针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体

摘要

本发明公开了一种针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明提供的制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤：（1）选取母鸡；（2）用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒三联灭活苗免疫步骤（1）得到的母鸡；（3）取母鸡生产的鸡蛋并分离得到蛋黄液；（4）从步骤（3）得到的蛋黄液中分离纯化卵黄抗体。本发明对于鸡新城疫病、禽流感病和鸡传染性支气管炎的治疗和预防具有重大价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

鸡新城疫病是鸡新城疫病毒引起的高度接触性传染病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血，死亡率高，对养鸡业为害严重。 

禽流感是一种由禽流感病毒引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。禽流感的常见症状：病鸡精神沉郁，饲料消耗量减少，消瘦；母鸡的就巢性增强，产蛋量下降；轻度直至严重的呼吸道症状，包括咳嗽、打喷嚏和大量流泪；头部和脸部水肿，神经紊乱和腹泻。 

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病，其临诊特征是呼吸困难、发出罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏。传染性支气管炎病毒主要通过空气传播，也可以通过饲料、饮水、垫料等传播。 

长期以来，禽类饲养场中的发病禽类以上述三种病毒共感染或继发感染居多。目前针对上述疾病的防治主要依赖于疫苗和抗生素。抗生素在动物体内会导致药物残留和产生抗药性。现有疫苗的有效成分为灭活病毒，禽类饲养场通常在鸡1-2周龄时免疫，在动物体内产生抗体并发挥作用需要14天左右的时间，所以在鸡1周龄至4周龄时期内，较容易出现上述一种或几种疾病的爆发。 

发明内容

本发明的目的是提供一种针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法和应用。 

本发明提供的制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤： 

（1）按如下原则选取母鸡：未经人工免疫；已开产且产蛋正常；经检测为新城疫病毒阴性、禽流感病毒阴性且鸡传染性支气管炎病毒阴性； 

（2）用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒三联灭活苗免疫步骤（1）得到的母鸡； 

（3）完成步骤（2）后，取母鸡生产的鸡蛋并分离得到蛋黄液； 

（4）取步骤（3）得到的蛋黄液，与等体积蒸馏水混匀，650rpm振荡10min，然后在密封状态下65℃静置10分钟，冷却至10℃后与蒸馏水以1:4的体积比混合，调pH至 5.2，4℃静置6小时，然后5000rpm离心20分钟，取上清液； 

（5）将等体积饱和硫酸铵水溶液加入步骤（4）得到的上清液中，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀； 

（6）用3质量份蒸馏水溶解1质量份步骤（5）得到的沉淀，然后加入正辛酸使其在体系中的体积比为1‰，混匀； 

（7）将1体积份饱和硫酸铵水溶液与2体积份步骤（6）得到溶液混匀，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀； 

（8）用3质量份无菌、pH7.2、0.01M的PBS缓冲液溶解1质量份步骤（7）得到的沉淀； 

（9）将步骤（8）得到的溶液用100Ku超滤膜包进行除盐浓缩，得到浓缩液； 

（10）将1体积份40%甲醛水溶液加入399体积份步骤（9）得到的浓缩液中，然后在密封状态下室温静置2小时，然后依次用0.45微米、0.22微米和0.1微米的微孔滤膜逐级过滤，得到滤液，即为卵黄抗体。 

所述步骤（1）中的母鸡可在雏鸡时免疫鸡干扰素α。所述鸡干扰素α具体如序列表的序列1所示。所述雏鸡时具体可为7日龄时的鸡。所述鸡干扰素α的免疫剂量为每只鸡15U。 

所述步骤（2）中，所述免疫包括如下步骤： 

基础免疫：每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

加强免疫：基础免疫l0天后，每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

强化免疫：加强免疫l0天后，每只鸡免疫20个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

维持免疫：强化免疫10天后，每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗。 

所述步骤（2）中，所述鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒三联灭活苗具体可为鸡新城疫病毒（La Sota株）、传染性支气管炎病毒（M41株）、禽流感病毒（H9亚型，HL株）三联灭活苗，更具体可为如下疫苗：洛阳普莱柯生物工程有限公司产品，兽药生字（2006）160022124。 

所述步骤（3）中还包括如下步骤：选取对鸡新城疫病毒（具体可为鸡新城疫活疫苗La Sota株）、传染性支气管炎病毒（具体可为鸡传染性支气管炎M41毒株）、禽流感病毒（具体可为H9N2亚型禽流感病毒YB株）的HI效价均大于1024的蛋黄液进行所述步骤（4）。 

所述步骤（10）中，所述卵黄抗体对鸡新城疫病毒（具体可为鸡新城疫活疫苗LaSota株）、传染性支气管炎病毒（具体可为鸡传染性支气管炎M41毒株）、禽流感病毒的HI效价均大于128。 

