一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法

摘要

本发明涉及一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，属于生物技术(发酵工程)领域。本发明向含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中加入外源促进剂，其中外源促进剂为甘草总提取物、或甘草总多糖和/或甘草总黄酮，促进菌株产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3（保藏号:CGMCC No.5446）诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，对比不加促进剂产酶提前5～48小时，酶活提高了10～200%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法,属于生物技术(发酵工程)领域。 

背景技术

β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase，EC：3.2.1.31，简称GUS）是一种糖苷类水解酶，同时也是典型的糖基化酶，能催化各种类型的β-葡萄糖醛酸苷水解，早在50年代国外就有学者对来源于大肠杆菌和动物体的酶做了研究，之后各国学者在葡萄球菌、乳酸菌、青霉菌、曲霉菌、酵母菌等真菌，以及黄芪、拟南芥、烟草、水稻、玉米等高等植物中检测出该酶的活性。 

大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶的单体分子量为68.2kDa，常以同聚四价体形式存在。它十分稳定，在环境条件变化较大的情况下仍然具有活性，如在巯醇类还原剂β-巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)存在时表现出极高的活性。β-葡萄糖醛酸苷酶不需要辅酶因子和阳离子。一些二价重金属离子如Cu²⁺、Zn²⁺抑制其活性，但在少量的螯合剂EDTA(乙二胺四乙酸)存在的条件下维持其活性。大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶的适宜pH值为5.2～8.0，pH值4.3和pH值8.5时其活性丧失50％。其抗热半衰期为50℃下2小时。 

哺乳动物中的β-葡萄糖醛酸苷酶是一种内源酶，主要存在于内脏器官细胞的溶酶体中，是定位于溶酶体的酸性水解酶，是一个糖蛋白。该酶由四个相同亚基对称排布组成，单亚基由TIM桶状结构域、糖基结合域以及免疫球蛋白恒定域组成。该酶的催化位点位于TIM桶状结构域上的451位和540位的二个谷氨酸残基，单亚基有651个氨基酸残基，蛋白分子量为280kDa。其基因简称为gusB，长为1982bp，每个亚基含糖醛酸残基，其糖链部分是由1个N-乙酰基-D-葡萄糖胺和7个a-D-甘露糖组成。不同组织部位的β-葡萄糖醛酸苷酶理化及生物特性相似，pH值为3.6-5.8时具有最大催化活性。 

β-葡萄糖醛酸苷酶在很多领域具有应用，在医学领域，β-葡萄糖醛酸苷酶作为一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶。β-葡萄糖醛酸苷酶是一种酸性溶酶体酶，可水解基底膜中的主要成分——蛋白多糖，因而参与肿瘤的侵袭 和转移。由于大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸苷酶，而该酶可水解底物生成有色或荧光物质，利用这一特性可快速检测食品和引用水中大肠杆菌。同时，该酶还应用于人体内药物分析，特别是兴奋剂的检测。β-葡萄糖醛酸苷酶作为体内一种特异性的水解酶，检测其在体内特定部位的水平高低可应用于肿瘤的诊断。由于β-葡萄糖醛酸苷酶存在于人体细胞溶酶体和微粒体中，可大大降低一般人源性水解酶易于引发的前体药在体内非靶位被激活的可能，减少了毒副作用，因此β-葡萄糖醛酸苷酶较多的应用在前体药酶导向治疗的研究中。 

近年来，部分国内及日韩学者对β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)进行了研究。GAMG甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的近1000倍，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂。GAMG极性介于GL和甘草次酸（GA）之间为中等极性，在体内同时具有良好的溶解度和跨膜转运的能力，比GL和GA具有更好的生物利用度。动物实验表明GAMG的LD50为5000mg/kg，远远大于甘草酸的LD50805mg/kg，说明GAMG比GL更安全。由于GAMG优点突出，目前已被列为精细化工产品中，因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。 

目前已发现的能够转化甘草酸为GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶存在于肠道细菌、动物组织和土壤中，但是来源于肠道细菌和动物组织的酶普遍存在化学键选择性偏低的缺点，不仅产生GAMG，还产生大量的副产物甘草次酸（GA），见图1。来源于动物组织的酶成本高，制备较麻烦。发明人所在的李春教授课题组从新疆主要甘草产区中的土样中分离筛选出来的菌株——产紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3，其诱导产生的β-葡萄糖醛酸苷酶能将商品甘草酸单铵盐水解生成GAMG，定向性好，甘草酸转化率可达88.45%(冯世江、李春等,高校化学工程学报,2007,21：977-982)。利用该菌定向生物合成GAMG的方法已申请了国家专利（CN101603067），菌种Penicillium purpurogenumLi-3已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号：CGMCC No5446，保藏日期2011年11月04日。根据Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生的β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列的同源保守区设计简并引物，PCR扩增克隆得到β-葡萄糖醛酸苷酶编码基因pgus(GenBank登录号：EU095019)，该基因全长1815bp，编码604个氨基酸,理论单亚基分子量为67.77X10³，含有4个潜在的N-糖基化位点。 

