇、长春花生物碱类(vinca alkaloids)、mitoxanthrone、顺铂、紫杉醇、 5-FU、赫赛汀(Herceptin)、阿瓦斯丁(Avastin)、格列卫(Gleevec)。类似地， 放射疗法可以结合包括本发明的化合物的给药时间表。

当进行手术干预时，本发明的化合物和组合物可以在手术前、手术期 间或手术后使用。剂量典型地由用药方案确定，所述用药方案利用患者尺 寸和重量来计算与血量相关的患者的体表面积，从而确定初始用药。开始 剂量通常在治疗用化合物的临床测试期间被算出。

用于肿瘤治疗的临床方法的背景和当前方法可见于Takimoto CH， Calvo E.″Principles of Oncologic Pharmacotherapy(肿瘤药物治疗原理)″in  Pazdur R，Wagman LD，Camphausen KA，Hoskins WJ(Eds)Cancer  Management：A Multidisciplinary Approach(癌症管理：多学科方法).第11 版.2008，该文献可在http://www.cancernetwork.com/cancer-management-11/ chapter03/article/10165/1402628免费获得。

以下实施例用来举例说明本发明的方面，但实施方案不意图受这些举 例说明限制。

实施例1

本发明的具体实施方案的制剂(化合物MST-101至MST-127包括在内)

制备式(I)的化合物的通用程序

化学方法：利用Bruker Advance III400MHz光谱仪记录¹H、¹³C和¹⁹F 光谱。化学位移以百万分率(ppm)报告并且耦合常数(J)以赫兹(Hz)表示。红 外光谱作为KBr板上的实线(solid)记录在Perkin Elmer Spectrum R XI光谱 仪上。除非另有指明，使用Buchi Melting Point B-540熔点设备，在开口毛 细管中测量熔点(m.p.)，并且不进行校正。在Merck硅胶60F₂₅₄铝背衬板上 进行薄层色谱(TLC)。使用乙酸乙酯-石油醚作为洗脱系统进行板的洗脱。 通过浸入茚三酮TLC染色溶液并用热气枪加热，利用254nm的UV光实现 可视化。使用硅胶(获自意大利米兰的Aldrich Chemical Co.)作为吸附剂进 行急骤柱色谱。粗产物作为在相同洗脱溶剂系统中的溶液引入到柱中。使 用的溶剂和化学品由意大利米兰的Aldrich Chemical Co.供应。

将4-氨基苯磺酰胺(2.9mmol)溶解在乙腈(20-30mL)中，然后用化学计 量的胩处理。混合物在室温搅拌或在50℃加热2小时，直至完成(TLC监测)。 滤掉形成的重沉淀，用二乙醚洗涤并在真空下干燥。

4-[(苯胺基羰基)氨基]苯磺酰胺(MST-101)：

将4-氨基苯磺酰胺(4-Aminobenzenesulfanilamide)(0.50g；2.90mmol) 用异氰酸苯酯(0.23g；2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先 前报道的通用程序中所描述的进行处理，得到MST-101，为白色固体，收 率为43.7％。m.p.233-235℃(Lit¹)；硅胶TLCR_f0.63(乙酸乙酯/石油醚 33％)；v_max(KBr)cm^-1，3340(N-H脲)，1656(C＝O脲)，1595(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.00(1H，tt，J7.4，0.8，4’-H)，7.20(2H，s，SO₂NH₂)， 7.29(2H，dd，J8.2，0.8，2x3’-H)，7.47(2H，dd，J8.2，1.2，2x2’-H)， 7.61(2H，d，J9.0，2x3-H)，7.73(2H，d，J9.0，2x2-H)，8.82(1H，s， NH)，9.09(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O脲)，143.8， 140.2，137.8，129.8，127.7，123.1，119.4，118.4。

4-{[(苄氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-102)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸苄酯(0.39g；2.90mmol) 处理并且将反应在室温搅拌4h，如先前报道的通用程序中所描述的进行 处理，得到MST-102，为白色固体，收率为42.3％。m.p.194-196℃；硅 胶TLCR_f0.58(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3313(N-H脲)， 1674(C＝O脲)，1591(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)4.35(2H，d，J6.0， 1’-H₂)，6.81(1H，t，J6.0，NH)，7.19(2H，s，SO₂NH₂)，7.28(1H，tt，J 6.82.0，5’-H)，7.35(4H，m，2x3’-H，2x4’-H)，7.59(2H，d，J9.0，2 x3-H)，7.71(2H，d，J9.0，2x2-H)，9.0(1H，s，NH)；δ_C(100MHz， DMSO-d₆)155.8(C＝O脲)，144.5，141.0，137.1，129.3，128.1，127.8， 127.7，117.8，43.7(C-1’)。

4-{[(二苯甲氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-103)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸二苯甲酯(0.61g；2.90 mmol)处理并且将反应搅拌2h，如先前报道的通用程序中所描述的进行处 理，得到MST-103，为白色固体，收率为42.4％。m.p.235-236℃；硅胶 TLCR_f0.76(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3338(N-H脲)，1696 (C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)6.0(1H，d，J7.6， NH)，7.19(2H，s，SO₂NH₂)，7.29(2H，tt，J7.21.6，2x4’-H)，7.38(9H， m，1’-H，4x3’-H，4x4’-H)7.56(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.70(2H，d， J8.8，2x2-H)，8.9(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)154.9(C＝O 脲)，144.2，143.8，137.2，129.5，127.9，127.8，127.7，117.7，57.8(C-1’)。

4-{[(4’-氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-104)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-氟苯酯(0.40g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌2天，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-104，为白色固体，收率为55.5％。m.p.242-243℃； 硅胶TLCR_f0.53(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3338(N-H脲)， 1697(C＝O脲)，1593(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.17(2H，t，J9.0， 2x2’-H)，7.24(2H，s，SO₂NH₂)，7.51(2H，dd，J9.04.8，2x3’-H)，7.64 (2H，d，J8.8，2x3-H)，7.76(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.86(1H，s，NH)， 9.09(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)158.5(d，J_C-F237，C-4’)，153.3 (C＝O脲)，143.7，137.8，136.6(d，⁴J_C-F3，C-1’)，127.7，121.2(d，³J_C-F7， C-2’)，118.4，116.3(d，²J_C-F22，C-3’)；δ_F(376.5MHz，DMSO-d₆)-121.0 (1F，s)。

4-({[(4’-溴苯基)氨基]羰基}氨基)苯磺酰胺(MST-105)：

将4-氨基-苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-溴苯酯(0.57g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-105，为白色固体，收率为43.1％。m.p.269-271℃； 硅胶TLCR_f0.38(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3328(N-H脲)， 1652(C＝O脲)，1590(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.24(2H，s， SO₂NH₂)，7.49(2H，d，J9.2，2x2’-H)，7.51(2H，d，J9.2，2x3’-H)， 7.64(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.76(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.99(1H，s， NH)，9.15(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.6(C＝O脲)，143.1， 139.3，137.5，132.0，127.3，120.9，118.1，114.1。

4-{[(4’-碘苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-106)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-碘苯酯(0.71g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-106，为白色固体，收率为46.5％。m.p.275-277°； 硅胶TLCR_f0.55(乙酸乙酯/石油醚33％)v_max(KBr)cm^-1，3325(N-H脲)， 1652(C＝O脲)，1586(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.24(2H，s， SO₂NH₂)，7.36(2H，d，J8.8，2x2’-H)，7.63(2H，d，J6.8，2x3-H)， 7.66(2H，d，J6.8，2x2-H)，7.77(2H，d，J8.8，2x3’-H)，8.97(1H，s， NH)，9.15(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)，153.2(C＝O脲)，143.7， 140.3，138.5，138.1，127.9，121.7，118.6，86.2(C-4’)。

4-{[(五氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-107)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸五氟苯酯(0.60g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-107，为白色固体，收率为97.7％。m.p.251-253℃； 硅胶TLCR_f0.49(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3329(N-H脲)， 1656(C＝O脲)，1597(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.23(2H，s， SO₂NH₂)，7.61(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.74(2H，d，J8.8，2x2-H)， 8.65(1H，s，NH)，9.48(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.9(C＝O 脲)，144.0(m，J_C-F239，C-2’)，143.3，139.6(m，J_C-F248，C-4’)，138.5， 138.2(m，J_C-F249，C-3’)，127.8，118.8，114.7(ddd，²J_C-F23，³J_C-F14， ⁴J_C-F4，C-1’)；δ_F(376.5MHz，DMSO-d₆)-146.2(2F，dd，³J24，⁴J5.1， 2x2’-F)，-159.2(2F，t，³J23，2x4’-F)，-164.0(1F，dd，³J23.3，⁴J5.0， 2x3’-F)。

4-{[(2’-甲氧基苯基)氨基]羰基)}氨基苯磺酰胺(MST-108)：

将4-氨基-苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸2-甲氧基苯酯(0.43g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-108，为白色固体，收率为40.4％。m.p. 234-236℃；硅胶TLCR_f0.47(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1， 3362(N-H脲)，2838(C-H脂肪族的)，1684(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400 MHz，DMSO-d₆)3.92(3H，s，CH₃)，6.94(1H，ddd，J8.27.41.4，4’-H)， 7.01(1H，ddd，J8.07.41.6，5’-H)，7.07(1H，dd，J8.21.2，3’-H)，7.23 (2H，s，SO₂NH₂)，7.64(2H，d，J8.8，2x2-H)，7.77(2H，d，J8.8，2x 3-H)，8.16(1H，dd，J8.01.6，6’-H)，8.38(1H，s，NH)，9.73(1H，s， NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.0(C＝O，脲)，148.7，143.8，137.7，129.2， 127.8，123.2，121.5，119.4，118.1，111.7，56.7(CH₃)。

4-{([(4’-乙酰基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-109)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-乙酰基苯酯(0.46g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-109，为白色固体，收率为46.6％。m.p.258-260 ℃；硅胶TLCR_f0.27(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3300(N-H 脲)，1659(C＝O脲)，1590(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)2.56(3H， s，CH₃)，7.26(2H，s，SO₂NH₂)，7.64(2H，d，J8.8，2x2’-H)，7.67(2H， d，J8.8，2x3-H)，7.79(2H，d，J8.8，2x2-H)，7.96(2H，d，J8.8，2x 3’-H)，9.22(1H，s，NH)，9.25(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)197.3 (C＝O)，152.9(C＝O脲)，144.9，143.4，138.2，131.7，130.6，127.8，118.7， 118.4，27.3(CH₃)。

4-{([(2’-异丙基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-110)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸2-异丙基苯酯(0.47g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌6h，如先前报道的通用程序中所描 述的进行处理，得到MST-110，为白色固体，收率为48.7％。m.p.226-227 ℃；硅胶TLCR_f0.65(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3361(N-H 脲)，2966(C-H脂肪族的)，1676(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)1.24(6H，d，J6.8，2x CH₃)，3.19(1H，sept，J6.8，CH)，7.14 (1H，ddd，J7.97.61.6，4’-H)，7.19(ddd，J7.96.81.2，5’-H)，7.23(2H， s，SO₂NH₂)，7.34(1H，dd，J7.61.6，3’-H)，7.65(2H，d，J8.8，2x3-H)， 7.68(1H，dd，J6.81.2，6’-H)，7.76(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.11(1H， s，NH)，9.37(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.8(C＝O脲)，144.0， 140.8，137.6，136.0，127.8，126.7，126.3，125.3，124.8，118.2，27.8(CH)， 24.1(2x CH₃)。