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的卵黄抗体。 

本发明还保护所述卵黄抗体在制备预防和/或治疗鸡新城疫病、禽流感和鸡传染性支气管炎的三联疫苗中的应用。 

本发明还保护一种预防和/或治疗鸡新城疫病、禽流感和鸡传染性支气管炎的三联疫苗，含有所述卵黄抗体。 

20日龄以内的雏鸡的免疫系统还未发育完全，5-28日龄阶段内，雏鸡的母源抗体水平降低，自身抗体尚未大量生成。采用本发明提供的卵黄抗体免疫，可以保护雏鸡不受新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎等病毒的侵袭，并对已被上述病毒侵袭的雏鸡具有治疗作用。 

母鸡受免疫原刺激后产生免疫反应，在输卵管内卵黄成熟期，血液中的IgG可被选择性地转移到卵黄中，并成为卵黄中唯一的免疫球蛋白类，这种由血液转移入卵黄液的IgG类抗体即为卵黄抗体。卵黄抗体对病原微生物有特异性的结合和灭活作用，从而可以治疗和/或预防疾病。 

本发明提供了针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法，对于鸡新城疫病、禽流感病和鸡传染性支气管炎的治疗和预防具有重大价值。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，各个物质的水溶液均采用蒸馏水。 

实施例中所用的三联灭活苗即为鸡新城疫病毒（La Sota株）、传染性支气管炎病毒（M41株）、禽流感病毒（H9亚型，HL株）三联灭活苗，洛阳普莱柯生物工程有限公司产品，兽药生字（2006）160022124。鸡新城疫活疫苗（La Sota株）购自中国兽医药品监察所。H9N2亚型禽流感病毒YB株：魏金凤李玉玲庄金山邓均华白朝勇，一株H9N2亚型禽流感病毒（YB株）的分离鉴定，《兽医导刊》2012年第7期，69-71页。鸡传染性支气管炎M41毒株：赵宝华马同锁杨虹，鸡传染性支气管炎M41毒株S1基因的克隆与真核表达研究，动物医学进展，2005,26（1），71-75。 

实施例1、蛋黄液的制备 

鸡干扰素α（鸡基因工程干扰素）：购自北京卡瑞诺生物技术有限公司；为序列表的序列1所示的蛋白质；每个包装为6ml（含30000U鸡干扰素α），使用前用生理盐水稀释至200ml，每只鸡注射0.1ml。 

一、制备蛋黄液 

1、取7日龄的母鸡，颈部皮下注射鸡干扰素α，每只鸡15U。 

2、从步骤1的母鸡中按照如下原则选取：未经人工免疫；已开产且产蛋正常；经检测为新城疫病毒阴性、禽流感病毒阴性且鸡传染性支气管炎病毒阴性。 

3、将步骤2选取的母鸡进行如下免疫： 

基础免疫：颈部皮下注射三联灭活苗，每只鸡l0个免疫剂量（10羽份）； 

加强免疫：基础免疫l0天后，颈部皮下注射三联灭活苗，每只鸡l0个免疫剂量（10羽份）； 

强化免疫：加强免疫l0天后，颈部皮下注射三联灭活苗，每只鸡20个免疫剂量（20羽份）； 

维持免疫：强化免疫10天后，颈部皮下三联灭活苗，每只鸡10个免疫剂量（10羽份）。 

4、完成步骤3后，每天收集母鸡的鸡蛋，4℃保存。 

5、取步骤4的鸡蛋，用清水擦拭以清除蛋壳上的污物，然后用0.1%新洁尔灭溶液浸泡消毒，取出晾干后在无菌条件下分离蛋清和蛋黄，用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄表面（尽量去除蛋清），用针头刺破蛋黄膜，收集蛋黄液。 

二、制备蛋黄液 

没有注射鸡干扰素α的步骤，其它同步骤一。 

三、蛋黄液的效价测定 

分别检测步骤一得到的蛋黄液或步骤二得到的蛋黄液对H9N2亚型禽流感病毒YB株、鸡新城疫活疫苗（La Sota株）和鸡传染性支气管炎M41毒株的HI效价。 

1、1％鸡红细胞悬液的配制 

采取2-6月龄鸡的血液与等量阿氏液混合，然后用生理盐水洗涤3-4次（每次1500r/min离心5-10分钟），将沉淀的红细胞用生理盐水配制成1％鸡红细胞悬液（即1μl红细胞沉淀加99μl生理盐水）。 

2、病毒的效价测定（HA试验) 

在96孔微量反应板上进行，每孔加25μL生理盐水；左侧第1孔加25μL病毒液，混合均匀后从第1孔吸25μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔（第11孔吸弃25μL）；每孔加入25μl生理盐水和25μl1％鸡红细胞悬液，在振荡器上振荡15s，室温静置20min后观察结果。 

