鉴定儿茶酚O-甲基转移酶调节剂的方法

摘要

本发明涉及用于鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)酶活性的调节剂的方法。

说明书

本发明涉及鉴定儿茶酚O-甲基转移酶的酶活性的调节剂的方法

儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)催化具有儿茶酚部分的底物的O-甲 基化。被COMT甲基化中的甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。COMT 在内源性儿茶酚胺神经递质、儿茶酚雌激素和异生分子的分解代谢中起重 要作用。COMT的抑制是开发帕金森症的新治疗方法的重要途径。

W.F.Herblin(Analytical Biochemistry51，19-22，1973)描述了用于 COMT活性的比色测定。该测定使用硝基儿茶酚作为COMT的甲基受体。 在酸性pH下，硝基儿茶酚在水中以黄色溶液形式存在，最大吸收在350nm 处。在微碱性pH下，对位羟基的电离使溶液变为橙色(λmax＝430nm)。 在较强的碱中，间位羟基的电离导致樱桃红色溶液(λmax＝520nm)。 测定基于观测到硝基儿茶酚被COMT甲基化，并且甲基化的硝基儿茶酚 不再表现出由于第二次电离导致的樱桃红色。在此测定中底物(硝基儿茶 酚)和SASM必须在μM浓度范围内，所述范围处于或高于限制灵敏度的 K_m。

G.Zürcher和M.Da Prada(Journal of Neurochemistry，Vol.38，No.1， 1982)描述了COMT活性的单步放射化学测定。在此测定中，通过将 COMT与[³H]甲基SAM、Mg²⁺和腺苷脱氨基酶孵育，儿茶酚被转化为氚 化的愈创木酚，它是具有非常低极性的化合物。用低极性介质例如甲苯提 取愈创木酚，并用闪烁计数器计数。

由于有限的灵敏度(比色测定)或由于测定设置(放射化学测定中的 提取步骤)，上述测定不适于自动化筛选大量的化合物的COMT调节剂 活性。

因此，存在对适于筛选大量化合物的COMT调节活性的灵敏、均质 的测定方法的需求。

在第一个目的中，本发明提供鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)活 性的调节剂的方法，包括以下步骤：

a)提供与荧光染料共价连接的COMT底物，

b)将步骤a)的分子与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)、S- 腺苷甲硫氨酸(SAM)和候选化合物接触，和

c)测量步骤b)的混合物的荧光读数，其中在候选化合物存 在下较之空白改变的荧光读数指示为儿茶酚O-甲基转移酶 (COMT)的调节剂。

在优选的实施方式中，方法是用于鉴定COMT抑制剂的方法，其中 步骤c)中较之空白降低的荧光读数指示为COMT抑制剂。

在另外优选的实施方式中COMT底物是4-硝基儿茶酚。

在另外优选的实施方式中荧光染料是Alexa488。

在另外优选的实施方式中步骤c)中的荧光读数是动力学读数。

在另外优选的实施方式中COMT是人COMT。

在另外优选的实施方式中方法是高通量筛选方法。

在另外优选的实施方式中方法在微量滴定板中进行。

在另外优选的实施方式中COMT的终浓度是约25nM。

在另外优选的实施方式中COMT底物的终浓度是约200nM。

在另外优选的实施方式中SAM的终浓度是约500nM。

在第二个目的中，本发明提供鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的 底物方法，包括以下步骤：

a)提供包含与荧光染料共价连接的COMT底物和S-腺苷甲 硫氨酸(SAM)的混合物，

b)将步骤a)的混合物与不同浓度的候选化合物接触，

c)将步骤b)的混合物与儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)接 触，和

d)测量步骤c)的混合物的动力学荧光读数，其中降低的荧 光读数稳定水平作为增加的候选化合物浓度的函数指示为 儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物。