4-{([(4’-异丙基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-111)：

将4-氨基-苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-异丙基苯酯(0.47g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌3h，如先前报道的通用程序中所描 述的进行处理，得到MST-111，为白色固体，收率为58.5％。m.p.226-227 ℃；硅胶TLCR_f0.50(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3351(N-H 脲)，2964(C-H脂肪族的)，1647(C＝O脲)，1590(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)1.22(6H，d，J6.8，2xCH₃)，2.87(1H，sept，J6.8，CH)，7.20 (2H，d，J8.4，2x3’-H)，7.23(2H，s，SO₂NH₂)，7.40(2H，d，J8.4，2 x2’-H)，7.64(2H，d，J9.0，2x3-H)，7.76(2H，d，J9.0，2x2-H)，8.72 (1H，s，NH)，9.04(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O 脲)，143.9，143.2，137.9，137.6，127.7，127.5，119.5，118.3，33.7(CH)， 24.9(CH₃)。

4-({[(4’-丁基苯基)氨基]羰基}氨基)苯磺酰胺(MST-112)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-丁基苯酯(0.51g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌3h，如先前报道的通用程序中所描述的 进行处理，得到MST-112，为白色固体，收率为48.6％。m.p.243-245℃； 硅胶TLCR_f0.54(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3333(N-H脲)， 2929(C-H脂肪族的)，1653(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)0.93(3H，t，J7.2，CH₃)，1.33(2H，six，J7.4，CH₂)，1.57(2H， sept，J7.4，CH₂)，2.56(2H，t，J7.6，CH₂)，7.14(2H，d，J8.6，2x3’-H)， 7.23(2H，s，SO₂NH₂)，7.39(2H，d，J8.6，2x2’-H)，7.63(2H，d，J9.0， 2x3-H)，7.76(2H，d，J9.0，2x2-H)，8.71(1H，s，NH)，9.04(1H，s， NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O脲)，143.9，137.8，137.6，137.1， 129.5，127.3，119.5，118.3，35.1(CH₂)，34.2(CH₂)，22.6(CH₂)，14.7(CH₃)。

4-{[(4’-丁氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-113)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-丁氧基苯酯(0.55g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-113，为白色固体，收率为46.0％。m.p.236-239 ℃；硅胶TLCR_f0.60(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3361(N-H 脲)，2957(C-H脂肪族的)，1646(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz DMSO-d₆)0.97(3H，t，J7.6，CH₃)，1.48(2H，six，J7.2，CH₂)，1.71(2H， six，J6.8，CH₂)，3.96(2H，t，J6.4，CH₂)，6.90(2H，d，J9.2，2x3’-H)， 7.22(2H，s，SO₂NH₂)，7.38(2H，d，J9.2，2x2’-H)，7.63(2H，d，J8.8， 2x3-H)，7.75(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.62(1H，s，NH)，9.02(1H，s， NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)155.1(C＝O脲)，153.3，144.0，137.5，133.1， 127.7，121.2，118.2，115.5，68.2(OCH₂)，31.7(CH₂)，19.7(CH₂)，14.6(CH₃)。

4-{([(4-辛基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-114)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-辛基苯酯(0.67g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-114，为白色固体，收率为41.4％。m.p.282-283℃； 硅胶TLC Rf0.59(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3332(N-H脲)， 2924(C-H脂肪族的)，1653(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)0.89(3H，t，J6.8，CH₃)，1.30(12H，m，CH₂)，1.57(2H，t， J7.6，CH₂)，7.14(2H，d，J8.6，2x3’-H)，7.23(2H，s，SO₂NH₂)，7.39 (2H，d，J8.6，2x2’-H)，7.63(2H，d，J9.0，2x3-H)，7.76(2H，d，J9.0， 2x2-H)，8.72(1H，s，NH)，9.05(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)， 153.2(C＝O脲)，143.9，137.8，137.6，137.1，129.5，127.7，119.5，118.2， 35.4(CH₂)，32.2(CH₂)，32.0(CH₂)，29.7(CH₂)，29.6(CH₂)，29.5(CH₂)， 23.0(CH₂)，14.9(CH₃)。

4-{{(4’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-115)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-氰基苯酯(0.42g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-115，为白色固体，收率为60.6％。m.p.265-267℃； 硅胶TLCR_f0.37(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3355(N-H脲)， 2221(C≡N)，1695(C＝O脲)，1594(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.26 (2H，s，SO₂NH₂)，7.66(2H，d，J8.8)，7.68(2H，d，J9.2)，7.78(2H， d，J8.8，重叠)，7.79(2H，d，J8.8，重叠)，9.28(1H，s，NH)，9.35(1H， s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.8(C＝O脲)，144.8，143.2，138.3， 134.2，127.8，120.1，119.2，118.8，104.6(C≡N)。

4-{([(2’-氰基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-116)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸2-氰基苯酯(0.41g；2.90 mmol)处理并且将反应搅拌1天直至形成沉淀。获得的粗产物通过用乙酸 乙酯/石油醚1/1洗脱的硅胶柱色谱纯化，得到MST-116，为白色固体。m.p. 256-258℃；硅胶TLCR_f0.73(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3310 (N-H脲)，2231(C≡N)，1696(C＝O脲)，1587(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)7.26(1H，ddd，J7.67.20.8，4’-H)，7.27(2H，s，S_O2NH₂)， 7.67(2H，d，J9.0，2x3-H)，7.70(1H，ddd，J8.47.21.6，5’-H)，7.80(2H， d，J9.0，2x2-H)，7.82(1H，dd，7.61.6，3’-H)，8.1(1H，dd，J8.40.4， 6’-H)，8.90(1H，s，NH)，9.78(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.8 (C＝O脲)，143.2，142.4，138.4，135.0，134.1，127.8，124.5，122.6，118.7， 117.8，103.6(C≡N)。

4-({[(4’-苯氧基苯基)氨基]羰基}氨基)苯磺酰胺(MST-117)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4苯氧基苯酯(0.61g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌5h，如先前报道的通用程序中所描 述的进行处理，得到MST-117，为白色固体，收率为46.8％。m.p.236-237 ℃；硅胶TLCR_f0.41(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3328(N-H 脲)，1653(C＝O脲)，1595(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.00(2H， dd，J8.81.2，3’-H)，7.03(2H，d，J9.0，6’-H)，7.13(1H，dt，J7.50.8， 8’-H)，7.24(2H，s，SO₂NH₂)，7.40(2H，dd，J9.07.5，7’-H)，7.52(2H， d，J8.8，2’-H)，7.65(2H，d，J9.2，3-H)，7.76(2H，d，J9.2，2-H)， 8.84(1H，s，NH)，9.08(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)158.5(C＝O 脲)，153.3，151.9，143.8，137.7，136.2，130.9，127.7，123.8，121.2， 120.7，118.7，118.4。

4-[(联苯-2’-基氨基甲酰基)氨基]苯磺酰胺(MST-118)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸联苯-2-基酯(0.57g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-118，为白色固体，收率为40.0％。m.p.229-231 ℃；硅胶TLCR_f0.75(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3365(N-H 脲)，1675(C＝O脲)，1584(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.20(1H， d，J7.4)，7.22(2H，s，SO₂NH₂)，7.27(1H，dd，J7.41.6)，7.39(1H，dt， J8.41.6，10’-H)，7.46(2H，dt，J6.81.6)，7.54(1H，d，J7.6，6’-H)， 7.58(2H，d，J9.2，2x3-H)，7.74(2H，d，J9.2，2x2-H)，7.83(1H，s， NH)，7.95(1H，d，J8.0，3’-H)，9.41(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 153.6(C＝O脲)，144.0，139.5，137.8，136.4，134.2，131.5，130.2，129.9， 128.9，128.6，127.9，124.8，124.0，118.3。

4-{[(3’-硝基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-119)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50mg；2.90mmol)用异氰酸3-硝基苯酯(0.47g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌1天，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-119，为黄色固体，收率为44.3％。m.p.246-248 ℃；硅胶TLCR_f0.39(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3370(N-H 脲)，1709(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.23(2H， s，SO₂NH₂)，7.59(1H，dd，J8.48.0，5’-H)，7.65(2H，d，J9.0，2x3-H)， 7.73(1H，ddd，J8.42.0，0.8，6’-H)，7.76(2H，d，J9.0，2x2-H)，7.86 (1H，ddd，J8.02.40.8，4’-H)，8.58(1H，appt，J2.2，2’-H)，9.25(1H， s，NH)，9.35(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O脲)，149.1， 143.3，141.6，138.3，131.1，127.7，125.5，118.8，117.6，113.3。

4-{([(4’-甲氧基-2’-甲基苯基)氨基]羰基)氨基}苯磺酰胺(MST-120)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-甲氧基-2-甲基苯酯 (0.47g；2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用 程序中所描述的进行处理，得到MST-120，为白色固体，收率为40.1％。 m.p.240-241℃；硅胶TLCR_f0.35(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr) cm^-1，3313(N-H脲)，2835(C-H脂肪族的)，1647(C＝O脲)，1591(芳族的)； δ_H(400MHz，DMSO-d₆)2.25(3H，s，CH₃)，3.76(3H，s，OCH₃)，6.78(1H， dd，J8.82.8，5’-H)，6.84(1H，d，J2.8，3’-H)，7.22(2H，s，SO₂NH₂)， 7.55(1H，d，J8.8，6’-H)，7.63(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.75(2H，d，J 8.8，2x2-H)，7.96(1H，s，NH)，9.26(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 156.6(C＝O脲)，153.7，144.2，137.4，132.3，130.7，127.8，125.3，118.1， 116.4，112.2，56.1(OCH₃)，19.0(CH₃)。

4-{[(9H-芴-2-基氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-121)：向4-氨基苯磺 酰胺(0.50g；2.90mmol)在乙腈(20ml)中的溶液中逐滴加入溶解在10ml 乙腈中的异氰酸9H-芴-2-基酯(0.59g；2.90mmol)。反应在室温搅拌1h， 如先前报道的通用程序中所描述的进行处理，得到MST-121，为白色固体， 收率为62.0％。m.p.280-285℃；硅胶TLCR_f0.52(乙酸乙酯/石油醚 33％)；v_max(KBr)cm^-1，3329(N-H脲)，1648(C＝O脲)，1591(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)3.94(2H，s，CH₂)，7.24(2H，s，SO₂NH₂)，7.29(1H， appt，J7.2，4’-H)，7.39(1H，appt，J7.2，5’-H)，7.46(1H，d，J7.2，3’-H)， 7.58(1H，d，J7.2，6’-H)，7.67(1H，d，J8.4，2x3-H)，7.78(1H，d，J 8.4，2x2-H)，7.83(3H，m，2’-H，7’-H，8’-H)，8.94(1H，s，NH)，9.14 (1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O脲)，144.9，143.8， 143.5，142.0，139.3，137.7，136.4，127.8，127.6，126.8，125.9，121.2， 120.2，118.4，118.2，116.2，37.4(CH2)。

4-[(环戊基氨基甲酰基)氨基]苯磺酰胺(MST-122)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸环戊酯(0.32g；2.90 mmol)处理并且反应在50℃搅拌2h，如先前报道的通用程序中所描述的 进行处理，得到MST-122，为白色固体，收率为68.8％。m.p.224-226℃； 硅胶TLCR_f0.57(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3328(N-H脲)， 3055(C-H脂肪族的)，1684(C＝O脲)，1591(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)1.41(2H，m，2x3’-H_ax)，1.58(2H，m，2x2’-H_ax)，1.67(2H， m，2x2’-H_eq)，1.88(2H，m，2x3’-H_eq)，3.98(1H，six，J6.8，1’-H)， 6.35(1H，d，J6.8，NH)，7.18(2H，s，SO₂NH₂)，7.55(2H，d，J8.8，2 x3-H)，7.70(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.68(1H，s，NH)；δ_C(100MHz， DMSO-d₆)155.3(C＝O脲)，144.6，136.8，127.7，117.6，51.8(C-1’)，33.7 (C-2’)，24.1(C-3’)。