但是，目前来源于肠道细菌、动物组织和一些真菌中产生的β-葡萄糖醛酸苷 酶，普遍存在酶表达量不高，诱导产酶缓慢，酶活偏低等问题，不适合生物转化甘草酸产GAMG的高效体系的构建。本发明应用课题组前期自行筛选的高度定向催化甘草酸水解生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌种产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3，以甘草酸或甘草酸盐为碳源培养基，添加外源促进剂（甘草总提取物、或甘草总黄酮、或甘草总多糖），促进Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，由于添加了外源促进剂，使产酶提前了5-48小时，酶活提高了10-200%。在很大程度上解决了酶活偏低的问题。 

发明内容

本发明提供一种以甘草酸或甘草酸盐为碳源，添加外源促进剂（甘草总提取物、或甘草总多糖、或甘草总黄酮），诱导菌株Penicillium purpurogenum Li-3产生β-葡萄糖醛酸苷酶，获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂。本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤： 

步骤1、先将菌株Penicillium purpurogenum Li-3接入到斜面培养基上，经培养后得斜面种子，其中Penicillium purpurogenum Li-3的保藏号为CGMCCNo.5446。 

步骤2、将步骤1所得的斜面种子接入种子培养基中，经培养后得到种子液； 

步骤3、将步骤2所得的种子液接入到含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中，其中产酶培养基中含有外源促进剂，促进Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中外源促进剂为甘草总提取物、甘草总黄酮和/或总甘草多糖； 

经过发明人的多次试验研究（见实施例2、3、4、6）发现，甘草总提物、或甘草总黄酮、或甘草总多糖对于Penicillium purpurogenum Li-3产酶具有出乎意料的促进作用，不仅能够使产酶提前5～24小时，而且酶活提高10～200%。经过发明人进一步研究发现，对酶活起很大促进作用的是甘草中的总黄酮和/或总多糖，尽管甘草酸在甘草总三萜中含量达到10-30%，但甘草总三萜对于Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活无明显促进作用（见实施例5）。目前发明人对甘草总提物刺激产紫青霉Li-3的产酶机理尚不清楚，但可以肯定的是，一定是甘草总提物中的除甘草酸及其无机盐之外的某些(或某种)多糖类和/或某些（或某种）黄酮类成分，更加有利于刺激 Penicillium purpurogenum Li-3的产酶； 

步骤4、从步骤3中获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：所述步骤1中的能诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的微生物，优选Penicillium purpurogenum Li-3； 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤1中的斜面培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，琼脂0.01～30，控制pH2.0～10.0、温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤1斜面种子为在恒温培养箱中培养1～5天，温度20～50℃。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中的种子培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中种子液为在摇瓶或发酵罐中培养，摇床转速100～400r/min，温度15～50℃，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，通气比为0.1～10vvm，发酵温度15～65℃，溶氧为10～100％，pH为2.0～10.0，发酵时间12～120小时。再将活化的种子培养液按照1～30%（v/v）的接种量，接入种子培养基中进行二次活化，培养时间12～48h。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中产酶培养基的碳源为甘草酸（或甘草酸盐），加入一定量的外源促进剂(甘草总提取物、或甘草总多糖、或甘草总黄酮)，产酶培养基浓度（g/L）为：甘草酸或其盐0.1～20，外源促进剂0.1～20，其它培养基为NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中产酶培养为在摇瓶或发酵罐中培养，将二级种子液按照体积比1～30％的接种量接入到产酶培养基中，摇床培养过程中控制转速为100～400r/min，温度15～65℃， 培养时间12～120h，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，通气比为0.1～10vvm，发酵温度15～65℃，溶氧为10～100％，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中外源促进剂甘草总提取物制备方法为：将含有甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的甘草属植物，包括根、根茎、茎、花和/或果实，采用温浸、渗漉、煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种提取；所用溶剂为以下溶剂中的任一种：A.水、B.甲醇与水的混合液、C.乙醇与水的混合液、D.丙酮与水的混合液、E.碱性水混合液、F.碱性甲醇混合液、G.碱性乙醇混合液；优选料液比w/v（g/ml）为1:5～1:15；优选提取次数1～3次；优选提取时间每次0.5～1.5小时；优选多次提取时将提取液合并；若为购买的甘草提取物，此步骤可省略。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：外源促进剂甘草总黄酮和甘草总多糖以及转化底物甘草总三萜的制备方法为：将甘草总提取物浓缩液，或经干燥后制得甘草总提取物粉末加水溶解后，加有机试剂，优选正丁醇、乙酸乙酯，再用酸碱调节体系pH5-8，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总黄酮类成分，分出有机相，干燥后得甘草总黄酮粗品，水相为含甘草总三萜和甘草总多糖类成分，分出水相，加有机试剂，调节体系pH2.5-4.5，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总三萜类成分，水相为含有甘草总多糖类成分，分出有机相，干燥后得甘草总三萜粗品，由于水相中含有的成分较杂，先将水相所含蛋白质除掉，优选的方法是用sevag法除蛋白质，再通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60～80%沉淀得甘草多糖，干燥后得甘草总多糖粗品。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于：步骤4中转化终点的发酵液为含有已经产β-葡萄糖醛酸苷酶的菌体发酵液，将含有β-葡萄糖醛酸苷酶的菌体及其发酵液制备成β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂,包括以下一种或几种：(a)含有已经产酶菌体的发酵液、（b）已经产酶的菌体发酵液离心后获得的全细胞菌体、（c）已经产酶的全细胞菌体破碎细胞后制得的粗酶液、（d）已经产酶的全细胞菌体冷冻干燥后制得的菌体冻干粉、（e）含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的组分。 