在优选的实施方式中COMT底物是4-硝基儿茶酚。

在另外优选的实施方式中荧光染料是Alexa488。

附图简述

图1显示了与4-硝基儿茶酚共价偶联的Alexa488的化学结构；

图2显示了硝基儿茶酚(蓝色)、2-甲氧基-5-硝基苯酚(红色)和1，2- 二甲氧基-4-硝基苯(绿色)的Stern Volmer曲线；将20nM游离Alexa Fluor  488分别与高至25mM浓度的硝基儿茶酚、2-甲氧基-5-硝基苯酚和1，2-二 甲氧基-4-硝基苯混合。仅对于硝基儿茶酚观察到了Alexa488荧光 强度(1₀/I)的变化，甲基化产物不影响Alexa488的荧光强度。

图3显示了在本发明的荧光测定中，COMT催化的Alexa488- 硝基儿茶酚的甲基化的酶动力学；

图4a显示了在多种浓度的COMT抑制剂托卡朋(Tolcapone)存在下， 荧光强度的变化的动力学测量；

图4b显示了从图3a的动力学测量的斜率计算的托卡朋的剂量应答曲 线；

图5显示了在COMT的天然底物多巴胺存在下的荧光测定。随着增 加的多巴胺浓度，达到降低的稳定水平。由于多巴胺是底物，它和Alexa 488-硝基儿茶酚底物被甲基化。SAM的可获得性被限制(500nM)， 使得在高多巴胺浓度下，Alexa488-硝基儿茶酚底物不再能够被完 全甲基化。

图6显示了低(500nM)和高(200μM)SAM浓度下，以及对每个 SAM浓度在加入Alexa488-硝基儿茶酚底物前有和没有预孵育化 合物和SAM1小时的底物的剂量应答曲线。与低SAM的预孵育将剂量应 答曲线移动至较低的IC₅₀因为化合物耗尽了SAM。在高SAM浓度下，有 和没有预孵育之间没有差别，因为SAM不限制，并且与低SAM相比，剂 量应答曲线移动至较高IC₅₀，因为化合物被耗尽。

图7显示了低(500nM)和高(200μM)SAM浓度下，有和没有预 孵育化合物与SAM1小时的SAM竞争化合物的剂量应答曲线。对于SAM 竞争化合物，在每个SAM浓度，有和没有预孵育不影响IC₅₀，但在高SAM 浓度，IC₅₀移动至较大值。

发明详述

本发明的测定基于这样的发现，即共价偶联至COMT底物的荧光染 料(例如共价偶联至硝基儿茶酚的Alexa488)由于分子内淬灭，表 现出降低的荧光，以及COMT底物-荧光染料复合物中COMT底物被 COMT甲基化消除了荧光的淬灭，即较之未甲基化的复合物，COMT底 物-荧光染料复合物中COMT底物的甲基化导致荧光增加。

术语“COMT”在本文中用于指来自任何动物例如哺乳动物物种，包 括人类的天然序列COMT，和COMT变体(在下文中进一步限定)。COMT 多肽可从多种来源，包括人组织类型分离，或通过重组和/或合成方法制备。

此测定中能够使用天然或重组生产的COMT。“重组蛋白质”是依靠 在异源细胞中表达，分离、纯化或鉴定的蛋白质，所述细胞已经用改造为 驱动蛋白质在宿主细胞中表达的重组表达载体瞬时或稳定地转化或转染。 能够在原核细胞(例如大肠杆菌)、酵母(例如粟酒裂殖酵母)或真核细 胞(例如HEK293、Sf9昆虫细胞)中生产重组COMT。优选地，Sf9昆 虫细胞被用于重组COMT的高表达。用于测定的COMT可为纯化的。如 本文所用的术语“纯化的”指从其天然环境或重组生产源移出的、分离的 或分开的多肽，并且至少60％，更优选地至少80％不含与其天然缔合的其 它组分，例如膜和微粒体。

“天然序列COMT”指与天然存在的COMT多肽具有相同氨基酸序 列的多肽，无论其制备方式。天然序列COMT可从自然界分离，或通过 重组和/或合成方法制备。术语“天然序列COMT”特别涵盖COMT的天 然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式) 和天然存在的等位基因变体。人COMT多肽在NCBI数据库中的标识符 是AAA68927(Seq.Id.No.1)。

术语“COMT变体”指天然序列COMT的氨基酸序列变体，在天然 序列中含有一个或多个氨基酸替换和/或缺失和/或插入。氨基酸序列变体通 常与天然序列COMT的氨基酸序列具有至少约75％，优选地至少约80％， 更优选地至少约85％，甚至更优选地至少约90％，最优选地至少约95％ 的序列同一性。

术语“化合物”在本文中用于关于本发明的测定描述的上下文“测试 化合物”或“药物候选化合物”。同样地，这些化合物包含源自合成的或 从天然来源得到的有机或无机化合物。化合物包括特征为相对低分子量的 无机和有机化合物，例如多核苷酸、脂类或激素类似物。其他生物聚合有 机测试化合物包括包含从约2至约40个氨基酸的多肽和包含从约40至约 500个氨基酸的较大的多肽，例如抗体或抗体缀合物。

术语“动力学读数”指在酶促反应线性部分中的某两个时间点处测量 的荧光信号的差异。一次测量在酶促反应开始时进行(起点)，并在孵育 时间后进行第二次读数(终点)。然后以rfu/min计算最终信号为(rfu(终 点)-rfu(起点))/孵育时间。(rfu：相对荧光单位)。

本发明的方法可用于鉴定抑制酶儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的化 合物。因此，由本发明的方法鉴定的COMT抑制剂可用于其中COMT钝 化神经元外儿茶酚胺起作用的治疗、预防或控制疾病的方法，例如在预防 或控制抑郁中。在此情况下本发明的化合物可用作单独的化合物或与其他 有利地影响病程的治疗活性物质组合使用。本发明的化合物也可与其他治 疗活性物质共同用药。

本发明的方法可用于测定用测试化合物处理过的动物组织样品中 COMT的活性。例如，测定适于测定来自动物(例如小鼠和大鼠)的脑和 肝脏组织样品中的COMT活性，所述动物已经用测试化合物(COMT调 节剂)处理过。

实验部分

4-硝基儿茶酚-Alexa488的合成

将含有1％三乙胺的DMSO中的氨乙基-硝基-邻苯二酚的10mM溶液 [1]与含有1％三乙胺的DMSO中的Alexa488羧酸琥珀酰亚胺酯的 10mM溶液[2](Invitrogen Corporation，5791Van Allen Way，Carlsbad， California92008)以1∶1的化学计量比混合。将反应混合物在室温轻轻混 合过夜，在Explorer100反相HPLC上纯化。将产品冻干并重悬于 DMSO。

4-硝基儿茶酚-Alexa488

荧光测定方法

以下测定方法、试剂和材料用于本发明的实施例。实施例的结果在图 1-7描述。

微量滴定板：

384孔微量滴定板，Corning黑色透明平底，非结合性表面，聚苯乙烯 (ref.3655)

试剂和缓冲液储液：

●缓冲液储液：

-M磷酸盐缓冲液pH7.6(Na₂HPO₄Fluka71644，NaH₂PO₄Merck6346.0500)，储存于4℃。

-580mM MgCl₂(Merck1.0833.0250)，储存于室温。

-1M CaCl₂储存于4℃。

-65mM DTT(Sigma D-0632)，储存于-20℃。

●重组人COMT：室内制备，储存于-80℃。

●4-硝基儿茶酚-Alexa488：室内制备，1.3mM在DMSO 中，室温储存于暗处

●S-腺苷甲硫氨酸：10mM在H₂O中(Sigma-Aldirch A2804)， 储存于-20℃

试剂和缓冲溶液：

●测定缓冲液(终浓度)：

-40mM磷酸盐缓冲液pH7.6

-2.88mM MgCl₂

-0.9mM DTT

-0.25mM CaCl₂

●化合物稀释：在100％DMSO中(Sigma41640)稀释，最终测 定浓度6.25％DMSO

●重组人COMT：测定缓冲液中80nM，最终测定浓度25nM

●4-硝基儿茶酚-Alexa488：测定缓冲液中320nM，最终测 定浓度200nM

●S-腺苷甲硫氨酸：测定缓冲液中800nM，最终测定浓度500nM 测定方法

10μl hCOMT(人COMT)

2μl测试化合物

摇床上1min

20μl底物-SAM混合物

摇床上5min

读数：在板::视觉TM读数器上的动力学测量(exc.475(40)nm，em.535 (45)nm，强度7.5％，曝光时间1s)。