4-{([(3，5-二甲基苯基)氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-123)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸3，5-二甲基苯酯(0.43g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-123，为白色固体，收率为60.6％。m.p 235-236℃；硅胶TLCR_f0.58(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1， 3343(N-H脲)，2860(C-H脂肪族的)，1686(C＝O脲)，1595(芳族的)；δ_H(400 MHz，DMSO-d₆)2.27(6H，s，2x CH₃)，6.68(1H，s，4’-H)，7.12(2H， s，2’-H)，7.23(2H，s，SO₂NH₂)，7.64(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.76(2H， d，J8.8，2x2-H)，8.67(1H，s，NH)，9.06(1H，s，NH)；δ_C(100MHz， DMSO-d₆)153.1(C＝O，脲)，143.8，140.1，138.7，137.7，127.7，124.7， 118.3，117.1，22.0(2x CH₃)。

4-{([(4’-氯苯基)氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-124)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-氯苯酯(0.44g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-124，为白色固体，收率为89.4％。m.p239-240℃； 硅胶TLCR_f0.44(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3327(N-H脲)， 1652(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.24(2H，s， SO₂NH₂)，7.38(2H，d，J8.8，2x2’-H)，7.53(2H，d，J8.8，2x3’-H)， 7.64(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.76(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.97(1H，s， NH)，9.13(1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.1(C＝O，脲)，143.6， 139.2，137.9，129.6，127.7，126.6，120.9，118.5。

4-{[(2，3-二氢-1H-茚-5-基氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-125)：

将4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸5-茚满基酯(0.46g；2.90 mmol)并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所描述的进 行处理，得到MST-125，为白色固体，收率为60.6％。m.p233-235℃； 硅胶TLCR_f0.61(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3333(N-H脲)， 2844(C-H脂肪族的)，1653(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz， DMSO-d₆)2.04(2H，appqt，J7.4，2’-H)，2.85(4H，appqt，J7.4，2x1’-H， 2x3’-H)，7.16(1H，appd，J8.2，6’-H)，7.19(1H，appdd，J8.21.6，7’-H)， 7.25(2H，s，SO₂NH₂)，7.42(1H，s，4’-H)，7.63(2H，d，J8.8，2x3-H)， 7.75(2H，d，J8.8，2x2-H)，8.70(1H，s，NH)，9.06(1H，s，NH)；δ_C(100 MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O，脲)，145.2，143.9，138.4，137.6，127.8，125.2， 118.3，117.7，115.7，一个碳重叠信号，33.48，32.64，26.15(3x CH₂)。

4-{[([4-(三氟甲基)苯基]氨基}羰基)氨基]苯磺酰胺(MST-126)：将4-氨 基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸4-三氟甲基-苯酯(0.54g；2.90 mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所描述 的进行处理，得到MST-126，为白色固体，收率为96.1％。m.p281-283℃； 硅胶TLCR_f0.49(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3334(N-H脲)， 1657(C＝O脲)，1592(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.27(2H，s， SO₂NH₂)，7.66(2H，d，J8.8，2x3-H)，7.72(4H，m，2x2’-H，2x3’-H) 7.78(2H，d，J8.8，2x2-H)，9.24(1H，s，NH)，9.26(1H，s，NH)；δ_C(100 MHz，DMSO-d₆)153.0(C＝O，脲)，144.0(m，C-1’)，143.4(C-4)，138.2(C-1)， 127.7(2x C-2)，127.0(q，³J_C-F3.8，C-3’)，125.4(q，J_C-F269，CF₃)，123.0 (q，²J_C-F32，C-4’)，119.0(2x C-2’)，118.7(2x C-3)；δ_F(376.5MHz，DMSO-d₆) -60.1(3F，s)。

4-{[([3，5-双(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-127)：将 4-氨基苯磺酰胺(0.50g；2.90mmol)用异氰酸3，5-双(三氟甲基)苯酯(0.74g； 2.90mmol)处理并且将反应在室温搅拌过夜，如先前报道的通用程序中所 描述的进行处理，得到MST-127，为白色固体，收率为81.4％。m.p 228-229℃；硅胶TLCR_f0.62(乙酸乙酯/石油醚33％)；v_max(KBr)cm^-1，3374 (N-H脲)，1653(C＝O脲)，1596(芳族的)；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)H)， 7.27(2H，s，SO₂NH₂)，7.69(2H，d，J9.0，3-H)，7.71(1H，s，4’-H)， 7.79(2H，d，J9.0，2-H)，8.16(2H，s，2x2’-H)，9.43(1H，s，NH)，9.54 (1H，s，NH)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.2(C＝O，脲)，143.1，142.5， 138.5，131.7(q，²J_C-F32，2x C-3’)，127.7(2x C-2)，124.2(q，J_C-F272， 2x CF₃)，119.2(m，2x C-2’)，119.1(2x C-3)，115.7(m，C-4’)；δ_F(376.5 MHz，DMSO-d₆)-61.7(6F，s)。

脲基取代的化合物(MST-128-133) 材料和方法

无水溶剂和所有试剂购自Sigma-Aldrich，Alfa Aesar和TCI。在氮气 氛下，使用干燥玻璃器皿和注射器技术来转移溶液进行涉及空气或湿气敏 感的化合物的所有反应。红外(IR)光谱被记录为KBr板，并且以nhyd^-1表 示)。使用Bruker Advance III400MHz光谱仪在MeOH-d4或在DMSO-d₆中记录核磁共振(¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，HSQC，HMBC)光谱。化 学位移以百万分率(ppm)报告并且耦合常数(J)以赫兹(Hz)表示。分裂模式 (Splitting pattern)被指定如下：s，单峰；d，双峰；sept，七重峰；t，三重 峰；q，四重峰(quadruplet)；m，多重峰；brs，宽单峰；dd，双重的双重 峰(double of doubles)，appt，明显三重峰(aparent triplet)，appq，明显四重 峰(aparent quartet)。可交换质子(OH和NH)的分配通过添加D₂O确认。在 Merck硅胶F-254板上进行分析型薄层色谱法(TLC)。在作为固定相的 Merck硅胶60(230-400目ASTM)上进行急骤色谱法纯化并且乙酸乙酯/ 正己烷或MeOH/DCM用作洗脱剂。熔点(mp)在开口毛细管中进行并且未 校正。

3-(3-(4’-碘苯基）脲基）苯磺酰胺（MST-128)

3-(3-(4’-碘苯基)脲基)苯磺酰胺(A)：m.p.256-258℃；v_max(KBr)cm^-1， 3165，3265，1643，1589；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.34-7.66(9H，m， Ar-H，SO₂NH₂，用D₂O交换)，8.10(1H，d，J，2.1，2-H)，8.79(1H，s， NH，用D₂O交换)，9.08(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 153.1(C＝O)，145.6，140.9，140.3，138.3，130.3，122.1，121.6，119.9， 116.1，85.9；元素分析计算值[C，37.42；H，2.90；N，10.07]；文献值[C， 37.06；H，2.79；N，9.82]；m/z(ESI⁺)418(M+Na)⁺。

3-(3-(4’-氟苯基）脲基）苯磺酰胺(MST-129)

3-(3-(4’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(B)：m.p.233-235℃；v_max(KBr)cm^-1， 3377，3352，1685，1557；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.17(1H，dd，J8.8， Ar-H)，7.45(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.47-7.60(5H，m，Ar-H)， 8.10(1H，d，J，2.1，2-H)，8.78(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.04(1H， s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)158.4(d，J_C-F237，C-4’)， 153.4(C＝O)，145.6，141.1，136.6，130.3，122.0，121.2，119.8，116.3， 116.1；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-121.14；元素分析计算值[C，50.48；H， 3.91；N，13.58]；文献值[C，49.98；H，3.79；N，13.49]；m/z(ESI⁺)311 (M+Na)⁺。

3-(3-(3’-硝基苯基）脲基）苯磺酰胺（MST-130)

3-(3-(3’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(C)：m.p.252-255℃；v_max(KBr)cm^-1， 3380，3350，1689，1550；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.41(2H，s，SO₂NH₂， 用D₂O交换)，7.48-7.64(4H，m，Ar-H)，7.77(1H，dd，J7.2，2.1，Ar-H)， 7.87(1H，dd，J7.2，2.1，Ar-H)，8.14(1H，d，J，2.1，2-H)，8.63(1H， d，J，2.1，2’-H)，9.23(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.31(1H，s，NH， 用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.3(C＝O)，149.1，145.7，141.7， 140.6，131.0，130.3，125.4，122.4，120.2，117.4，116.4，113.2；元素分 析计算值[C，46.43；H，3.60；N，16.66]；文献值[C，46.91；H，3.55； N，16.94]；m/z(ESI⁺)337(M+Na)⁺。

3-(3-(4’-乙酰基苯基）脲基）苯磺酰胺(MST-131）

3-(3-(4’-乙酰基苯基)脲基)苯磺酰胺(D)：m.p.267-269℃；v_max(KBr) cm^-1，3402，3351，2014，1933，1912，1593；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)2.56 (3H，s，CH₃)，7.41(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.48-7.55(3H，m， 4-H，5-H，6-H)，7.60(2H，d，J7.2，2x2’-H)，7.97(2H，d，J7.2，2x 3’-H)，8.13(1H，t，J2.0，2-H)，9.18(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.19(1H， s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)197.2(CH₃C＝O)，153.0 (C＝O)，145.7，145.0，140.7，131.6，130.5，130.4，122.2，120.2，118.2， 116.2，27.2；元素分析计算值[C，54.04；H，4.54；N，12.60]；文献值[C， 54.31；H，4.47；N，12.96]；m/z(ESI⁺)334(M+Na)⁺。

3-(3-(2’-异丙基苯基）脲基）苯磺酰胺(MST-132)

3-(3-(2’-异丙基苯基)脲基)苯磺酰胺(E)：m.p.175-176℃；v_max(KBr) cm^-1，3328，3300，1690，1556；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)1.23(6H，d，J 6.2，2x8’-H₃)，3.19(1H，sept，J6.2，7’-H)，7.14(2H，m，Ar-H)，7.35 (1H，d，J7.2，Ar-H)，7.37(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.59-7.70(4H， m，Ar-H)，8.00(1H，s，NH，用D₂O交换)，8.10(1H，t，J2.0，2-H)， 9.30(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.9(C＝O)， 145.6，141.3，140.7，136.1，130.3，126.7，126.2，125.2，124.7，121.7， 119.5，115.8，27.8，24.0；元素分析计算值[C，57.64；H，5.74；N，12.60]； 文献值[C，58.14；H，5.73；N，12.70]；m/z(ESI⁺)334(M+Na)⁺。

3-(3-(全氟苯基）脲基）苯磺酰胺(MST-133)

3-(3-(全氟苯基)脲基)苯磺酰胺(F)：m.p.224-227℃；v_max(KBr)cm^-1， 3390，3287，1785，1560；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.38(2H，s，SO₂NH₂， 用D₂O交换)，7.50(2H，m，Ar-H)，7.63(1H，d，J7.2，Ar-H)，8.09(1H， s，2-H)，8.63(1H，s，ArNHCONH，用D₂O交换)，9.47((1H，s，ArNHCONH， 用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.9(C＝O)，145.6，144.1(d，J¹_C-F245)，140.7，139.6(d，J¹_C-F253)，138.2(d，J¹_C-F245)，130.4，122.3， 120.4，116.4，114.7(t，J_C-F12)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-146.3(2F，dd， J19.24.8，2x2’-F)，-159.2(1F，t，J22.9，4’-F)，-164.0(2F，dt，J22.6 4.8，2x3’-F)；元素分析计算值[C，40.95；H，2.11；N，11.02]；文献值 [C，40.68；H，1.74；N，11.00]；m/z(ESI⁺)382(M+Na)⁺。