所述制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法，其特征在于全细胞β-葡萄糖醛酸苷酶酶活力定义为：在pH5.0，30℃条件下，每小时生成1μmol的GAMG所需要的酶量（全细胞菌体质量）为一个酶活力单位U；比酶活定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位称为比酶活，单位U/mg。 

有益效果 

本发明应用能够高度定向转化生成GAMG的产紫青霉Li-3，以甘草酸（或其盐）为碳源，并加入一定量的促进剂，促进产紫青霉Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，不仅使酶活增强了10～200%，而且产酶提前了5～48小时（见实施例2、实施例3、实施例4、实施例6）。 

附图说明

图1.β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸反应原理 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。 

实施例1，仅以甘草酸单铵盐为诱导剂产酶实施方法: 

将产紫青霉Li-3菌种接入斜面培养基上，于30℃恒温培养3天，斜面培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，琼脂1.5g，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

取斜面培养基上的孢子，接种至种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养72h，然后以5%的接种量转入二级种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养24h，得到二级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养84小时发酵液达最大比酶活94.9U/mg。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例2，甘草酸单铵盐添加外源促进剂产酶实施方法： 

斜面培养和种子培养同实施例1。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养72小时发酵液达最大比酶活157U/mg，将产酶终点的发酵液作为粗酶制剂。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，甘草总提取物0.4g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例3： 

斜面培养、种子培养、产酶培养同实施例1。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养60小时达最大比酶活135U/mg，发酵液离心收集菌体,菌体冷冻干燥研碎后制得粗酶冻干粉47.8mg作为粗酶制剂。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，甘草总多糖0.25g,NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例4 

斜面培养、种子培养同实施例1。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养60h达最大比酶活137U/mg，菌体用pH4.5的醋酸缓冲液清洗3次，制备全细胞菌体2.5g。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，甘草总黄酮0.11g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例5 

斜面培养、种子培养同实施例1。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入到产酶培养基中，30℃，170r/min摇床培养84h达最大比酶活99.7U/mg，菌体用pH4.5的醋酸缓冲液清洗3次，制备全细胞菌体1.3g。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐0.6g，甘草总三萜0.10g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例6 

将产紫青霉Li-3菌种接入斜面培养基上，于30℃恒温培养3天，斜面培养基的组成为：葡萄糖0.5g，NH₄NO₃0.3g，KH₂PO₄0.1g，KCl0.05g，MgSO₄·7H₂O0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，蒸馏水100mL，琼脂1.5g，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

取斜面培养基上的孢子，接种至种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养72h，然后以5%的接种量转入二级种子培养基中，30℃，170r/min摇床培养24h，得到二级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖1.5g，NH₄NO₃0.9g，KH₂PO₄0.3g，KCl0.15g，MgSO₄·7H₂O0.15g，FeSO₄·7H₂O0.003g，蒸馏水300mL，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

将二级种子液按照体积比10％的接种量接入发酵罐中内含2.5L到产酶培养基中，发酵过程中控制转速为100rpm，通气比为1,0vvm，温度30℃，pH5.0，培养36h达最大比酶活220U/mg，获得产酶发酵液为粗酶制剂。产酶培养基的组成：甘草酸单铵盐16.3g，甘草总提取物10.8g，NH₄NO₃7.5g，KH₂PO₄2.5g，KCl1.25g，MgSO₄·7H₂O1.25g，FeSO₄·7H₂O0.025g，蒸馏水2.5L，调节pH5.0，在121℃灭菌20min后，冷却至室温。 

实施例补充说明 

向甘草酸单铵盐的产酶培养基中加入外源促进剂能够促进产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，对比仅以甘草酸单铵盐诱导产酶的酶活有很大提高，产酶时间大幅度地提前，其中促进剂甘草总黄酮和甘草总多糖能够使产酶达到最大比酶活提前24小时，比酶活分别增加了42.25%、39.09%(（见实施例3、实施例4）。添加促进剂甘草总提取物产酶达到最大比酶活提前12小时，比酶活提高了65.44%（见实施例2）。添加促进剂甘草总提取物并用发酵罐培养，不仅比酶活提高了131.82%，而且达到最大比酶活提前48小时。尽管甘草酸在甘草总三萜中含量达到10-30%，但甘草总三萜对于Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活无明显促进作用（见实施例5）。目前发明人对外源促进剂刺激产紫青霉Li-3的产酶机理尚不清楚，但可以肯定的是，一定是甘草总提物中的某些除甘草酸及其无机盐之外的黄酮类和多糖类成分，更加有利于刺激产紫青霉Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶。