在液/液界面上构建离子通道的方法及该离子通道的大小对离子转移的影响的检测方法

摘要

本发明公开了一种在液/液界面上构建K+离子通道的方法，包括如下步骤，1）制备氧化铝模板；2）将制备好的氧化铝模板用导电胶固定在已打磨光滑的塑料管上；用三岔管作为电解池，先加入有机相，再向固定有氧化铝模板的塑料管中加入氯化钾溶液，将其置于三岔管主管处，氧化铝模板则正好处于两互不相溶溶液的界面处，形成液/液界面的离子通道。本发明方法可用于模拟生物膜以及研究离子穿过离子通道的动态过程。此法在研究离子转移，认识、理解、掌握许多重要的生理过程，揭示生物体内物质和能量的代谢过程具有重要的意义，为模拟生物系统中离子构建了平台。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在两互不相溶界面处构建离子通道的方法，及该离子通道的大小对离子转移的影响的检测方法。

背景技术

在生命科学的研究中，细胞膜上离子通道的研究占有十分重要的地位。它是一类膜受体,其分子结构相近，拥有特异药物结合位点，在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。离子通道是Hodgkin和Huxley于1952年首次提出的，随后，大量研究集中于对离子通道的结构与功能的研究，2003年Rod Mackinnon开创性地发现了钾离子通道结构。随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术，包括膜片钳技术、分子克隆及基因突变技术等得以广泛应用，人们已开始从分子水平上来解释离子通道的孔道特征、动力学过程、结构与功能的关系以及功能的表达和调节等，从而可以探讨作用于离子通道药物的作用机理，使离子通道的研究，尤其是对离子通道的分子结构和功能的研究成为分子药理学研究的重要内容之一。

扫描电化学显微镜（SECM）是80年代末由著名的电分析化学家Bard为首的研究小组在超微电极和扫描隧道显微镜（STM）的基础上发展起来的一种电化学现场检测新技术，其分辨率（几十纳米）介于普通光学显微镜与STM间。SECM具有多种不同的操作模式，产生/收集模式、穿透模式、电流反馈模式等。用玻璃微米管作为探头，离子转移过程也可用SECM的反馈模式来实现，并可以对其热力学和动力学过程进行研究。这些研究对认识液/液界面结构及界面离子转移机理具有重要意义，并为生物学上和药理学上提供了一些有用信息。

上述这种从生物技术方面研究离子通道的构建方法装置上很复杂，操作起也非常繁琐，离子通道的分子结构和功能的研究不能进一步开拓。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种操作简单的在液/液界面上构建离子通道的方法；

本发明的另一目的是提供上述离子通道的大小对离子转移影响的检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种在液/液界面上构建离子通道的方法，包括如下步骤，

1）制备氧化铝模板

用两步氧化法制作氧化电位为40V的氧化铝模板，然后将其浸泡在5wt%的磷酸溶液中浸泡，形成多孔阳极氧化铝模板（AAO），通过改变浸泡时间得到不同孔径的氧化铝模板；

2）在液/液界面上修饰离子通道

a.将制备好的氧化铝模板用导电胶固定在已打磨光滑的塑料管上; 

b.用三岔管作为电解池，先加入有机相，再向固定有氧化铝模板的塑料管中加入氯化钾溶液，将其置于三岔管主管处，氧化铝模板则正好处于两互不相溶溶液的界面处，形成液/液界面的离子通道。

上述液/液界面离子通道的大小对离子转移的影响的检测方法，包括如下步骤，

1）离子通过不同孔径的离子通道的转移伏安曲线的形成

在扫描电化学显微镜（SECM）中，以铂电极为工作电极、与参比电极和对电极构建三电极体系，通过改变不同孔径的氧化铝模板，得到水相中K⁺离子通过不同孔径的离子通道的转移伏安曲线；

2）离子通过不同孔径离子通道的反馈曲线的形成

a.微电极的制备

以玻璃毛细管为原料，使用微电极拉制仪拉制，通过控制拉制仪的参数，制得管口平且针尖半径为几到几微米的玻璃管；

b.工作电极的形成

用微量进样器向微电极注入氯化钾溶液作为扫描电化学显微镜的探针作为工作电极。

c.向三岔管加入浓度相同的氯化钾溶液，再在固定有氯化铝模板的塑料管中加入有机相，将其置于三岔管主管处，在扫描电化学显微镜上，给工作电极施加电势，随着工作电极逐渐靠近界面（ITIES），检测电流变化，得到电流随距离变化的反馈曲线，通过改变不同孔径的氧化铝模板，得到水相中阳离子通过不同孔径离子通道的反馈曲线。

上述两方案中所述的有机相均为含有0.5×10-3mol/L萘并十五冠五和0.01mol/L四苯硼酸四丁基铵的1,2-二氯乙烷溶液，所述氯化钾溶液的浓度均为0.1-1M，最佳为0.5 M。

上述的液/液界面离子通道的大小对离子转移的影响的检测方法，所述步骤3）中对工作电极施加电势选择0.55V最佳。

本发明原理说明：

图1是在SECM模式下，在构建的模拟界面上离子穿过离子通道从水相向有机相转移的过程。冠醚是一类大环多醚类化合物，它们能与碱金属、碱土金属离子及个别非金属离子形成稳定的、能溶解于有机溶剂的络合物，使离子在界面转移Gibbs自由能降低，而钾离子是人体内不可缺少的常量元素，它对维持神经、肌肉的正常功能具有重要作用。并且钾离子在生物体内的运输主要是通过离子通道。所以本发明有机相采用萘并十五冠五为离子载体，多孔的氧化铝模板来模拟离子通道研究钾离子的跨膜运输。

离子的传递是由于细胞膜内外的浓度差和细胞膜的通透性引起的，尤其是钾离子运输必须经过离子通道。在本实验中我们使用的修饰液液界面的膜是高度有序的多孔氧化铝模板，这些纳米孔径是紧密的，这样使离子可以完全通过这些孔径而不是从其它地方通过。

根据电解池Ⅰ，使用SECM对该反应机理进行推测

                                                            电解池

本发明钾离子穿过离子通道转移的具体过程如下：

第一过程是碱金属离子在N15C5的诱导下在探针尖端处由水相转移到有机相，这一过程可以理解为界面上的络合反应(TIC)，即：

                (at the tip)

第二个过程是界面上的分离过程(TID):

            (at the ITIES)

当探针尖端接近ITIES时，金属离子从络合物中释放出来，然后穿过氧化铝模板的孔道进入水相，此时N15C5就不带电荷，显中性，进入有机相。

 

多孔阳极氧化铝(AAO) 模板具有规则排列的六角形孔洞结构,且孔洞直径可控生长在20～200nm的范围内,模板厚度也可控制在1～10μm之间,孔密度为109～1012个/cm² ,AAO模板的孔洞孔径大小一致、排列有序、分布均匀,可用于合成零维纳米材料、一维纳米材料(纳米线,纳米管)，也是很好的模拟离子通道的模型。

本发明有益效果：

本发明通过设计一种新型的仿生物膜模型，研究了阳离子通过离子通道的转移过程。这种新型的仿生物膜模型对于认识和研究生命过程中阳离子跨膜转移机理有重大意义。结合实验结果表明，界面在修饰了用来模拟离子通道的氧化铝模板时，钾离子能够穿过离子通道从水相转移到有机相，并且在距离与电流的反馈模式下，得到典型的正反馈曲线。本发明方法可用于模拟生物膜以及研究离子穿过离子通道的动态过程。此法在研究离子转移，认识、理解、掌握许多重要的生理过程，揭示生物体内物质和能量的代谢过程具有重要的意义，为模拟生物系统中离子构建了平台。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图 1 是本发明SECM模式下的钾离子通过离子通道从水相转移到有机相的示意图。

图 2 是本发明SECM模式下的电极装置示意图。

图 3 是氧化电位为40V时制作的氧化铝模板的SEM图。

图 4 本发明K⁺通过不同孔径的氧化铝模板转移的循环伏安图。

图 5 本发明SECM模式下K⁺穿过离子通道的反馈曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实验所用的仪器和试剂

CHI900电化学工作站（购自美国CHI公司），本实验中微管支撑的电极作为扫描电化学显微镜的探针，工作电极为直径为 2mm 铂电极（上海辰华仪器公司），铂丝为对电极(直径为0.5mm)，Ag/AgTPB 为参比电极。SZ-93 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），BT25S电子天平（德国SAREORIUS）,微电极拉制仪（实验室自制）。

1，2-二氯乙烷（DCE），氯化四甲基铵（TMACl），氯化铁（FeCl₃），氯化亚铁（FeCl₂），氯化钾（KCl），均购自北京化工厂。四苯硼酸四丁基铵（TBATPB）,购自Aldrich公司，萘并十五冠五（N15C5）实验室自制。 三氧化二铝打磨粉（0.30mm，0.05mm，上海辰华仪器试剂公司）。

实验过程

1、三岔管玻璃池的预处理

依次使用丙酮、二次蒸馏水超声处理电解池各15min，再用二次蒸馏水冲洗，氮气吹干备用。

2、工作电极的处理

本实验微滴法所用的工作电极为直径为2mm铂电极，每次实验之前分别用0.30 mm和 0.05 mm的三氧化二铝打磨粉在打磨布上打磨电极，然后用二次蒸馏水将尖端冲洗干净。

3、微米管电极的制备

以玻璃毛细管(o.d. = 2.0 mm, i.d. = 1.16 mm, L= 10 cm)为原料，使用微电极拉制仪（实验室自制）拉制。适当控制拉制仪的参数，拉出管口较平且针尖半径为几到几十微米的玻璃管。针尖的半径与管壁的厚度用光学显微镜估算，使用微量进样器从玻璃管尾部注入水相溶液。

4、萘并十五冠五（N15C5）的制备

在氮气保护下，将5.0g 2,3-二羟基萘，3.0g氢氧化钠和80 ml DMSO 的混合物搅拌10 min，溶液变为棕色，升温至约130℃，加入8.0g四甘醇二氯代物(溶于30 ml DMSO, 8 min滴完)。将温度控制在125～128℃范围内，在搅拌下反应8h后，冷至室温，抽滤。减压下蒸出溶剂，用氯仿萃取残余物。萃取液依次用水、2% NaOH 水溶液、盐水洗涤，分出氯仿层，用无水硫酸镁干燥后抽滤。减压下蒸出氯仿，得棕色粘稠物，在正庚烷中多次回流萃取，冷却结晶，重结晶，得 4.0g 白色晶体，产率40%。

5、不同孔径的氧化铝模板的制备

首先，用两步氧化法制作氧化电位为40V时的氧化铝模板，然后将其放入5t%的磷酸溶液中浸泡，通过改变浸泡时间可以得到不同孔径的氧化铝模板。本实验采用的浸泡时间分别为10min, 20min, 30min, 40min。

6、液/液界面上修饰离子通道的方法

取一粗细适当，长度大约为1cm透明塑料管，将塑料管的一端用砂纸打磨光滑，用二次蒸馏水冲洗干净，并在此端涂抹导电胶，然后用此导电胶将氧化铝模板固定在塑料管上。

7、采用三岔管作为电解池，先加入有机相（含有0.5×10^-3mol/L萘并十五冠五和0.01mol/L四苯硼酸四丁基铵的1,2-二氯乙烷溶液）再向固定有氧化铝模板的塑料管中加入氯化钾溶液，将其置于三岔管主管处，氧化铝模板则正好处于两互不相溶溶液的界面处将。将已处理好的2mm铂电极与参比电极和对电极构建三电极体系。电化学实验在CHI900电化学工作站上进行。通过改变不同孔径的氧化铝模板，得到了K⁺通过不同孔径的离子通道的转移伏安曲线。

8、用微量进样器从已拉好的微电极的尾部注入水相溶液作为扫描电化学显微镜的探针（即工作电极），向三岔管加入相同浓度的氯化钾溶液，再在固定有氧化铝模板的塑料管中加入有机相，将其置于三岔管主管处。将探针插入塑料管中，在扫描电化学显微镜上，给工作电极施加0.55V电势，随着工作电极逐渐靠近界面，检测电流变化，得到电流随距离变化的反馈曲线。改变不同孔径时，分别得到了K⁺通过不同孔径的离子通道的反馈曲线。

图4是萘并15冠5加速钾离子通过不同孔径的离子通道从水相向有机相转移的循环伏安图。氧化电位为40V时制作的氧化铝模板在5t%的磷酸溶液中浸泡的时间分别为10min, 20min, 30min, 40min,得到了孔径不同的模板。从图中可以看出，随着浸泡时间的增大（即孔径越大），钾离子通过离子通道转移的峰电流就越大。钾离子在氧化铝模板中的运输可以分为两部分：受限扩散和自由扩散。当孔径增大时，自由扩散占整个孔径的横截面的比例增大，受限扩散的比例会减小。所以钾离子穿过通道的速度会增大，从而导致峰电流的增加。

图5为萘并15冠5加速钾离子通过不同孔径的离子通道从水相向有机相转移的距离-电流的反馈曲线，坐标L为归一化距离，L=d/a，其中，d为两电极之间的距离、a为微电极的半径（12.5μm），点线为实验曲线，实线为理论拟合曲线。从图中可以看出实验与理论结果比较符合。从四条曲线可看出，这些曲线都是经典的正反馈曲线，说明了在离子通道存在的情况下，钾离子发生了异相离子转移反应。

 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。