表2：用间-脲基取代的磺酰胺MST-128至-133的CA抑制数据。

化合物   Ki(nM)       hCAI hCAII hCAIX hCAXII MST-128 426 67 13.1 4.5 MST-129 414 59 10.2 5.8 MST-130 614 41 7.9 8.2 MST-131 762 74 15.1 12.8 MST-132 593 38 18.5 13.7 MST-133 69 5.4 4.2 4.8

对应于MST-134-148的脲基磺酰胺的合成

4-(3-(4’-氯-2-氟苯基)脲基)苯磺酰胺MST-134

4-(3-(4’-氯-2-氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270， 1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.26-7.30(3H，brs，SO₂NH₂，用 D₂O交换，5’/6’-H)，7.52(1H，dd，J，8.2，2.1，5’/6’-H)，7.64(2H，d， J8.2，2x2/3-H)，7.78(2H，d，J8.2，2x2/3-H)，8.19(1H，dd，J9.0， 8.23’-H)，8.79(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.47(1H，s，NH，用D₂O 交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.8(d，J¹_C-F245，C-2’)，152.7(C＝O)， 143.2，138.2，127.8，127.4，(d，J_C-F10)，126.7(d，J_C-F10)，125.6，122.5， 118.4，116.6(d，J_C-F23)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-126.38。

4-(3-(4’-溴-2’-氟苯基）脲基）苯磺酰胺MST-135

4-(3-(4’-溴-2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270， 1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.27(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.40(1H，d，J，9.25’/6’-H)，7.64(3H，m，2x2/3-H，5’/6’-H)，7.78 (2H，d，J9.2，2x2/3-H)，8.16(1H，t，J8.83’-H)，8.79(1H，s，NH， 用D₂O交换)，9.48(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 152.8(d，J¹_C-F245，C-2’)，152.7(C＝O)，143.2，138.2，128.5，127.9， 127.7(d，J_C-F6)，122.8，119.2(d，J_C-F22)，118.4，114.0(d，J_C-F9)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-126.38。

4-(3-(2’-氟-5’-硝基苯基）脲基）苯磺酰胺MST-136

4-(3-(2’-氟-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270， 1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.28(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.60(1H，dd，J，9.26.8，6’-H)，7.70(2H，d，J9.2，2x2/3-H)， 7.80(2H，d，J9.2，2x2/3-H)，7.96(1H，m，4’-H)，9.13(1H，s，NH， 用D₂O交换)，9.18(1H，m，6’-H)，9.57(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₂)156.0(d，J¹_C-F251，C-2’)，154.8(C＝O)，144.9， 142.9，138.6，129.3(d，J_C-F12)，127.9，119.0(d，J_C-F9)，118.7，117.0 (d，J_C-F22)，115.7；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-119.43

4-(3-(2’，4’，5’-三氟苯基）脲基）苯磺酰胺MST-137

4-(3-(2’，4’，5’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270， 1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.27(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.68(3H，m，2x2/3-H，3’-H)，7.78(2H，d，J9.2，2x2/3-H)，8.22 (1H，m，6’-H)，8.58(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.47(1H，s，NH，用 D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.7(C＝O)，148.2(dd，J¹_C-F240， 12.2)，146.4(d，J¹_C-F237，15.8)，144.4(dd，J¹_C-F250，12.0)，143.3，138.3， 127.8，125.0(m)，118.5，109.5(dd，J_C-F24.5，2.9)，106.4(dd，J_C-F25.6， 22.0)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-130.64(d，J_F-F13.9)，-141.75(m)，-143.06 (d，J_F-F24.4)。

4-(3-(2’-氟-5’-(三氟甲基)苯基）脲基）苯磺酰胺MST-138

4-(3-(2’-氟-5’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166， 3270，1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.28(2H，s，SO₂NH₂，用 D₂O交换)，7.47(1H，m，4’-H)，7.55(1H，dd，J10.88.8，3’-H)，7.67(2H， d，J8.8，2x2/3-H)，7.79(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.63(1H，m，6’-H)， 9.03(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.56(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100 MHz，DMSO-d₆)154.0(d，J¹_C-F247，C-2’)，152.8(C＝O)，143.0，138.5， 129.30(d，J_C-F11.3)，127.9，126.2(dd，J_C-F31.8，3.3)，123.5，120.7(m)， 118.6，117.7，117.0(d，J_C-F20.5)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-60.7(3F， C-F₃)，-123.8(1F，2’-F)。

4-(3-(2’-氟-3’-(三氟甲基）苯基）脲基）苯磺酰胺MST-139

4-(3-(2’-氟-3’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166， 3270，1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.27(2H，s，SO₂NH₂，用 D₂O交换)，7.43(2H，m，5’-H，6’-H)，7.65(2H，d，J8.8，2x2/3-H)， 7.79(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.46(1H，m，4’-H)，8.96(1H，s，NH， 用D₂O交换)，9.53(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 152.7(C＝O)，150.0((d，J¹_C-F250，C-2’)，143.1，138.3，129.4((d，J_C-F9)， 127.8，125.9(d，J_C-F43.9)，124.9，122.2，120.4，118.7，117.5(dd，J_C-F32.1，3.2)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-59.8(3F，d，J_F-F13.2，C-F₃)，-132.2 (1F，q，J13.2，2’-F)。

4-(3-(2’，3’，4’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺MST-140

4-(3-(2’，3’，4’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270， 1640，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.27(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.34(2H，m，5’/6’-H)，7.65(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.77(2H，d， J8.8，2x2/3-H)，7.88(1H，m，5’/6’-H)，8.82(1H，s，NH，用D₂O交 换)，9.45(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.9(C＝O)， 146.6(d，J¹_C-F237)，143.2，141.8(d，J¹_C-F240)，139.6(d，J¹_C-F242)， 138.3，127.8，126.0(m)，118.5，116.7(m)，112.6(dd，J_C-F18，4)；δ_F(376 MHz，DMSO-d6)-143.1(1F，d，J_F-F21.7，2’/4’-F)，-148.4(1F，d，J_F-F21.7， 2’/4’-F)，-161.1(1F，t，J_F-F21.7，3’-F)。

4-(3-(2’-氟苯基）脲基）苯磺酰胺MST-141

4-(3-(2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270，1640， 1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.07(1H，m，3’-H)，7.20(1H，m，4’-H)， 7.26(3H，brs，SO₂NH₂，用D₂O交换，5’-H)，7.64(2H，d，J8.8，2x2/3-H)， 7.80(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.20(1H，m，6’-H)8.70(1H，s，NH，用 D₂O交换)，9.46(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.1 (d，J¹_C-F240)，152.9(C＝O)，143.4，138.1，128.1，127.8，125.4，123.8， 121.7，118.3，116.6(d，J _C-F19)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-129.59。

4-(3-(2’，4’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺MST-142

4-(3-(2’，4’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270，1640， 1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.08(1H，m，3’/5’-H)，7.25(2H，s，SO₂NH₂， 用D₂O交换)，7.36(1H，m，3’/5’-H)，7.64(2H，d，J8.8，2x2/3-H)， 7.78(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.11(1H，m，6’-H)，8.64(1H，s，NH， 用D₂O交换)，9.41(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 158.1(dd，J_C-F243，13)，153.4(dd，J_C-F244，12)，153.0(C＝O)，143.4， 138.1，128.1，127.8，124.5(d，J_C-F9)，123.2(d，J_C-F8)，118.4，112.0(d， J_C-F21)，104.8(t，J_C-F25)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-117.52，-124.3。

4-(3-(3’-氯苯基)脲基)苯磺酰胺MST-143

4-(3-(3’-氯苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270，1640， 1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.07(1H，d，J8.8，4’-H)，7.25(2H，s， SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.33(2H，m，5’-H，6’-H)，7.64(2H，d，J8.8， 2x2/3-H)，7.77(3H，m，J8.8，2x2/3-H，2’-H)，9.04(1H，s，NH，用 D₂O交换)，9.17(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)153.1 (C＝O)，143.5，141.8，138.0，134.1，131.3，127.7，122.7，118.7，118.6， 117.8。

4-(3-(2’，5’-二氯苯基)脲基)苯磺酰胺MST-144

4-(3-(2’，5’-二氯苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3166，3270，1640， 1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.15(1H，dd，J8.82.8，4’-H)，7.28(2H， s，SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.55(1H，dd，J8.82.8，3’-H)，7.64(2H，d， J8.8，2x2/3-H)，7.79(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.35(1H，d，J2.8，6’-H)， 8.60(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.90(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100 MHz，DMSO-d₆)152.7(C＝O)，143.1，138.4，137.8，132.9，131.5，127.9， 124.0，121.3，121.1，118.7。

4-(3-(2’-氯-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺MST-145

4-(3-(2’-氯-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3164，3271， 1641，1592；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.29(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.70(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.82(3H，m，2x2/3-H，3’-H)，7.93 (1H，dd，J8.92.2，4’-H)，8.84(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.20(1H，d， J2.2，6’-H)，9.99(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.7 (C＝O)，147.5.142.9，138.6，137.7，131.3，128.9，127.9，118.8，118.5， 115.6。

4-(3-(2’-氯-4’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺MST-146

4-(3-(2’-氯-4’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3169，， 1639，1560；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.29(2H，s，SO₂NH₂，用D₂O交 换)，7.69(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.74(1H，dd，J8.84.0，5’-H)，7.80 (2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.92(1H，dd，J4.0，3’-H)，8.50(1H，d，J8.8， 6’-H)，8.76(1H，s，NH，用D₂O交换)，10.0(1H，s，NH，用D₂O交换)； δ_C(100MHz，DMSO-d₆)152.5，143.0，140.4，138.5，128.7，127.9，127.2 (m)，125.8(m)，124.0(d，J_C-F33.0)，13.2，122.7，121.4；δ_F(376MHz， DMSO-d₆)-60.42。

4-(3-(2’，6’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺MST-147

4-(3-(2’，6’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3164，3270，1641， 1590；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.33(4H，m，SO₂NH₂，用D₂O交换，2x 5’-H)，7.37(1H，m，4’-H)，7.64(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.76(2H，d， J8.8，2x2/3-H)，8.30(1H，s，NH，用D₂O交换)，9.38(1H，s，NH， 用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆)158(d，J¹_C-F247，C-2’，C-6’)， 153.27(C＝O)，143.7，138.0，128.3(m)，127.7，118.5，115.9(t，J_C-F16， C-4’)，112.6(d，J_C-F23，2xC-3’)；δ_F(376MHz，DMSO-d₆)-118.73。

4-(3-(全氯苯基)脲基)苯磺酰胺MST-148

4-(3-(全氯苯基)脲基)苯磺酰胺：v_max(KBr)cm^-1，3168，3275，1641， 1590；δ_H(400MHz，DMSO-d₆)7.24(2H，m，SO₂NH₂，用D₂O交换)，7.64 (2H，d，J8.8，2x2/3-H)，7.75(2H，d，J8.8，2x2/3-H)，8.29(1H，s， NH，用D₂O交换)，9.38(1H，s，NH，用D₂O交换)；δ_C(100MHz，DMSO-d₆) 153.2(C＝O)，142.0，139.2，130.1(重叠信号)，127.4，125.5。