红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++）。以100%凝集的病毒液最大稀释度为该病毒液的血凝价，即为一个凝集单位，或称一个血凝单位。 

3、蛋黄液的效价测定（HI试验) 

在96孔微量反应板上进行，每孔加25μL生理盐水；左侧第1孔加25μL蛋黄液，混合均匀后从第1孔吸25μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔（第11孔吸弃25μL）；每孔加入25μl四个血凝单位的病毒液，振荡30s，然后室温静置30min；每孔加入25μl1％鸡红细胞悬液，震荡15s，室温静置20min后观察结果。 

以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检蛋黄液的最大稀释度为该蛋黄液的血凝抑制效价，即HI效价。 

从步骤一得到的蛋黄液中随机取20个鸡蛋的蛋黄液进行上述效价测定，18个鸡蛋的蛋黄液对三种病毒的HI效价均为1024以上。 

从步骤二得到的蛋黄液中随机取20个鸡蛋的蛋黄液进行上述效价测定，6个鸡蛋的蛋黄液对三种病毒的HI效价均为1024以上。 

结果表明，雏鸡时期注射鸡干扰素α，可以显著增加免疫三联灭活苗后得到具有高HI效价的蛋黄液的鸡蛋的概率。 

实施例2、卵黄抗体的制备 

1、取实施例1的步骤一制备得到的且按实施例1的步骤三的方法测定对三种病毒的HI效价为1024以上的蛋黄液，与等体积蒸馏水混合，650rpm振荡10min，然后在密封状态下65℃静置10分钟，迅速冷却至10℃，然后与蒸馏水以1:4的体积比混合，用1M HCl水溶液调pH至5.2，4℃静置6小时，然后5000rpm离心20分钟，取上清液。 

2、将等体积的饱和硫酸铵水溶液缓慢加入步骤1得到的上清液中（边加边搅拌），然后4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀。 

3、用3质量份蒸馏水溶解1质量份步骤2得到的沉淀，然后加入正辛酸使其在体系中的体积浓度为1‰，搅拌均匀。 

4、将1体积份饱和硫酸铵水溶液缓慢加入2体积份步骤3得到溶液中，边加边搅拌，然后4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀。 

5、用3质量份无菌、pH7.2、0.01M的PBS缓冲液溶解1质量份步骤4得到的沉淀。 

6、将1000毫升步骤5得到的溶液用100Ku超滤膜包（截留量为100ku，柱子的全称为中空纤维超滤柱，购自的上海艾研生物科技有限公司）并按说明书进行除盐浓缩，得到100毫升浓缩液。 

7、将1体积份40%（体积比）甲醛水溶液逐滴加入399体积份步骤6得到的浓缩液中（边加边搅拌），然后在密封状态下室温静置2小时，然后依次用0.45微米、0.22微米和0.1微米的微孔滤膜逐级过滤，得到滤液，将滤液4℃保存备用。 

8、采用实施例1的步骤三的方法检测步骤7得到的滤液的HI效价，HI效价大于128的滤液即为制备得到的卵黄抗体。 

实施例3、卵黄抗体的应用 

一、卵黄抗体的应用 

取养鸡场中的10日龄病鸡，其中20只已经确诊发生鸡新城疫病（第一组），20只已经确认发生禽流感（第二组），20只已经确诊发生鸡传染性支气管炎（第三组），20只已经确诊同时发生鸡新城疫病、禽流感和鸡传染性支气管炎（第四组）。颈部皮下注射实施例2制备得到的卵黄抗体，每只鸡注射1.5毫升。注射卵黄抗体5天后，第一组的治愈率为95%，第二组的治愈率为95%，第三组的治愈率为100%，第四组的治愈率为95%。 

二、卵黄抗体的应用 

在北京多个养鸡场进行应用，如果该养鸡场中有一只鸡发生了鸡新城疫病和/或禽流感和/或鸡传染性支气管炎，该饲养场即为发病饲养场，对其中与发病鸡处于同一饲养场中的所有5-20日龄鸡进行单次免疫，即每只鸡注射颈部皮下注射1.5毫升实施例2制备得到的卵黄抗体，10天后统计所有免疫卵黄抗体的鸡中鸡新城疫病和/或禽流感和/或鸡传染性支气管炎的发病率。结果见表1。 

表1各饲养场使用卵黄抗体情况统计 

日期 养鸡场编号 使用卵黄抗体的鸡只数 鸡只日龄 发病率 2013.04.15 SYC001 3000 13 2% 2013.04.20 SYC002 6000 8 2% 2013.05.05 SYC003 2500 9 0% 2013.05.25 SYC004 3000 10 2% 2013.05.27 SYC005 2700 11 2% 2013.06.04 SYC006 4300 12 2% 2013.06.08 SYC007 2000 6 0% 2013.06.10 SYC008 5000 10 2% 2013.06.20 SYC009 2300 5 0%