表3：利用脲基取代的磺酰胺MST-134-148的CA抑制数据

化合物   Ki(nM)       hCAI hCAII hCAIX hCAXII MST-134 436 162 5.1 7.9 MST-135 373 418 6.3 7.4 MST-136 519 276 7.3 7.6 MST-137 569 215 7.6 6.2 MST-138 363 170 7.4 10.1 MST-139 395 196 8.7 8.5 MST-140 484 335 9.6 6.4 MST-141 550 33.0 7.7 7.3 MST-142 275 60.6 3.7 7.1 MST-143 158 10.0 8.4 8.5 MST-144 747 58.2 8.9 6.8 MST-145 307 0.94 8.2 6.1 MST-146 192 0.97 8.4 8.2 MST-149 158 0.93 6.1 8.3 MST-150 538 362 6.3 7.6

对于剩下的实施例，以下方法和另外的信息将是有用的参考。

细胞培养和缺氧暴露

先前已经描述了表达荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系4T1、66cl4和 67NR，以及人乳腺癌细胞系MDA-231和MDA-231LM2-4的获取、传代和 培养(Lou等，(2008)Dev Dyn237：2755-2768；Lou等，(2011)Cancer Res(癌 症研究)，71：3364-3376。对于缺氧下的培养，将细胞保持在密封厌氧工作 站中在加湿温育器中在37℃在1％O₂和5％CO₂(余量为N₂)中。

稳定细胞的传代

根据制造商说明，使用LipofectAMINEPLUS^TM(Invitrogen Life  Technologies)，将靶向小鼠CAIX的shRNAmir载体和非沉默序列(Open  Biosystems)转染入90％汇合的细胞中。由于之前使用嘌呤霉素，所以转染 的细胞利用潮霉素进行选择。稳定的shCAIX克隆通过有限稀释克隆获得。 对于CAIX(再)引入到细胞中，人CAIX(来自Dr.Jacques Pouysségur， University of Nice的赠品)依照相同程序转染入4T1细胞中并且Zeocin用于 选择。

胞外pH的测量

溶液pH的变化利用之前公开的程序进行评估(29，42，43)。简言之， 将细胞在60mm培养皿中以适当密度(对于4T1细胞及其转染衍生物为 1x10₄个细胞/cm2；对于66cl4细胞为2x10₄个细胞/cm2；对于67NR细胞及其 转染衍生物为1x10₄个细胞/cm2)铺板并允许复苏过夜。然后添加3ml标准 体积的新鲜培养基/皿并且将细胞在常氧(空气+5％CO₂)或缺氧(1％O₂和 5％CO₂，余量为氮气)中温育72小时。注意确保在常氧和缺氧下生长的培 养物在培养基收集时处于相似的汇合并且含有相似细胞数。将收集的用过 的培养基保持在37℃并且使用数字pH计立即测量pH。进行细胞计数以确 保在两种环境条件下给定细胞系的细胞数相当。在冰上收集细胞以用于 qRT-PCR和蛋白质印迹分析。

药理学抑制剂

磺酰胺MST-017的化学性质之前已以名称CAI17被描述(Supuran，C. 2008，Nature(自然).Vol7：168-181)。脲基磺酰胺是新的。对于体外研究， 将所述化合物溶解在DMSO中，储存在-80℃并在将要应用之前稀释到培 养基中。将分汇合细胞与MST-017在常氧或缺氧下温育72小时，在PBS中 洗涤3次并利用Zeiss Axioplan^TM表面荧光显微镜成像。对于体内研究， MST-017抑制剂通过腹膜内注射给药(前两剂静脉内给药)，75mg/kg和150 mg/kg，3次/周，共2周。其他抑制剂的用药浓度和时间表在以下适当实施 例中指示。在注射之前将所述化合物溶解在PEG400/乙醇/盐水中。当抑制 剂浓度变化时，载体(vehicle)组分保持恒定。

mRNA和蛋白质表达的分析

根据制造商说明，使用Roche通用探针文库(UPL)，在Applied  Biosystems仪器上，在384孔平板中，进行定量实时PCR(qRT-PCR)。简言 之，将1μg来自分汇合细胞或快速冷冻组织的总RNA用于制备cDNA。将 10μl的含有100nM UPL探针、200nM各引物(Invitrogen)和TaqMan^TM PCR master mix(Applied Biosystems)的qRT-PCR混合物加载到各孔以用于40个 循环的PCR(44)。获取相关基因表达定量数据并利用ABI Prism7900HT序 列检测系统和使用β-肌动蛋白作为持家基因的标准2-ΔΔct方法进行分析。 对于免疫印迹法，将细胞或急骤冷冻的肿瘤组织在补充有适当抑制剂的1％ Triton X-100缓冲液(50mM Hepes，pH＝7.5，150mM NaCl，10％甘油，1mM EGTA和2mM EDTA)中裂解。将等量的蛋白质加载到SDA-PAGE凝胶上。 为了增强HIF-1α在降解之前的检测，将等密度的细胞在低氧下在4x SDS 加样缓冲液中直接裂解。利用小鼠CAIX(1∶500)、HIF-1α(1∶250)、人CAIX (1∶1000)(全部来自R&D Systems)和β-肌动蛋白(1∶10,000，Sigma)抗体进行 蛋白质印迹。

小鼠肿瘤模型

所有动物研究和程序依照由在BC癌症研究中心和不列颠哥伦比亚大 学(BC Cancer Research Centre and the University of British Columbia)的动物 保护协会(Institution Animal Care Committee)(Vancouver，BC，Canada)批准 的方案进行。

同系正位肿瘤和自发性转移

将4T1细胞(1x10⁶)或67NR细胞(2x10⁶)正位植入到7-9周龄雌性 BALB/c小鼠的第四乳房脂肪垫中，如之前所述(Lou等，(2011)Cancer Res (癌症研究)71：3364-3376；Lou等，(2008)Dev Dyn237：2755-2768)。注射 该数量级的细胞对于这些肿瘤的增殖是标准的，并且适当低于在其他肿瘤 生长模型中所用的(Erler，JT.Bennewith，KL，.Icolau，M.Nature440： 1222-1226)。利用修改的椭球体公式(LxW²)/2从卡尺测量结果计算原发性 肿瘤生长速率。监测肿瘤形成和转移进展并使用生物发光成像进行定量， 如之前描述(Ebos等，(2009)Cancer Cell(癌细胞)15：232-239.；Lou等，(2008) Dev Dyn237：2755-2768)。

实验转移测定

对于涉及CAIX的遗传减少的研究，将4T1或67NR细胞(5x10⁵)直接注入 7-9周龄雌性BALB/c小鼠的尾静脉中。小鼠每周成像一次以跟踪转移瘤的 生长。在注射后20天对小鼠进行安乐死并切除肺用于进一步分析。肺中的 通过手动计数肺表面上可见的结节对肿瘤负荷进行定量。对于使用磺酰胺 抑制剂的研究，将4T1细胞(1-5x10⁵)如上所述进行注射(Pacchiano等，(2011) J Med Chem(药物化学杂志)54：1896-1902)。

人异种移植肿瘤

对于涉及CAIX减少的研究，将悬浮在50％基质胶/PBS溶液中的1x 10⁷MDA-MB-231细胞经皮下植入6-8周龄雌性NOD.CB17-prkdc^scid/J小鼠。 对于使用MDA-MB-231LM2-4^Luc+变体(Ebos等，(2009)Cancer Cell(癌细 胞)15：232-239.)的原发性乳腺肿瘤异种移植物，将2x10⁶个细胞如上所述正 位植入小鼠中。在肿瘤达到200mm³时，开始治疗。对于两种模型，通过 卡尺测量监测肿瘤生长。

3D基质胶侵入测定

如之前所述的，进行3D“在上(on-top)”基质胶培养测定(Lee等，(2007) Nat Methods4：359-365)。简言之，将MDA-231LM2-4Luc+细胞(1.5x10⁴个 细胞/cm²)重悬在100μl/孔含有2x终浓度的抑制剂的生长培养基中并铺板 到用基质胶预先涂覆的8-孔室玻片(8-well chamber slide)中。允许细胞附着 45分钟，并且每10-15分钟进行左右(side-to-side)搅拌以防止细胞在孔中心 聚集。向细胞中加入另外的100μl/孔的含有10％基质胶的培养基并且将培 养物在缺氧下温育4天。获取图像并且使用在Lee等，(2007)Nat Methods 4：359-365)中概述的“全培养物固定”方法进行对于TUNEL的培养物固定。

肿瘤球培养

4T1细胞作为单层生长，并且每周两次转种到含有5％胎牛血清(FBS) (Sigma)的DMEM(Gibco)中。接着，依照制造商的说明，将shNS和shCAIX 4T1在mammocult培养基(StemCell Technologies，Vancouver，B.C.，Canada) 中培养为肿瘤球。

(肿瘤球是3-维结构(形状上经常为球状)，其由当肿瘤细胞在特定生长 条件下在体外培养时形成的粘附癌细胞构成(Fillmore和Kuperwasser，(2008) Breast Cancer Res.(乳腺癌研究)10:R25)。肿瘤球通常在悬浮培养中生长并 且被认为是体内肿瘤的体外替代品。)

流式细胞计数分析

将4T1肿瘤球与胰蛋白酶温育，在HF缓冲液(含有2％胎牛血清的HBSS) 中洗涤一次，然后用抗-CD24-APC和抗-CD44-PECy7染色(在100ul HF中， 使用0.3μl抗体/106个细胞)，并在冰上孵育10分钟。在孵育后，细胞用HF 缓冲液洗涤一次并重悬于300ul含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；终浓度， 1μg/ml)的HF缓冲液中。将细胞在Aria细胞分选器(BD Biosciences，San  Jose，CA，USA)上分离。基于正向散射和侧向散射对活细胞进行门控， 并且基于正向散射和脉冲宽度对单细胞进行门控。通过分析未染色的细 胞、同种型特异性对照和单次染色来确定门控(gate)。不评估 CD44+CD24-/low或CD44+CD24+细胞的纯度，由于获得的细胞数量低。 将流式细胞仪的细胞计数器用于确定细胞数量。将细胞收集到DMEM培养 基或HF缓冲液中。

免疫组织化学

肿瘤切除前两小时，小鼠腹膜内注射含有1500mg/kg BrdUrd(Sigma) 和60mg/kg哌莫硝唑(Pimonidazole)(Chemicon)的盐水溶液，并且在切除前 5分钟静脉内注射DiOC₇(3)(70μl，0.6mg/ml；Molecular Probes)。用 Cryostar^TM HM560(Microm International)切割连续肿瘤冷冻切片(10μm)， 空气干燥24h，并且对DiOC₇(3)组织荧光成像以可视化血流。在室温，将 切片在50％(v/v)丙酮/甲醇中固定10分钟。进行染色，对于脉管系统使用抗 -PECAM/CD31抗体(1∶2000克隆，2H8，BD Pharmingen)和Alexa647抗仓鼠 二抗(1∶200，Invitrogen)，对于缺氧使用多克隆兔-抗-哌莫硝唑(1∶2000， Hydroxyprobe Inc.)和Alexa488抗-兔二抗(1∶200，Molecular Probes)，对于 凋亡使用具有TMR红色标记的dUTP的TUNEL(Roche Diagnostics)。在荧光 成像后，将玻片转移至蒸馏水达10分钟，接着用2M HCl处理1h并用0.1M 硼酸钠中和5分钟。使用单克隆大鼠抗-BrdUrd(1∶500，克隆BU1/75，Sigma) 和抗-小鼠过氧化酶缀合抗体(1∶200，Sigma)以及金属增强的DAB底物 (1∶10，Pierce)检测结合DNA的BrdUrd。将苏木精复染玻片脱水并在成像之 前使用Permount(Fisher Scientific)封固。图像获取和分析如之前所描述的 进行(Kyle，AH.，Huxham，LA.，Yeoman，DM.等2007.Clin Cancer Res(临 床癌症研究)13：2804-2810)。对石蜡包埋的肿瘤切片同样进行针对CAIX (对于原发性肿瘤，1∶100；对于肺转移瘤，1∶50；Santa Cruz Biotechnology) 和HIF-1α(1∶100，R&D Systems)的染色，如之前所述(Luo等)。26对于淋巴 管生成研究，用2％PFA将冷冻组织切片固定20分钟，并在加湿容器中在室 温用溶解在含有10％牛血清清蛋白和2％羊血清的PBS中的兔抗-LYVE-1 (1∶100，R&D Systems)和大鼠抗-CD31(1∶100，BD Pharmigen)染色1h。使 用Alexa488抗-兔和Alexa546抗-大鼠抗体作为二抗达1h，接着是用于封固 (mounting)的含有DAPI核复染剂的Vectashield封固剂(Vector Laboratories)。

细胞增殖测定

根据制造商说明，使用MTT细胞增殖试剂盒(Roche Applied Science) 测量细胞生长。简言之，将细胞以5x10₃个细胞/cm2的密度涂板于96-孔 板中并允许复苏过夜。然后在进行所述测定前将平行样品在常氧和缺氧下 温育48至72h。

细胞凋亡测定

大部分根据制造商说明，将TUNEL标记(Roche Applied Science)用于 分析细胞凋亡。简言之，将生长在盖玻片上的分汇合细胞在1％血清中在 常氧或缺氧下温育48h，空气干燥，在4％多聚甲醛中固定60分钟并在室 温在PBS和0.1％Triton-X-100中透化10分钟。27然后在37℃用TUNEL 试剂将细胞层温育60分钟，在PBS中洗涤并用H33342的1∶10,000稀释 液复染色。

历史临床分析

1986年到1992年不列颠哥伦比亚省的4,444位患有新诊断的侵入性乳 腺癌的患者的组织微阵列从提交至中心雌激素受体实验室的肿瘤样本产 生。用来产生TMA的方法已被描述(Cheang，MD.，Chia，SK.，Vodu，D 等2009.J Natl Cancer Inst101：736-750)。该TMA群代表在这段时间期间 诊断的所有乳腺癌病例的大约70％，其都涉及不列颠哥伦比亚癌症机构 (British Columbia Cancer Agency)。3,630个病例具有充分的肿瘤和染色结 果用于评价所有的生物标记物。在连续切片上同时进行ER、PR、HER2、 CK5/6、EGFR和Ki67的免疫组化，并如之前所述的进行评分(Cheang MD 等)。使用鼠单克隆抗体(M75；1∶50)(Choi，SW.，Kim，JY.，Park，JY.2008 Hum Pathol 39：1317-1322)评估CAIX表达。CAIX表达的评分为0：无染 色或者1：任何染色，并且由两个病理学者独立且盲性地进行。研究的在 前批准获自不列颠哥伦比亚大学的伦理委员会。

统计学分析

使用Excel软件中的Data Analysis ToolPack^TM，对结果进行统计学分 析。双尾(two-tailed)p值利用学生t-检验计算。对于p＜0.05，认为数据是 显著性的。使用SPSS13.0(Chicago，IL)、S-Plus6.2(Seattle，WA)和R2.1.1 (http://www.r-project.org)进行对临床结果的统计学分析。在单变量分析中， BCSS(原发性乳腺癌的诊断日至以乳腺癌作为主要或潜在病因的死亡日) 和RFS(原发性乳腺癌的诊断日至局部、区域或远处复发的日期)以及远处 RFS(原发性乳腺癌的诊断日至远处复发的日期)通过Kaplan-Meier曲线估 算。Log-rank试验用来估算存活差异。对于多变量分析，Cox成比例危害 模型被用来估算调整过的危害比和显著性。为了评估成比例危害模型的侵 害(violation)，使用加权Schoenfeld残差的平滑曲线。

实施例2

CAIX是大部分乳腺癌患者的预后标记物

尽管之前的研究已经报道，包括乳腺癌在内的多种癌症类型中的CAIX 表达与如之前描述的不良患者预后相关联，但是样本大小相对较小并且辅 助治疗不统一。为了证实CAIX为经过标准化治疗的大样本群体中的重要 预后标记物，我们分析了CAIX在包含3992个患者样本(平均10.5年的随访) 的原发性乳腺肿瘤组织微阵列(TMA)中的表达。

用来产生TMA的方法已被描述(Cheang，MD.，Chia，SK.，Vodu，D 等2009.J Natl Cancer Inst101：736-750)。该TMA群代表在这段时间期间 诊断的所有乳腺癌病例的大约70％，其都涉及不列颠哥伦比亚癌症机构 (British Columbia Cancer Agency)。使用鼠单克隆抗体(M75；1∶50)(Choi， SW.，Kim，JY，Park，JY.2008Hum Pathol39：1317-1322)评估CAIX表达。 CAIX表达的评分为0：无染色或者1：任何染色，并且由两个病理学者独 立且盲性地进行。研究的在前批准获自不列颠哥伦比亚大学的伦理委员 会。

统计学分析

使用Excel软件中的Data Analysis ToolPack^TM，对结果进行统计学分 析。双尾p值利用学生t-检验计算。对于p＜0.05，认为数据是显著性的。 使用SPSS13.0(Chicago，IL)、S-Plus6.2(Seattle，WA)和R2.1.1 (http://www.r-project.org)进行对临床结果的统计学分析。在单变量分析中， BCSS(原发性乳腺癌的诊断日至以乳腺癌作为主要或潜在病因的死亡日) 和RFS(原发性乳腺癌的诊断日至局部、区域或远处复发的日期)以及远处 RFS(原发性乳腺癌的诊断日至远处复发的日期)通过Kaplan-Meier曲线估 算。Log-rank试验用来估算存活差异。对于多变量分析，Cox成比例危害 模型被用来估算调整过的危害比和显著性。为了评估成比例危害模型的侵 害(violation)，使用加权Schoenfeld残差的平滑曲线。

在15.6％的可评估肿瘤中观察到CAIX表达并且CAIX在生物学亚型之 间差异性地表达，其中在基底(basal)乳腺癌中相关性最高(51％)而在腔内A 亚型(luminal A subtype)中比例最低(8％)(下表5)。

在Kaplan-Meier分析中，CAIX表达显著地与较差无复发生存(图1A)、 远处无复发生存(图1B)和乳腺癌特异生存(图1C)相关，获得极高水平的统 计学显著性(分别为p＜10-17，p＜10-16，和p＜10-13)。相比于CAIX阴性组， CAIX阳性组的10年远处无复发生存率和乳腺癌特异生存率分别为57％ (相比于73％)，以及62％(相比于78％)。在包括所有标准预后变量和生物 学亚型的多变量分析中，CAIX表达保持强独立不良预后因子并且危害比 (hazard ratio)为1.4。这些数据证实并且扩展了之前研究的结果，该结果已 经显示CAIX是大量乳腺癌患者的预后标记物。

此实施例提供以下证据，即本发明的化合物对于对转移敏感的任何癌 症，或过表达CAIX的那些癌症具有治疗性，CAIX是在大的患者数据库 中显示为与患者存活降低相关的靶标。

表4：根据生物学亚型的CAIX表达

上表中，LumA是腔内A；LumB是腔内B；ER是雌激素受体；PR 是孕酮受体；EGFR是表皮生长因子受体；并且“+ve”是阳性的。

实施例3

转移性4T1肿瘤特征在于缺氧和CAIX表达

图2显示细胞培养物、具有生物发光标记的小鼠模型和三种肿瘤细胞 系的缺氧诱导的基因表达表。简言之，将稳定地表达荧光素酶的转移性 (4T1，66cl4)和非转移性(67NR)小鼠乳腺肿瘤细胞系接种到小鼠的乳腺脂 肪垫中。通过生物发光成像监测肿瘤形成和转移进展。通过激光显微切割 分离原发性肿瘤细胞并且在分离的肿瘤细胞上进行差异基因表达分析。(B) 对来自每个细胞模型的三只小鼠的肿瘤组织的缺氧诱导的基因表达进行 分析(高表达，暗色；低表达，亮色)。

非转移性67NR肿瘤表现出高的血管密度，在很大程度上不缺氧，并且 具有低的凋亡细胞数量。相反，来源于转移性细胞系，特别是4T1细胞系 的原发性肿瘤血管化较弱，并且具有大面积的缺氧和坏死，以及大量的凋 亡细胞(图2)。在这些肿瘤中鉴别的缺氧诱导的基因中，尤其是CAIX的表 达在两种转移性变体中升高(图2和2)。我们观察到定位于转移性肿瘤中的 质膜的高水平的CAIX蛋白，而在非转移性67NR肿瘤中没有CAIX表达。图 3中再现了显示原发性肿瘤中的CAIX过表达的蛋白质印迹。β-肌动蛋白用 作加样对照。

这些数据表明，缺氧诱导的CAIX表达对于增加原发性乳腺肿瘤的转 移潜力可能是关键的。

实施例4

关于缺氧下CAIX表达、pH调控和细胞生存的4T1模型的确认

对于这些实验，将4T1细胞在常氧或缺氧下培养48h并且利用 qRT-PCR和蛋白质印迹分析CAIX表达水平，其中β-肌动蛋白用作对照。 数据表示为平均值±s.e.m.n＝3，**P＜0.005，***P＜10^-3。在第二步中，将 表达非沉默shRNA(shNS)或靶向CAIX的shRNA(shCAIX)的4T1细胞温 育72h。分析表达shCAIX的两个独立克隆(C2，C5)。数据表示为平均值 ±s.e.m.n＝3。***P＜0.0005，相比于常氧下培养的细胞。通过稳定表达靶 向小鼠CAIX的构建体沉默4T1细胞中的CAIX基因表达，并在缺氧下培 养细胞以确定shRNA抑制缺氧诱导的CAIX表达的效力。

因此，转移性细胞系，特别是4T1细胞系，响应于缺氧而诱导CAIX 表达(图4A)。相反，在非转移性细胞系67NR中，缺氧培养不诱导CAIX 表达。表达非沉默对照shRNA(shNS)的4T1细胞在缺氧下显著地上调 CAIX的表达(图4B)，而缺氧诱导的CAIX表达在表达靶向CAIX的shRNA (shCAIX；图4B)的两个独立克隆(C2，C5)中显著减弱。

CAIX通过其对胞内和胞外pH的调节在功能上与肿瘤pH的控制相连。 缺氧诱导的胞外酸中毒(acidosis)是CAIX的生物活性的一个量度。相对于亲 本和表达shNS的4T1细胞，在表达shCAIX的4T1克隆中，缺氧下胞外培养 基的酸化被阻断，表明沉默CAIX基因表达诱导转移性4T1细胞中的pH调控 的功能抑制。

当在缺氧下培养时，相比于非沉默对照细胞，减少了CAIX的4T1细胞 显示增高的细胞死亡(图5)。这表明在缺氧环境中CAIX对于转移性乳腺癌 细胞的生存是重要的。

实施例5

体内证实

4T1小鼠乳腺肿瘤模型中CAIX的稳定减少抑制原发性肿瘤生长和转 移，如图6中所示。具体地，将使用4T1肿瘤模型的自发性转移的代表性 生物发光图像用来证实此发现。伪彩色热点图(亮色，最小强度；暗色，最 大强度；)重叠显示在鼠体图像上。对于这些研究，将表达shNS或shCAIX 的4T1细胞和亲本4T1细胞接种到BALB/c小鼠的乳腺中。检测动物的肿 瘤生长。对于每个组，n＝10。结果表示为平均值±s.em.*表示来自对照组 的原发性肿瘤切除完成。***P＜10^-11，利用两侧(two-sided)学生t-检验，相 比于shNS组。

结果显示，4T1细胞在30天内容易地形成稳定生长的肿瘤，而从CAIX 减少的细胞形成的肿瘤在初始肿瘤生长后显著地消退(图6A)。肿瘤的消退 看起来是稳定的，因为直到研究结束仅出现两只具有原发性肿瘤复发的小 鼠(图6B)。因此，CAIX表达的消除对小鼠的总体存活具有显著影响。具有 表达CAIX的肿瘤的动物由于进行的转移疾病而必须被牺牲，而接种CAIX 减少的4T1细胞的动物的生存率保持在100％。

CAIX表达在来源于CAIX减少的4T1细胞的肿瘤中被下调。在shCAIX 4T1肿瘤和对照肿瘤之间在CAXII的表达水平上没有差异，表明此模型中 的肿瘤生长抑制在CAXII存在下发生，并且CAIX是缺氧乳腺肿瘤的生存和 生长的关键酶。

实施例6

乳腺肿瘤模型

4T1小鼠乳腺肿瘤模型中CAIX的稳定减少抑制原发性肿瘤生长和转 移。在图6(A)中，利用重叠在灰度体部图像上的生物发光热点图可视化使 用4T1肿瘤模型的自发转移(较亮，最小强度；较暗，最大强度；)。(B) 将表达shNS或shCAIX的4T1细胞和亲本4T1细胞接种到BALB/c小鼠 的乳腺中。监测每组中的十只动物的肿瘤生长。箭头表示动物数量的变化， 并且指示修订值。结果表示为平均值±s.e.m.“*”表示来自对照组的原发性 肿瘤切除完成。***P＜10^-11，利用两侧学生t-检验，相比于shNS组。

相对于亲本和非沉默对照细胞，具有CAIX shRNA的人乳腺癌 MDA-MB-231细胞系中的CAIX减少显示这些细胞中缺氧诱导的CAIX表 达的显著抑制(图7)。此外，CAIX的减少显著减弱MDA-MB-231异种移植 物的肿瘤生长。

图7示出了人乳腺肿瘤模型中CAIX的稳定减少抑制原发性肿瘤生长 的证据。将表达shNS或shCAIX的MDA-MB-231细胞和亲本 MDA-MB-231细胞经皮下接种到NOD.CB17-prkdc^scid/J小鼠的侧腹中并且 监测动物的肿瘤生长(每组n＝7)。*P＜0.01，利用两侧学生t-检验，相比于 shNS对照肿瘤。在图7插图中，将表达靶向人CAIX的shRNAmir(shCAIX) 或非沉默对照序列(shNS)的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧下培养72h 并且分析缺氧诱导的CAIX表达。显示蛋白质印迹。β-肌动蛋白用作加样 对照。

实施例7

转移瘤模型

静脉内注射的细胞系4T1形成强肺转移瘤，并且由于转移进展，在注 射后3周内必须对受试小鼠进行安乐死，但是在接种有CAIX减少的细胞的 小鼠中没有观察到转移瘤(图8A)。CAIX减少的肿瘤细胞显示几乎没有至肺 部的可见转移并且保持完全健康(图8B)。不自发性转移的阴性对照67NR 细胞几乎没有显示注射三周后转移的证据，尽管所述细胞在注射后24小时 集中在肺中。

对来自注射了表达CAIX的细胞的动物的肺的检查显示大量的肺表面 结节，而来自注射了CAIX减少的细胞的小鼠的肺基本上正常(图8C)。 CAIX的稳定减少抑制肺转移瘤在4T1模型中形成。

膜定位的CAIX表达在来自对照动物的肺的组织切片中是明显的，但在 来自具有CAIX减少的细胞的小鼠的肺的组织切片中不明显(图8D)。

实施例8

MST-017(CAI17)的选择性

将细胞在10μM MST-017存在下培养72h。图9中显示在指定条件下 结合至细胞系的FITC标记抑制剂的代表性图像。(C)将细胞在有或没有 MST-017(对于4T1，66cl4和67NR细胞分别为400，600和400μM)的情 况下培养72h。n＝3。显示胞外pH的平均变化±s.e.m.。对于每个细胞系， 相对于在常氧下生长的平行培养物中测得的基线胞外pH评估缺氧下胞外 pH的变化。*P＜0.001，利用两侧学生t-检验，相比于在没有抑制剂的情况 下培养的细胞。

在表达CAIX的66cl4和4T1转移性细胞系中，胞外pH在缺氧下显 著降低，但在不表达CAIX的67NR培养物中保持不变。用MST-017处理 细胞反转在缺氧下在66cl4和4T1细胞系培养物中的胞外培养基的酸化 (图9C)。

实施例9

使用磺酰胺化合物MST-017的体内肿瘤抑制

用特定小分子抑制剂靶向CAIX活性减弱4T1原发性肿瘤的生长(图 10)。在图10(A)中，将4T1细胞在常氧或缺氧下培养并且通过蛋白质印迹 分析CAIX表达的水平。

正位地用4T1细胞接种动物。允许肿瘤形成14天。小鼠用指定剂量 的MST-017注射，3次/周，达2周。左图，通过基于卡尺的测量监测肿瘤 生长。治疗开始和终止通过箭头指出(图10B)。经载体治疗和未经治疗的 动物用作对照。*P＜0.02，**P＜0.01，使用2-侧学生t-检验，相比于载体对 照。

监测所治疗动物的重量作为总体抑制剂毒性的一个量度。在每剂 CAIX抑制剂之前对小鼠进行称重。在不同的治疗和对照组之间没有观察 到重量的显著差异(图10C)。

因此，相比于载体对照，利用MST-017治疗带有形成的4T1肿瘤的小 鼠显示所治疗小鼠中的肿瘤生长的显著抑制。抑制剂浓度和用药时间表被 很好地耐受，因为在所治疗的小鼠中没有观察到显著的重量减少。

相对于载体对照，利用同样浓度的MST-017治疗的带有形成的来源于 67NR的肿瘤的小鼠没有显示抑制剂的显著效果(图11)，并且没有观察到 显著的重量减少。

实施例10

利用新型磺酰胺MST-104和MST-119的体内转移抑制

新型CAIX抑制剂MST-119减少由4T1乳腺肿瘤细胞形成转移瘤。 CAIX抑制剂MST-119的化学结构显示在图12A中。在静脉内注射4T1 细胞以及用MST-119处理后形成的转移瘤的代表性生物发光图像在图12B 中显示。动物在接种细胞后治疗24小时。在6天内通过腹膜内注射给药 三剂并且在第三剂抑制剂后的24小时对小鼠进行成像。在由37.5％ PEG400、12.5％乙醇和50％盐水构成的载体中递送MST-119。来自肿瘤的 生物发光的定量显示在12C中。目标区域定位在转移灶周围，并且计算在 小鼠表面的总通量(光子/秒)。数据报告为平均值±s.e.m.N＝4/组。*P＜0.05。

新型CAIX抑制剂MST-104减少由4T1乳腺肿瘤细胞形成转移瘤(图 13)。将4T1细胞直接注射入BALB/c小鼠的尾静脉中。在细胞接种后24 小时开始用载体或MST-104进行共计5天的每日治疗并且在最后剂量后 24小时对小鼠进行成像。载体和抑制剂通过腹膜内注射给药。显示对照和 抑制剂治疗动物中的来自肿瘤细胞的生物发光的代表性图像。(B)该图显示 来自肿瘤的生物发光的量化。n＝6/组。*P＜0.01。生物发光信号的定量显 示在治疗的小鼠中的转移瘤形成的显著降低。这些数据进一步例证：响应 于使用新型磺酰胺的CAIX的靶向抑制的乳腺癌细胞形成肺转移瘤的抑 制。

实施例11

利用新型磺酰胺抑制人原发性乳腺肿瘤生长

新型CAIX抑制剂MST-104减少人原发性乳腺癌异种移植物的生长。 将转移性MDA-MB-231LM2-4^Luc+细胞正位植入到NOD/SCID小鼠中。当 肿瘤达到200mm³的平均值时，动物通过腹膜内给药每日接受指定剂量的 MST-104，并且使用卡尺测量定量肿瘤生长。指示抑制剂治疗的开始和终 止。n＝8/组。*P＜0.03，**P＜0.001。插图，显示在常氧(N)和缺氧(H)下培 养的LM2-4^Luc+细胞的CAIX表达的蛋白质印迹。

为了评价体内CAIX活性的药理学抑制的效果，我们用MST-104治 疗带有形成的MDA-231LM2-4肿瘤(Ebos等，2009)的小鼠。观察这些 细胞在缺氧下强烈诱导CAIX(图14，插图)。我们观察到：相比于载体 对照，用所述抑制剂治疗的小鼠中肿瘤生长的显著的、剂量依赖性抑制 (图14)。这些数据显示磺酰胺系CAIX抑制剂特异性地靶向表达CAIX 的人乳腺肿瘤的能力。

实施例12

新型磺酰胺抑制在3D Matrigel^TM培养物中生长的人乳腺癌细胞的缺氧诱 导的侵入和存活

在3D Matrigel^TM培养物中生长的MDA-MB-231LM2-4^Luc+细胞在缺氧 下是侵入性的(图15)。如方法中所描述的，在常氧和缺氧下将细胞在3D“在 上”Matrigel^TM测定中培养4天。显示了3D培养物的代表性相位对比图像。 缺氧诱导LM2-4变体的侵入，但是不诱导亲本MDA-231细胞的侵入。

使用CAIX的新型磺酰胺抑制剂的治疗减弱在3D Matrigel^TM培养物中 生长的人乳腺癌细胞的缺氧诱导的侵入(图16)。在抑制剂存在下在缺氧下 将细胞在3D“在上”Matrigel^TM测定中培养4天。DMSO-处理的细胞培养 物用作对照。指示了DMSO的百分比浓度和抑制剂的摩尔浓度。显示了 代表性相位对比图像。这些数据显示，磺酰胺抑制缺氧下转移性人乳腺癌 细胞的侵入。

CAIX的脲基磺酰胺抑制剂对于缺氧下人乳腺癌细胞的细胞死亡显示 不同效果(图17)。将细胞在3D“在上”Matrigel^TM测定中培养。细胞在缺氧 下在抑制剂存在下生长4天。DMSO处理的细胞培养物用作对照。 (A)TUNEL-阳性细胞的代表性图像(箭头)。(B)显示通过每种条件计数5个 随机视野定量TUNEL+ve细胞的图。数据表示为TUNEL-阳性细胞/20x 视野(FOV)的平均数。这些数据显示，CAIX的磺酰胺抑制剂可以诱导人 乳腺癌细胞在缺氧下的死亡。

实施例13

乳腺癌细胞中的CAIX表达的遗传减少减小缺氧下的癌干细胞群

在无血清条件下在混悬液中体外增殖为非粘附性肿瘤球是乳腺癌干细 胞的特性。乳腺癌干细胞群之前已被表征为显示CD44⁺CD24^-/low特征 (Al-Hajj等，(2003)Proc Natl Acad Sci USA100：3983-3988)；Ponti等，(2005) Cancer Res(癌症研究)65：5506-5511)。图18显示CAIX表达是缺氧下“肿 瘤球开始”群的生长和肿瘤球形成效率所需的。(A)将4T1shNS和shCAIX 细胞以加倍稀释接种并在常氧或缺氧下在肿瘤球形成条件下培养。评估开 始肿瘤球生长所需的细胞数。显示了三个独立实验的平均值±SEM。 *P＜0.03，**P＜0.006。(B)将4T1shNS和shCAIX细胞在常氧或缺氧下培 养为肿瘤球，解聚并通过FACS分析评估CD44+CD24-/low群。显示的数 据是来自3个独立实验的％CD44+CD24-/low细胞的平均变化±SEM。 *P＜0.004，**P＜0.025。

在常氧下在4T1shNS和shCAIX之间没有观察到形成肿瘤球所需的细 胞数量的显著差异，因为在常氧水平在任一细胞系中CIAX都没有被诱导 (图18A)。相比于常氧对照。形成肿瘤球所需的4T1-shNS细胞的数量在缺 氧下显著减少，表明癌干细胞(CSC)的百分比在缺氧培养物中显著更高(图 18A)。重要地，RNAi-介导的CIAX表达的敲落显著增加在缺氧下形成肿 瘤球所需的接种细胞的数量，表明CAIX表达是在缺氧下利用shNS-4T1 对照细胞观察到的CSC-样扩增所需的。

在图18B中，4T1shNS和shCAIX细胞在常氧或缺氧下在肿瘤球形成 条件下进行培养，并通过FACS分析以定量标记为CD44⁺CD24^-/low的推定 的CSC-样群体。在shNS对照中，相比于常氧对照，CD44⁺CD24^-/low群在 缺氧培养条件下显著增加(图18B)。然而，在缺氧下RNAi-介导的CAIX 的敲落显著减少此群，表明缺氧下CD44⁺CD24^-/low CSC-样扩增需要CAIX (图18B)。

实施例14

在体内MST-104可以减少人乳腺正位肿瘤中的癌干细胞群

图19显示利用CAIX抑制剂MST-104对人原发性乳腺癌异种移植物 的治疗在体内靶向癌干细胞群。将MDA-MB-231LM2-4^luc+正位植入 NOD/SCID小鼠中。当肿瘤达到200mm²的平均值时，动物通过腹膜内给 药每日接受载体或38mg/kg MST-104。(A)取出原发性肿瘤，分解并且通过 FACS分析评估ESA+细胞群。示出了显示ESA+细胞的百分比的代表性 FACS图。(B)示出的数据是来自3只小鼠的ESA+细胞的平均变化±SEM。 **P＜0.0224。

载体治疗的肿瘤包含平均10％ESA+细胞群。比较地，相比于载体治 疗的对照肿瘤，用磺酰胺CAIX抑制剂MST-104治疗的肿瘤还显示显著降 低的ESA+细胞群。这些数据显示磺酰胺在体内可以减少人乳腺癌干细胞 群。

尽管已经描述和举例说明了本发明的具体实施方案，但是这样的实施 方案应当被认为仅是对本发明的举例说明，而不限制根据所附权利要求解 释的本发明。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种药物组合物，所述组合物包含药用赋形剂和式(I)的化合物：

R-Q-Ar-SO₂NH₂

其中R是芳基、杂芳基、烷基或环烷基；

Q是-L(CH₂)_n-，其中n＝0、1或2，并且L是-NHCXNH-、-NHC(S)SNH-、 -NHCONHCSNH-或-SO₂NH-，

其中X是O或S；并且Ar是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的 C₆-C₁₀芳族基团或杂芳族基团；

条件是所述式(I)的化合物不是4-[(苯胺基羰基)氨基]苯磺酰胺 (MST-101)；4-{[(五氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-107)；4-{[(4’- 乙酰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-109)；4-{[(4’-氯苯基)氨基甲 酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-124)；或4-{[([4’-(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨 基]}苯磺酰胺(MST-126)。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中Q是-NHCONH-，Ar是苯基， 并且R是下列各项中的一个：PhCH₂、Ph₂CH、4-FC₆H₄、4-ClC₆H₅、4-ClC₆H₄、 4-BrC₆H₄、C₆F₅、2-MeOC₆H₄、4-AcC₆H₄、2-i-PrC₆H₄、4-i-PrC₆H₄、4-n-BuC₆H₄、 4-n-BuOC₆H₄、4-正辛基-C₆H₄、4-NCC₆H₄、2-NCC₆H₄、4-PhOC₆H₄、 2-PhC₆H₄、3-O₂NC₆H₄、4-MeO-2-MeC₆H₃、环戊基、茚满-5-基、3，5-Me₂C₆H₃、 4-CF₃C₆H₄或3，5-(CF₃)₂C₆H₃。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述式(I)的化合物是：

4-{[(苄氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-102)；

4-{[(二苯甲氨基)羰基]氨基}苯磺酰胺(MST-103)；

4-{[(4’-氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-104)；

4-{[(4′-溴苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-105)；

4-{[(2’-甲氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-108)；

4-{[(2’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-110)；

4-{[(4’-异丙基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-111)；

4-{[(4’-正丁基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-112)；

4-{[(4’-丁氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-113)；

4-{[(4’-正辛基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-114)；

4-{[(4’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-115)；

4-{[(2’-氰基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-116)；

4-{[(4’-苯氧基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-117)；

4-{[(联苯-2’-基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-118)；

4-{[(3’-硝基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-119)；

4-{[(4’-甲氧基-2’-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-120)；

4-[(环戊基氨基甲酰基)氨基]苯磺酰胺(MST-122)；

4-{([(3’，5’-二甲基苯基)氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-123)；

4-{[(2’，3’-二氢-1H-茚-5’-基氨基]羰基氨基)}苯磺酰胺(MST-125)；

4-{[([3’，5’-双(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺(MST-127)；

3-(3-(4’-碘苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-128)；

3-(3-(4’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-129)；

3-(3-(3’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-130)；

3-(3-(4’-乙酰基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-131)；

3-(3-(2’-异丙基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-132)；

3-(3-(全氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-133)；

4-(3-(4’-氯-2-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-134)；

4-(3-(4’-溴-2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-135)；

4-(3-(2’-氟-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-136)；

4-(3-(2’，4’，5’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-137)；

4-(3-(2’-氟-5’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-138)；

4-(3-(2’-氟-3’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-139)；

4-(3-(2’，3’，4’-三氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-140)；

4-(3-(2’-氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-141)；

4-(3-(2’，4’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-142)；

4-(3-(3’-氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-143)；

4-(3-(2’，5’-二氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-144)；

4-(3-(2’-氯-5’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-145)；

4-(3-(2’-氯-4’-(三氟甲基)苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-146)；

4-(3-(2’，6’-二氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-147)；或

4-(3-(全氯苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-148)。

4.根据权利要求3的药物组合物，其中所述组合物是4-{[(3’-硝基苯 基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-119)。

5.根据权利要求3的药物组合物，其中所述组合物是4-{[(4’-氟苯基) 氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-104)。

6.(删除)

7.根据权利要求3的药物组合物，其中所述组合物是3-(3-(3’-硝基苯 基)脲基)苯磺酰胺(MST-130)。

8.根据权利要求1-7中任一项的组合物，其中，在体外，相比于它抑 制CAI和CAII的活性，所述组合物以更大的程度抑制肿瘤相关CAIX的 活性。

9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中，在体外，相比于它抑 制CAI和CAII的活性，所述组合物以更大的程度抑制肿瘤相关CAIXII 的活性。

10.一种抑制哺乳动物的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述哺乳 动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

11.一种抑制哺乳动物的肿瘤转移的方法，所述方法包括向所述哺乳 动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

12.一种减少哺乳动物的乳腺癌细胞数量或质量的方法，所述方法包 括向所述哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

13.一种减少需要其的哺乳动物的哺乳动物癌干细胞群中的癌干细胞 的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的 药物组合物。

14.一种诱导需要其的哺乳动物的缺氧癌细胞的细胞死亡的方法，所 述方法包括向所述哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合 物。

15.根据权利要求10-14中任一项的方法，其中所述哺乳动物还用另外 的抗癌剂进行治疗。

16.根据权利要求11的方法，所述方法还包括给药一种或多种另外的 抗癌剂。

17.根据权利要求12的方法，所述方法还包括给药一种或多种另外的 抗癌剂。

18.根据权利要求13的方法，所述方法还包括给药一种或多种抗癌 剂。

19.根据权利要求14的方法，所述方法还包括给药一种或多种抗癌 剂。

20.根据权利要求10-11中任一项的方法，其中所述肿瘤过表达CAIX。

21.根据权利要求10-11中任一项的方法，其中所述肿瘤过表达CAXII。

22.根据权利要求10-11中任一项的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌。

23.根据权利要求12-14中任一项的方法，其中所述癌症起源于所述哺 乳动物的乳腺组织。

24.一种治疗乳腺癌以防止或减少转移的方法，所述方法包括向具有 乳腺癌的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

25.一种治疗肺癌以防止或减少转移的方法，所述方法包括向具有肺 癌的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

26.一种治疗胰腺癌以防止或减少转移的方法，所述方法包括向具有 胰腺癌的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

27.一种治疗肾癌以防止或减少转移的方法，所述方法包括向具有肾 癌的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

28.一种治疗卵巢癌、前列腺癌或宫颈癌以防止或减少转移的方法， 所述方法包括向具有卵巢癌、前列腺癌或宫颈癌的哺乳动物给药根据权利 要求1-7中任一项的药物组合物。

29.一种治疗成胶质细胞瘤以防止或减少转移的方法，所述方法包括 向具有成胶质细胞瘤的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组 合物。

30.一种治疗结直肠癌以防止或减少转移的方法，所述方法包括向具 有结直肠癌的哺乳动物给药根据权利要求1-7中任一项的药物组合物。

31.根据权利要求1-7中任一项的组合物用于治疗哺乳动物的肿瘤和 转移的用途。

32.根据权利要求10-30中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

33.一种式(I)R-Q-Ar-SO₂NH₂的化合物，其中R是芳基、杂芳基、烷 基或环烷基；Q是-L(CH₂)_n-，其中n＝0，1或2，并且L是-NHCXNH-， -NHC(S)SNH-，-NHCONHCSNH-或-SO₂NH-，其中X是O或S；并且Ar 是含有氧、氮或硫中的至少一个杂原子的C₆-C₁₀芳族基团或杂芳族基团， 条件是所述化合物不是4-[(苯胺基羰基)氨基]苯磺酰胺(MST-101)；4-{[(五 氟苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-107)；4-{[(4’-乙酰基苯基)氨基甲 酰基]氨基}苯磺酰胺(MST-109)；4-{[(4’-氯苯基)氨基甲酰基]氨基}苯磺酰 胺(MST-124)；4-{[([4’-(三氟甲基)苯基]氨基羰基)氨基]}苯磺酰胺 (MST-126)；3-(3-(4’-碘苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-128)；3-(3-(4’-氟苯基)脲 基)苯磺酰胺(MST-129)；3-(3-(3’-硝基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-130)； 3-(3-(4’-乙酰基苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-131)；3-(3-(2’-异丙基苯基)脲基) 苯磺酰胺(MST-132)；或3-(3-(全氟苯基)脲基)苯磺酰胺(MST-133)。

34.根据权利要求33的化合物，其中Q是-NHCONH-，Ar是苯基， 并且R是PhCH₂、Ph₂CH、4-FC₆H₄、4-ClC₆H₄、4-BrC₆H₄、C₆F₅、2-MeOC₆H₄、 4-AcC₆H₄、2-i-PrC₆H₄、4-i-PrC₆H₄、4-n-BuC₆H₄、4-n-BuOC₆H₄、4-正辛基 -C₆H₄、4-NCC₆H₄、2-NCC₆H₄、4-PhOC₆H₄、2-PhC₆H₄、3-O₂NC₆H₄、 4-MeO-2-MeC₆H₃、环戊基、茚满-5-基、3，5-Me₂C₆H₃、4-CF₃C₆H₄或 3，5-(CF₃)₂C₆H₃。